מאמר שיטה

אספקה תוך-תוך-קרדיאלית מושהית של תאי גזע לאחר פציעת איסכמיה רפרציה במודל מורין

4.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61546

⸱

3 בספטמבר 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Radiology and Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Stanford University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

תאי גזע נחקרים ללא הרף כטיפולים פוטנציאליים עבור אנשים עם נזק שריר הלב, עם זאת, הכדאיות והשמירה שלהם ירד בתוך רקמה פצועה יכול להשפיע על היעילות שלהם לטווח ארוך. בכתב יד זה אנו מתארים שיטה חלופית למשלוח תאי גזע במודל מורין של פגיעה בהתרככיה.

תקציר

יש עניין משמעותי בשימוש בתאי גזע (SCs) להתאוששות של תפקוד הלב באנשים עם פציעות שריר הלב. הנפוץ ביותר, טיפול בתאי גזע לב נחקר על ידי אספקת SCs במקביל עם האינדוקציה של פגיעה בשריר הלב. עם זאת, גישה זו מציגה שתי מגבלות משמעותיות: הסביבה האיסכמית הפרו דלקתית העוינת המוקדמת עשויה להשפיע על הישרדותם של SCs מושתלים, והיא אינה מייצגת את תרחיש האוטם subacute שבו SCs סביר להניח ישמשו. כאן אנו מתארים סדרה של שני חלקים של הליכים כירורגיים עבור אינדוקציה של פגיעה איסכמיה-reperfusion ומסירה של תאי גזע mesenchymal (MSCs). שיטה זו של ניהול תאי גזע עשויה לאפשר את הכדאיות והשמירה הארוכה יותר סביב רקמה פגומה על ידי עקיפת התגובה החיסונית הראשונית. מודל של פגיעה reperfusion איסכמיה היה מושרה בעכברים מלווה במשלוח של תאי גזע mesenchymal (3.0 x 105), מבטא בstabing את הגן הכתב גחלילית לוציפראז תחת היזם CMV מבוטא באופן קונסטרטיבי, intramyocardially 7 ימים מאוחר יותר. בעלי החיים תדמינו באמצעות אולטרסאונד והדמיה ביו-לומסצנטית לאישור פציעה והזרקת תאים, בהתאמה. חשוב לציין, לא היה שיעור סיבוך נוסף בעת ביצוע גישה זו של שני נהלים עבור מסירה SC. שיטה זו של ניהול תאי גזע, יחד עם ניצול של גנים עיתונאי המדינה-of-the-art, עשוי לאפשר מחקר vivo של קיום ושמירה של SCs מושתלים במצב של איסכמיה כרונית נפוץ לראות קלינית, תוך עקיפת התגובה הפרו דלקתית הראשונית. לסיכום, הקמנו פרוטוקול לעיכוב במשלוח של תאי גזע לתוך שריר הלב, אשר יכול לשמש כגישה חדשה פוטנציאלית לקידום התחדשות של הרקמה הפגועה.

מבוא

מחלות לב וכלי דם נשאר הגורם הנפוץ ביותר של תחלואה ותמותה ברחבי העולם. אירועי לב איסכמי נמצאו מזיקים לתפקוד הכולל של שריר הלב והתאים שמסביב1. רק 0.45-1.0% מקרדיומיוציטים יתחדשו מדי שנה לאחר שנזק שריר הלביתרחש 2. למרות הביקוש הגובר וההתמקדות הטבועה בפיתוח טיפולים, טיפולים המסייעים להתחדשות של רקמות פצועות היו קשים להקים ועדייןדורשים אופטימיזציה נוספת 3,,4,,5. טיפולים בתאי גזע הוצגו כדרך חלופית כדי להצעיר רקמה פגומה לאחר אירוע איסכמי; עם זאת, קידום טיפולים אלה כבר אתגר על ידי הישרדות מוגבלת ושמירה של התאים לאזור6 פצוע.

