המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הוראה כיצד למדוד את היכולת של נוגדנים הנוכחי סרה או פלזמה של אנשים, באופן טבעי חשוף Plasmodium זיהום falciparum, כדי opsonize ו לגרום phagocytosis של אריתרוציטים נגועים טפילים (IEs).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפרוטוקול מתאר כיצד להגדיר ולהפעיל זרימה ציטומטריה מבוססי phagocytosis אסייג של Plasmodium falciparum-נגוע אריתרוציטים (IEs) opsonized על ידי נוגדנים IgG שנרכשו באופן טבעי ספציפי עבור VAR2CSA. VAR2CSA הוא אנטיגן טפיל המתווכת את ההפרדה הסלקטיבית של IEs שליה שיכול לגרום לצורה חמורה של מלריה בנשים בהריון, הנקרא מלריה שליה (PM). הגנה מפני PM מתווך על ידי נוגדנים ספציפיים VAR2CSA כי הם האמינו לתפקד על ידי עיכוב ההשתה שליה ו / או על ידי opsonizing IEs עבור phagocytosis. ה-assay משתמש IEs בשלב מאוחר מסונכרן in vitro שנבחרו במבחנה לבטא VAR2CSA, פלזמה / סרום-נוגדנים מנשים עם חסינות ספציפית PM שנרכש באופן טבעי, ואת קו התא הפוגוציצי THP-1. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לומר את הפונקציונליות של נוגדנים לכל אנטיגן טפיל קיים על פני השטח IE, אם מושרה על ידי חשיפה טבעית או על ידי חיסון. ההסכם מציע הערכה פשוטה ותפוקה גבוהה, עם רבייה טובה, של היבט תפקודי חשוב של חסינות בתיווך נוגדנים במלריה. זה, לכן, שימושי בעת הערכת חסינות קלינית P. falciparum מלריה, גורם מרכזי של תלודים ותמותה באזורים הטרופיים, במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה.
מבוא
מלריה היא מחלה הנישנת על ידי וקטור הנגרמת בבני אדם על זיהום עם חמישה מינים שונים של סוג Plasmodium. המינים הנפוצים ביותר הם P. falciparum, שאחראי גם על התפלואה והתמותה הגבוהותביותר 1. מצגת קלינית מלריה משתנה מזיהומים א-תסמינים או שפירים למחלה מסובכת/חמורה, האחרונה מתרחשת בעיקר בילדים מתחת לגיל חמש שנים. חשיפה P. falciparum אינה לגרום חסינות סטרילית, אבל אנשים החיים באזורים אנדמיים לאט לפתח חסינות מפני המחלה הקלינית. הגנה היא גיל / חשיפה תלויה חסינות נרכשת בדרך כלל במהלך 5-10 השנים הראשונות שלהחיים 2. נשים בוגרות הן יוצא מן הכלל חשוב, כמו מלריה חמורה יכולה להתרחש במהלך ההריון במצגת קלינית המכונה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגימות הנסיוב האנושי המשמשות לתוצאות המוצגות כאן נאספו במחקר נפרד19. האוסף אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של מכון נוגוצ'י למחקר רפואי, אוניברסיטת גאנה (מחקר 038/10-11), ועל ידי ועדות האתיקה של המחקר האזורי, אזור הבירה של דנמרק (פרוטוקול H-4-2013-083).
1. תרבות טפילים
הערה: בצע את התקנות המקומיות לטיפול בפתוגנים אנושיים.
- שמור על טפילי P. falciparum על פי הפרוטוקול הסטנדרטי כמתוארלפני 20 במדיום תרבות טפילים (ראה טבלת חומרים).
- שמור את הטפילים מסונכרנים היטב באמצעות טיפול סורביטול כפי שתואר קודםלכן 21
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן אנו מציגים בפירוט פרוטוקול שתואר בעבר31 והשתמש 11 ,12,13,14,15,15,16,17,18 כדי למדוד את הקיבולת של נוגדנים מיקוד פני השטח של P. falciparum IEs כדי לגרום opsonization ו phagocytosis על ידי תאי THP-1.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול שהוצג כאן תואר בעבר ונעשה בושימוש 12,15,17,31 כדילמדוד את הקיבולת של נוגדנים מיקוד פני השטח של P. falciparum IEs כדי לגרום opsonization ו phagocytosis על ידי תאי THP-1.15 התוצאות המוצגות כאן מתמקדות בתרופות נוגדנים ספציפיות ל-VAR2CSA שנרכשו באופן טבעי בפלזמה/סרום של נשים המתגוררות באזור אנדמי P. falciparum. VAR2CSA הוא סוג של PfEMP1 המעורב בהפליה של IEs, וקובע מפתח ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לסופרים אין מה לחשוף.
תודות
Maiken Visti הוא הודה על סיוע טכני מעולה. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק (MAVARECA II; 17-02-KU) ממשרד החוץ של דנמרק ומנוהלת על ידי מרכז המעבדות דנידה. ל-funder לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 96 צלחות תרבית תאים באר, תחתית עגולה עם מכסה | קורנינג | 3799 | ניתן להשתמש בכל צלחת דומה, ודא שהיא תואמת למכשיר ציטומטר הזרימה שבו אתה מתכוון להשתמש |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2 גרם/ליטר היפוקסנטין (Sigma, H9377) ב-RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| תאי דם אנטי-אדומים נוגדן | Abcam | ab34858 | הכן 2μ l aliquots והקפיא a -20°C. השתמש ב-aliquot אחד לכל ניסוי. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads חלבון G | Invitrogen | 10003D | |
| תמיסת אתידיום ברומיד | Sigma | E1510 | הכן תמיסת מלאי ב-0.1 מ"ג/מ"ל תוך RPMI1640 (R5886). חנות מוגנת מפני אור |
| ציטומטר זרימה FC500 | בקמן קולטר | ניתן להשתמש בכל ציטומטר זרימה התומך בפורמט צלחת 96 באר ובעל לייזרים/מסננים מתאימים למדידת פלואורסצנטיות EtBr. | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Gibco | 10099-141 | יש לנטרל את החום לפני השימוש. |
| עכבר FITC אנטי אנושי CD16 | BD Biosciences | 555406 או 556618 | |
| עכבר FITC אנטי אנושי CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| עכבר FITC אנטי אנושי CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| תוכנת FlowLogic | Inivai | ניתן להשתמש בכל ניתוח ציטומטריית זרימה, למשל FlowJo או Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-גלוטמין (200 מ"מ) | Sigma | G7513 | |
| תמיסת ליזינג | - | 15 מ"מ NH4Cl, 10 מ"מ NaHCO3, 1 מ"מ EDTA | |
| MACS CS-עמודה ואביזרים | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| מדיום תרבית טפילים | - | - | 2 מ"מ L-גלוטמין (סיגמא, G7513), 50 ומיקרו; גרם/מ"ל גנטמיצין (סיגמא, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) ב-RPMI1640 (סיגמא, R5886) |
| פניצילין/סטרפטומיצין (10000U ו-10 מ"ג/מ"ל) | סיגמא | P0781 | |
| RPMI-1640 בינוני | סיגמא | R5886 | |
| מדיום תרבית THP-1 | - | 10% FBS (Gibco, 10099-141), 2 מ"מ L-גלוטמין (סיגמא, G7513), 100U/מ"ל פניצילין, 0.1 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין (סיגמא, P0781) ב-RPMI1640 (סיגמא, R5886) | |
| מגנט Vario MACS | Miltenyi Biotec |
מקורות
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
