מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגישות דיסוציאציה של רקמות ופירוק תאי, המאפשרות העשרה של תאי אפיתל בני קיימא מאזורים פרוקסימליים ודיסטליים של הריאה האנושית. כאן גישות אלה מיושמות לניתוח פונקציונלי של תאי אב אפיתל ריאה באמצעות שימוש במודלים של תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית
במאמר זה
סיכום
תקציר
מודלים אורגנואידים של אפיתל משמשים ככלים חשובים לחקר הביולוגיה הבסיסית של מערכת איברים ולמידול מחלות. כאשר הם גדלים כאורגנואידים, תאי אב אפיתליאליים יכולים לחדש את עצמם וליצור צאצאים מתמיינים המציגים תפקודים תאיים דומים לאלה של עמיתיהם in vivo . כאן אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד אבות ספציפיים לאזור מריאה אנושית וליצירת תרביות אורגנואידיות תלת-ממדיות ככלי ניסיוני ואימות. אנו מגדירים אזורים פרוקסימליים ודיסטליים של הריאה במטרה לבודד תאי אב ספציפיים לאזור. השתמשנו בשילוב של דיסוציאציה אנזימטית ומכנית כדי לבודד את סך התאים מהריאה ומקנה הנשימה. לאחר מכן, תאי אב ספציפיים נותקו מתאי המקור הפרוקסימליים או הדיסטליים באמצעות מיון תאים פלואורסצנטיים הקשורים (FACS) בהתבסס על סמני פני שטח ספציפיים לסוג התא, כגון NGFR למיון תאי בסיס ו-HTII-280 למיון תאים מסוג II של alveolar. אבות בזלתיים או נאדיים מבודדים מסוג II שימשו ליצירת תרביות אורגנואידיות תלת-ממדיות. גם אבות דיסטליים וגם אבות פרוקסימליים יצרו אורגנואידים עם מושבה היוצרת יעילות של 9-13% באזור הדיסטלי ו-7-10% באזור פרוקסימלי כאשר הם מצופים 5000 תאים/באר ביום ה-30. אורגנואידים דיסטליים שמרו על תאים מסוג II מסוג HTII-280+ בתרבית ואילו אורגנואידים פרוקסימליים התמינו לתאים סיליים ומפרישים עד יום 30. תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות אלה יכולות לשמש ככלי ניסיוני לחקר הביולוגיה של התא של אפיתל ריאות ואינטראקציות מזנכימליות אפיתליאליות, כמו גם לפיתוח ואימות של אסטרטגיות טיפוליות המכוונות לתפקוד לקוי של אפיתל במחלה.
מבוא
ניתן לחלק באופן נרחב את המרחבים האוויריים של מערכת הנשימה האנושית לאזורים מוליכים ונשימה המתווכים הובלת גזים והחלפתם לאחר מכן על פני מחסום האפיתל-מיקרו-וסקולרי, בהתאמה. דרכי הנשימה המוליכות כוללות קנה הנשימה, ברונכי, ברונכיולים וברונכיולות סופניות, בעוד שמרחבי אוויר נשימתיים כוללים ברונכיולים נשימתיים, צינורות נאדיים ונאדיות. בטנת האפיתל של מרחבים אוויריים אלה משתנה בהרכב לאורך הציר הפרוקסימו-דיסטלי כדי להתאים לדרישות הייחודיות של כל אזור מובחן מבחינה פונקציונלית. האפיתל המדומה של דרכי הנשימה של דרכי הנשימה של קנה הנשימה-סימפונות מורכב משלושה סוגי תאים עיקריים, בסיסיים, מפרישים וציליים, בנוסף לסוגי התאים הפחות נפוצים כולל מברשת, נוירואנדוקרינית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
רקמת ריאה אנושית התקבלה מתורמי רקמות שנפטרו בהתאם להליכי הסכמה שפותחו על ידי המכון הבינלאומי לקידום הרפואה (IIAM) ואושרו על ידי מועצת הביקורת הפנימית של המרכז הרפואי סידרס-סיני.