המיקרו-סביבה של הלב לאחר אירוע איסכמי יכולה להיות מאופיינת כ hypoxic, פרו חמצון, ופרו דלקתיות, הצגת תנאים עוינים עבור תאי גזע טיפוליים להסתגללהישרדות 7,,8. כמו תגובה חיסונית מופעלת בעקבות פציעה, לימפוציטים נאיביים, מקרופאגים, נויטרופילים ותאי תורן מנסים לתקן את הנזק על ידי הסרת תאים גוססים ואיזות התהליך לשיפוץרקמות 9,10,11. בתוך 3 הימים הראשונים לאחר איסכמיה, דלקת היא בשיאה עם שחרורו של ציטוקינות פרו דלקתיות עם מספרים גבוהים של נויטרופילים ומונוציטים באזור10,12. לאחר 7 ימים, חלק גדול מהדלקת דעך והמעבר לתאים שיפוץ מתחיל, ממשיך עד מפל השיפוץ הושלמה, כ 14 ימים בעכברים13. השיטה הכירורגית שלנו היא גישה חלופית פוטנציאלית להחדרת ביולוגיות לתוך שריר הלב כדי לעקוף את התגובה החיסונית המולדת שיא לאחר פגיעה איסכמיה reperfusion. במקביל, זה יאפשר את המחקר של כל טיפולים במצב של איסכמיה subacute / כרוני שבו ייתכנו משתנים שונים לשקול בהשוואה אוטם שריר הלב חריפה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הניסויים בוצעו על עכברי C57BL/6 נקבה, גיל 10-12 שבועות ו 20-25 גרם משקל גוף. כל ההליכים בבעלי חיים צייתו לסטנדרטים שנקבעו במדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים מעבדה (המכון למשאבי בעלי חיים במעבדה, האקדמיה הלאומית למדעים, בת'סדה, MD, ארה"ב) ואושרו על ידי המכללה לרפואה של מאיו לרפואה מוסדית לטיפול בבעלי חיים וועדת שימוש (IACUC).

1. הכנה וצנרור

  1. Autoclave כל כלי הניתוח לפני הניתוח. אם יש לבצע מספר ניתוחים בפגישה אחת, נקה את המכשירים לאחר כל בעל חיים ועיקור מחדש באמצעות מחטא חרוזים חם.
  2. להמריד את העכברים עם 3.5-4% isoflurane ב 1 L/min O2 בתא אינדוקציה.
  3. לתת Buprenorphine SR 1 מ"ג/ק"ג (משכך כאבים) תת עורית, לשקול את החיה, ולהזין את המשקל לתוך מכונת ההנשמה.
  4. לגלח את הצד השמאלי של החזה מעצם החזה לרמה של הכתף ולהחיל קרם depilatory כדי להסיר פרווה עודפת.
  5. עבור הליך reperfusion איסכמיה לשמור על הלחץ הסופי החיובי (PEEP) על מכונת ההנשמה ב 2 cmH2O. עבור הזרקה מושהית של הליך תאים לשנות את ה-PEEP ל 3 cmH2O כדי למנוע קריסת ריאות.
  6. צנרר את החיה באמצעות צינור אנדוטרצ'ל 20 G, להעביר כרית חימום מבוקרת כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 35-37 ° C.
  7. מניחים את העכבר על מכונת הנשמה בהתכוויה רוחבית עם קצה גולגולתי בצד שמאל וקץ סיבתי בצד ימין.
  8. לשמור על הרדמה ב 2-2.5% isoflurane ב 1 L/min O2 למשך שארית ההליך.
  9. לקרצף את האזור הכירורגי לסירוגין בין povidone-יוד ואלכוהול ספוגיות שלוש פעמים ולהחיל משחה אופטלמית על שתי העיניים.

