הטרוגניות תוך-גידולית היא תכונה אינהרנטית של גידולים, כולל גליומות. פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל המשתמש בשילוב של חוצצים וצנטריפוגה הדרגתית כדי לבודד גרעינים בודדים מרקמות גליומה קפואות טריות למחקרי רצף גרעין יחיד ו- ATAC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד גרעינים מגידולים טריים במוח קפוא ל-RNA-seq חד-גרעיני ו-ATAC-seq
במאמר זה
סיכום
תקציר
גליומות מפוזרות למבוגרים מציגות הטרוגניות בין-גידולית. עד לאחרונה, רוב מאמצי הפרופיל המולקולרי בקנה מידה גדול התמקדו בגישות בתפזורת שהובילו לסיווג המולקולרי של גידולים במוח. במהלך חמש השנים האחרונות, גישות רצף תאים בודדים הדגישו כמה תכונות חשובות של gliomas. רוב המחקרים הללו השתמשו בדגימות גידול במוח טרי כדי לבודד תאים בודדים באמצעות ציטומטריית זרימה או שיטות הפרדה מבוססות נוגדנים. במבט קדימה, השימוש בדגימות רקמות קפואות טריות מביו-בנקים יספק גמישות רבה יותר ליישומי תאים בודדים. יתר על כן, ככל שהשדה של התא הבודד מתקדם, האתגר הבא יהיה ליצור נתונים מרובי אומיקה מתא בודד או מאותה הכנה לדוגמה כדי לפענח טוב יותר את מורכבות הגידול. לכן, פרוטוקולים פשוטים וגמישים המאפשרים יצירת נתונים עבור שיטות שונות כגון רצף RNA חד-גרעין (snRNA-seq) וגרעין יחיד Assay עבור Chromatin נגיש Transposase עם רצף תפוקה גבוהה (snATAC-seq) יהיה חשוב עבור התחום.
ההתקדמות האחרונה בתחום התא הבודד בשילוב עם מכשירים מיקרופלואידיים נגישים כגון פלטפורמת הגנומיה 10x הקלו על יישומי תאים בודדים במעבדות מחקר. כדי לחקור את ההטרוגניות של גידול במוח, פיתחנו פרוטוקול משופר לבידוד גרעינים בודדים מגליומות קפואות טריות. פרוטוקול זה ממזג פרוטוקולים קיימים של תא בודד ומשלב שלב הומוגניזציה ואחריו סינון וצנטריפוגה הדרגתית בתיווך מאגר. הדגימות המתקבלות הן השעיות גרעין יחיד טהור שניתן להשתמש בהם כדי ליצור ביטוי גן גרעין יחיד נתוני נגישות כרומטין מאותה הכנת גרעין.
מבוא
גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה יותר (LGG), הגידול המוחי העיקרי הנפוץ ביותר במבוגרים, הן גידולים חודרניים המתעוררים לעתים קרובות בחצי הכדור המוחי. LGGs מפגינים הטרוגניות בין-גידולית, המונעת לא רק על ידי אוכלוסיית הגידול אלא גם על ידי התאים הלא ממאירים המעורבים באופן מורכב בהתפתחות הגידול ובהתקדמות1,2,3,4,5.
בעשור האחרון, יש מפולת של נתונים גנומיים שנאספו בתחום גליומות. נתונים אלה מגיעים בעיקר ממחקרי ריצוף גידול בתפזורת ותרמו רבות לאפיון המולקולרי, והסיווג הנוכחי של גידולים במוח
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגימות גליומה קפואות טריות התקבלו מהמרכז הלאומי למחלות גידול (NCT) - בנק רקמה בהיידלברג, גרמניה. השימוש בחומר מטופלים אושר על ידי הוועדה לביקורת מוסדית בפקולטה לרפואה בהיידלברג, והושגו הסכמה מדעת מכל המטופלים הכלולים במחקר.
1. הכנה ניסיונית
- בצע את כל השלבים על קרח או ב 4 °C (7 °F).
- צינורות טרום צמרמורת, כלים, סכיני גילוח, Douncers ועלים עד 4 °C (70 °F).
- הכן את כל המאגרים מראש. מאגרים אלה יציבים בטמפרטורת החדר. סינון סטרילי מומלץ, במיוחד עבור סוכרוז. ההכנות למניה משתנות מקורס ואח '19. ראה טבלאות 1-7.
- הסר דגימות מחנקן נוזלי או אחסון מקפיא -80 °C ולשמור על קרח יבש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
גנומיקה של גרעין יחיד היא שדה מתפתח עם נתונים ופרוטוקולים מוגבלים. גורם קריטי המשפיע על התוצאה של התקפות גרעינים יחידים הוא בידוד של גרעינים טהורים ושלמים. שילבנו שני פרוטוקולים שפורסמו (פרוטוקולי DroNc-seq ו- Omni-ATAC-seq) כדי לבודד גרעינים איכותיים וטהורים מבלוקי רקמת גליומה קפואים טריים תוך זמן קצר יחסית ובכך לשמור על יציבות התמלילים (איור 1).
השימוש בשלבי סינון שונים יחד עם צנטריפוגה הדרגתית באמצעות שיפוע יודיקסנול/סוכרוז מאפשר בידוד של גרעינים טהורים כאשר רו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תחום ההטרוגניות התוך-גידולית נמצא בשלב מרגש, עם בדיקות ופלטפורמות חדשניות שפותחו כדי לאתגר ולהרחיב את הידע הקיים. הטרוגניות תוך-גידולית היא גורם מכריע התורם להתקדמות המחלה ולעמידות בפני שיטות הטיפול הנוכחיות בגליומות28. מחקרים אחרונים על גידולים במוח התמקדו בהיבט חשוב זה באמצעות ניתוחים תעתיקיים ואפיגנומיים של תאים בודדים כדי לאפיין טוב יותר את ההטרוגניות התאית בתוך אותו גידול29,30,31,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים למעבדה הפתוחה של תא יחיד (scOpenLab) במרכז הסרטן הגרמני (DKFZ) על דיונים מועילים. מחקר זה נתמך על ידי הסיוע הגרמני לסרטן, מקס-Eder תוכנית מענק מספר 70111964 (S.T.).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | מוטיב פעיל | 40401 | |
| EDTA (0.5 מ') | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים | פישר סיינטיפיק | 352096 | |
| יודיקסנול (הידוע גם בשם Optiprep) | טכנולוגיות תאי גזע | 07820 | |
| MACs מסננות חכמות (30 ומיקרו; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 ומיקרו; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| ערכת בידוד גרעינים: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| מסנני טרום הפרדה (20 ומיקרו; m) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| צינורות נעילה בטוחים 1.5 מ"ל | Eppendorf | 0030120086 | |
| צינורות נעילה בטוחים 2.0 מ"ל | Eppendorf | 0030120094 | |
| תא יחיד ATAC | 10x גנומיקה | ||
| ביטוי גן תא יחיד | 10x גנומיקה | ||
| סוכרוז | סיגמא | S0389 | |
| קצות פיפטה רחבים (1000 ומיקרו; L) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| קצות פיפטה רחבים (200 ומיקרו; L) | תמו פישר סיינטיפיק | 2069GPK |
מקורות
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