1. עיבוד רקמות לבידוד תאי ריאה מאזורי קנה הנשימה-סימפונות או דרכי הנשימה/פרנכימל הקטנות (דרכי הנשימה הקטנות והנאדיות)
- הכן ועבד אוטומטית את כל מכשירי הנתיחה, כלי הזכוכית והפתרונות המתאימים יום אחד לפני בידוד התא.
- עם קבלת רקמת הריאה, לזהות ולהפריד את האזורים הפרוקסימליים והדיסטליים. קנה הנשימה והסמפונות נחשבים "פרוקסימליים". לצורך פרוטוקול זה, קנה הנשימה ו -2-3 הדורות הראשונים של הסימפונות מנותחים ומשמשים לבידוד של אפיתל דרכי הנשימה "פרוקסימלי". דר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מקור רקמת הריאה
קנה הנשימה והסמפונות החוץ-פולמונריים (איור 1A) שימשו כרקמה המקור לבידוד תאי אפיתל פרוקסימליים של דרכי הנשימה ולדור הבא של אורגנואידים פרוקסימליים. רקמת ריאה דיסטלית הכוללת גם פרנכימה וגם דרכי אוויר קטנות בקוטר של פחות מ-2 מ"מ (איור 1A) שימשו לבידוד של תאי אפיתל קטנים של דרכי הנשימה והאנוואולריים (אפיתל ריאה דיסטלי) וליצירת אורגנואידים קטנים של דרכי הנשימה או הנאדיות. דרכי הנשימה הפרוקסימליות המרופדות באפיתל פסאודו-סטראטרציה כו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי ריאה מרקמת ריאה אנושית לצורך ניתוח מולקולרי או תפקודי ומידול מחלות. אלמנטים קריטיים של שיטות כוללים את היכולת להשיג דיסוציאציה של רקמות עם שימור של אפיטופים על פני השטח, המאפשרים העשרה בתיווך נוגדנים של תאים מבודדים טריים, ואופטימיזציה של שיטות תרבית ליצירה יעילה של אורגנואידים אפיתל ספציפיים לאזור. אנו מתמקדים בהתאוששות ובהעשרה של תאי אב אפיתל המסוגלים ליצור אורגנואידים כאשר הם רקומבינציה עם תאי תמיכה סטרומליים בתרבית תלת-ממדית. אף על פי שלא הגדרנו את הקלונליות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מעריכים את התמיכה של Mizuno Takako עבור צביעת IFC ו- H ו- E, ונסה גרסיה עבור חיתוך רקמות ואניקה S Chandrasekaran על עזרה בהכנת כתב יד. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) וקונסורציום Celgene IDEAL.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בידוד | |||
| 10 מ"ל מזרקים סטריליים, Luer-Lok Tip | Fisher Scientific | BD 309646 | |
| 30 מ"ל מזרקים סטריליים, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| שקיות Biohazard | VWR | 89495-440 | |
| שקיות Biohazard | VWR | 89495-440 | |
| טבעת חיבור | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| כלי פטרי חד פעמיים | קורנינג/פלקון | 25373-187 | |
| משפך | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM כיתה מחקר | סיגמא אולדריץ' | 5401127001 | |
| מחט 16G | VWR | 305198 | |
| מחט 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µ m (מסננת תאים) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 ומיקרו; m (מסננת תאים) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 ומיקרו; m (מסננת תאים) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 ומיקרו; m (מסננת תאים) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 ומיקרו; m (מסננת תאים) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| סכיני גילוח | VWR | 55411-050 | |
| מאגר ליזה של תאי דם אדומים | eBioscience | 00-4333-57 | |
| ציוד' s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s מעבד | |||
| LS עמודות | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher Scientific | 15290018 | 2 מ"ל |
| EDTA (0.5 מ'), pH 8.0, RNase | Thermo fisher Scientific | AM9260G | 500µ l |
| סרום בקר עוברי | ג'מיני ביו-מוצרים | 100-106 | 10 מ"ל |
| HBSS תמיסת מלח מאוזנת של האנק 1X 500 מ"ל | VWR | 45000-456 | בקבוק 500 מ"ל |
| HEPES (1 מ') | תרמו פישר מדעי | 15630080 | 5 מ"ל |
| פניצילין-סטרפטומיצין-ניאומיצין (PSN) תערובת אנטיביוטיקה | תרמו פישר מדעי | 15640055 | 5 מ"ל |