2. פציעת איסכמיה

  1. באמצעות #10 להב עשה חתך אנכי 2.5 מ"מ לימין הפטמה השמאלית ביותר בשדה התצוגה.
  2. באמצעות מספריים לחתוך דרך שכבות שריר שטחי עד השרירים intercostal וצלעות גלויים.
  3. בעת הרמת הצלעות והרקמה שמסביב, לחתוך דרך החלל הבין-צלבי בין הצלעות 4 ו -5, ואז להכניס את מפשק העפעפיים לחלל הפתוח.
  4. משוך את החיידק באמצעות מ מפסים מעוקלים, הזזת הריאה כלפי מעלה ומחוץ לתצוגה.
  5. לדמיין את עורק LAD, באמצעות תפר ניילון 9-0, לעבור דרך שריר הלב מתחת לעורק 2.5 מ"מ דיסטל לתכלת השמאלית ולקשור קשר מרובע רופף.
  6. חותכים 1 ס"מ של צינורות פוליאתילן ומניחים אותו בתוך הקשר הרופף.
  7. אבטחו את התפר מסביב לצינורות, אישרו איסכמיה, ואז שחררו אחרי 35 דקות.
    הערה: אשר איסכמיה באמצעות חיוורון והפרעה בקצב הלב בחדר.
  8. לאחר שחרור הקשירה והסרת הצינורות, המתן 5 דקות כדי לאשר את ההתרגזות של שריר הלב.
  9. שים צינור צנתר 24 ג'י.וי.
  10. סגור את החתך הבין-צלבי עם תפר קליט 6-0 בתבנית פשוטה שהופסקה.
  11. סגור את שכבת השריר עם תפר 6-0 נספג בתבנית תפר רציפה.
  12. לאחר סגירת שכבת השריר השטחית, הסר את נקז החזה תוך משיכת האוויר מחיל בית החזה באמצעות מזרק שחפת 1 מ"ל.
  13. סגור את חתך העור עם תפר קליט 6-0 בתבנית מזרן אופקית רציפה
    הערה: תפרים ניילון ודפוס תפר בלתי רציפות עשוי לשמש גם לשכבת העור.
  14. לתת 1.5 מ"ל של תמיסת מלח חמה תת עורית ולהחיל משחה משולשת אנטיביוטיקה לאתר החתך כדי למנוע זיהום.
  15. כבה את isoflurane ולאפשר לחיה לנשום דרך מכונת ההנשמה על 100% O 2 עד שהוא יכוללנשום ברציפות ללא סיוע.
  16. העבר את העכבר לכלוב ללא מצעים או לכלוב עם מצעים מכוסים (מגבת נייר או וילונות) על משטח חם בטמפרטורה של 35-37°C עד להחלמה מלאה.

3. משלוח תאי גזע mesenchymal עכבר

הערה: הזן של עכברים המשמשים להליך הם קו מלידה ונחשבים זהים גנטית. תאי הגזע mesenchymal הושגו מבעלי חיים מאותו זן, על ידי עיצוב פרוטוקול, דיכוי המערכת החיסונית לא היה מושרה1.

  1. השלם את שלבי ההכנה וצנרור כפי שנעשה בעבר עבור ההליך הראשון.
  2. הסר את התפר משכבת העור באמצעות מספריים ומפסים.
  3. עם #10 אזמל, לעשות חתך באותו מיקום כמו הניתוח הקודם.
  4. המשך להשתמש באזמל כדי לחתוך דרך רקמת צלקת עד תפר שכבת שריר גלוי
  5. באמצעות המספריים והמקציות להסיר את התפר ולחתוך את שכבת השריר פתוח.
  6. דמיין והסר את התפרים המחזיקים את הצלעות יחד ולהמשיך לחתוך דרך השריר הבין-צלע מהחתך הקודם.
    הערה: ייתכן שהריאות דבקו בקיר החזה, אם הדבר מתרחש, השתמש במשקולות קהות או מעוקלות כדי להפריד ולשחרר אותן בזהירות.
  7. מניחים את מפשק העפעפיים בחלל הבין-קוסטלי ואתרו את אזור הרצועה הקודמת.
  8. טען את תאי הגזע mesenchymal (3.0 x 105), מושעה20 μL PBS, לתוך מזרק אינסולין 30 G, לכופף את המחט מעט לפי הצורך עבור הזווית הנכונה להזריק.
    הערה: תאי גזע Mesenchymal (MSCs) היו מבודדים רקמת שומן של 4-6 שבועות C56BL/6 עכברים. תאי מעבר מוקדמים (p3) הושרשו עם וקטור המבטא את הגן גחלילית לוציפראז תחת מקדם CMV כדי לאפשר ניטור הכדאיות של תאי vivo. MSC עכבר נגזר אדיפוז היו מאופיינים ציטומטריית זרימה ואת התאים היו חיוביים CD44, CD29, CD90 ו CD105 אבל שלילי עבור סמן hematopoietic CD4514. לפני הזריקה, MSCs היו תרבותיים לפחות מעבר אחד כדי למנוע אובדן של תאים מתהליך ההפשרה.
  9. נע בכיוון מן apex לכיוון הבסיס של הלב להכניס את המזרק לאזור peri-אוטם עד פתיחת המחט הוא לחלוטין בתוך שריר הלב.
  10. ברגע שנכנס לאט להזריק את התאים לתוך שריר הלב, לחכות 3 s, ולאחר מכן להסיר את המחט.
  11. שים לב מקרוב במשך 3 דקות כדי להיות בטוח ללא תגובות חריגות לתאים כגון פתפור חדרי.
  12. מניחים צינור צנתר 24 ג'י 4 בחלל בית החזה, חלל בין-תאי אחד מימין לפתיחה.
  13. סגור את שכבות intercostal, שריר, ועור ולהסיר את נקז החזה באותה שיטה כמו ההליך הראשון.
  14. לתת 1.5 מ"ל של תמיסת מלח חמה תת עורית ולהחיל משחה משולשת אנטיביוטיקה לאתר החתך כדי למנוע זיהום.
  15. כבה את isoflurane ולאפשר לבעלי חיים לנשום דרך מכונת ההנשמה על 100% O 2 עד שהוא מסוגללנשום ברציפות ללא סיוע.
  16. העבר את העכבר לכלוב ללא מצעים או לכלוב עם מצעים מכוסים (מגבת נייר או וילונות) על משטח חם בטמפרטורה של 35-37°C עד להחלמה מלאה.