| רשימה של נוגדנים ל-FACS | |||
| Alexa Fluor 647 אנטי-אנושי CD326 (EpCAM) נוגדן | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ סט חלקיקי בקרה שליליים | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, Human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µ l/ 107 סה"כ תאים |
| CD45 MicroBeads, | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µ l/ 107 סה"כ תאים |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC אנטי אנושי CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC אנטי אנושי CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC אנטי אנושי CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC אנטי עכבר נוגדן IgM | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| עכבר IgM אנטי אנושי HT2-280 | מרפסת ביוטק | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE אנטי אנושי CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| הרכב מדיומים של תרבית אורגנואידית | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI טכנולוגיות | תאי גזע | 5001 | |
| אפיתל דרכי נשימה קטנות גידול תאים בינוני | PromoCell | C-21170 | |
| מוסיף תרבית רקמות ThinCert, | גריינר סטרילי Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (מעכב ROCK) מלאי 100 מ"מ (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| מדיום בסיסי של עכבר: | |||
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 50 µ l |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher 11330032 מדעי | 50 מ"ל | |
| סרום בקר עוברי | ג'מיני ביו-פרודקטס | 100-106 | 5 מ"ל |
| אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS -G) (100X) | ThermoFisher Scientific | 41400045 | 500 ומיקרו; l |
| פניצילין-סטרפטומיצין-ניאומיצין (PSN) תערובת אנטיביוטיקה | תרמו פישר מדעי | 15640055 | 500 ומיקרו; l |
| SB431542 TGF-β מעכב מסלול (מלאי 100 מ"מ)תאי | גזע | 72234 | 5 ומיקרו; l |
| רשימת נוגדנים לתמיסת חשיפת אנטיגן אימונוהיסטוכימיה | |||
| וקטור | מבוסס חומצת לימון | H-3300 | 937 ומיקרו; l ב 100 מ"ל מים |
| היסטוג'ל | תרמו סיינטיפיק | HG-4000-012 | |
| נוגדנים | |||
| אנטי HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 נוגדן חד שבטי (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| מערכות מו"פ | של רחם אנושי/נוגדנים SCGB1A1 | MAB4218 | 1:300 |
| נוגדן עוף פוליקלונלי קרטין 5, מטוהר [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC נוגדן חד שבטי (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / פודופלנין נוגדן (שיבוט 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| עכבר מטוהר Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 נוגדן | סנטה קרוז ביוטכנולוגיות | sc-365964 | 1:300 |
| נוגדנים | |||
| חמור נגד ארנב lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC אנטי עכבר נוגדן IgM | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| עיזים נגד אוגר IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| נוגדן משני נספג IgG1 עז, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| נוגדן משני נגד עכבר IgG2a נספג צולב, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| נוגדן משני נגד עכבר IgG2a נספג צולב, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| נוגדן משני נגד עכבר עיזים IgG2b נספג צולב, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| חוצצים | |||
| תמיסת | 3% BSA, o.4% Triton-x100 ב-TBS (תמיסת מלח על בסיס Tris) | ||
| תמיסת | 3% BSA, ).1% Triton-X100 ב-TBS | ||
| תמיסת כביסה אימונוהיסטוכימית | TBS עם 0.1% טווין 20 |
מקורות
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