4. טיפול לאחר הניתוח ים בעקבות שני ההליכים

  1. יש להקפיד על החיה ללא הרף עד לנסימה ספונטנית, לתפיכת החזה ולתנועה נורמלית.
  2. המשך תצפית כל 15-30 דקות לפחות 3 שעות ביום הניתוח.
  3. בדוק את העכברים לתסיסה הפצע או כאב חריג פעם ביום במשך 5 ימים, אז 2-3 פעמים בשבוע.
  4. אם בעל החיים מראה סימנים של כאב (כלומר גב מקושת, תנועה מינימלית, grimacing, או פרווה מוזנחת) לאחר 72 שעות לאחר הניתוח, לספק מנה נוספת של משכך כאבים Buprenorphine SR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פציעת תפרוק איסכמיה נגרמה בעכברים ביום 0, ואחריו אקו-קרדיוגרמה ואלקטרוקרדיוגרם לאחר הניתוח ביום שלפני השתלת תאי גזע. ניתוח אולטרסאונד ואלקטרוקרדיוגרם אישר אוטם וירידה בתפקוד ההתכווצות בחדר הלב(איור 1לערך). בדיקה נוספת של הנתונים הראתה כי השבר והקיצור החלקי ירדו בעכברים שקיבלו פגיעה איסכמית, בעוד שנפחי הסיום והסיסטוליים גדלו(טבלה 1). בהשוואה לב עכבר נורמלי(איור 2A), הכתמתטריכרום Masson של רקמת שריר הלב 7 ימים לאחר הפציעה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מעל 85 מיליון אנשים ברחבי העולם מושפעים ממחלות לב וכלידם 3. השכיחות הגבוהה של אירועים איסכמיים אלה מצדיקה פיתוח נוסף והרחבה של טיפולים חלופיים לקידום התחדשות של רקמות פגומות. שיטות מסורתיות לנצל את הליך reperfusion איסכמיה בסביבה חריפה עם ניהול עוקב שלטיפולית 1. תגובות דלקתיות נמצאות בשיאה בין 3-4 ימים לאחר אירוע איסכמי לב, עם חדירה של נויטרופילים, מקרופאגים, וציטוקין מוגבר איתות10,12. לאחר תקופה זו של פירוק תאים מת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לסופרים אין מה לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% השקיה NaCl, USPBaxter0338-0048-04
וילון כירורגי 11x12 אינץ' Press n' Seal,טכנולוגיות עירוי SAIPSS-SD
24G 3/4 אינץ' צינור קטטר IVJelco4053
28G x 1/2 אינץ' 1 מ"ל מזרק אלרגיהBD305500הזרקת מזרק אינסולין משכך כאבים
30G x 1/2 אינץ' 3/10ccUlticare08222.0933.56הזרקת תאי גזע
6-0 S-29, תפר ויקריל 12 אינץ'EthiconJ556Gסגירת חתך בין-צלעי, שטחי של שרירים ושכבת עור
9-0 BV100-4, 5 אינץ' תפר אתילון Ethicon2829Gקשירת עורק LAD
כרית תחתונה סופגתThermo Fischer Scientific14-206-64מתחת לבעל החיים
רפידות הכנה לאלכוהול, 2 שכבות, בינוניCoviden6818
מסכת פנים נגד ערפלHalyard49235
מספריים פזילה של בון, מעוקלות, קהותFine Science Tools14085-09
בופרנורפין HCL SR LAB 1 מ"ג/מ"ל, 5 מ"לבית מרקחתZooPharm בופרנורפין משכך כאבים נרקוטי מנוסח בפולימר שמאט את הספיגה ומאריך את משך הפעולה (משך 72 שעות של פעילות).
מחזיקי מחט Castroviejo,כלי מדע עדינים12061-01
ספוגי גזה סטריליים CurityCoviden397310
מלקחיים קשירת תפרים עדינים, 45 זווית מכופפתFine Science Tools11063-07
סכין גילוח חשמליהסרת פרוותWahl
איזופלורן 100 מ"לPI23238 בריאות קרדינלהרדמה
מעיל
מונוגז'קט 1 מ"ל מזרק היפודרמיCoviden8881501400
Moria איריס מלקחיים, מעוקל, משונן (x2)Fine Science Tools11370-31
Moria speculum retractorFine Science Tools17370-53
ערכת אינטובציה אנדוטרכיאלית לעכברKent Scientific
Nair קרם אפילציהJohnson & הסרת פרוות
סיכה לעיניים Optixcare בתוספתחומר סיכה עיניים סטרילישל Aventix
מאוורר פיזיוסוויטקנט סיינטיפיק
פוליאתילןצינורות הרווארד מנגנון72-0191דחיסה זמנית של עורק LAD
ספוגיות פובידון-יודPDIS41125
אזמל, 10 להביםBard-Parker371610
אפליקטורים סטריליים 3 אינץ' עם קצה כותנהCardinal HealthC15055-003
אפליקטורים סטריליים 6 אינץ' אפליקטורים עם קצה כותנה מחודדפוריטן25-826-5WC
כפפות סטריליותCardinal HealthN8830
שקיות עיקורMedlineMPP100525GS
כובעניתוח
מיקרוסקופ כירורגיLeicaM125
מלקחיים לקשירת תפרים, ישר (x2)Fine Science Tools10825-10
סרט כירורגי Transpore3M1527-1
משחה אנטיביוטית משולשתG& W Laboratories11-2683ILNC2יישום מקומי למניעת זיהום
Vannas-Tü מספריים אביביים bingen,כלי מדע עדינים15004-08
וופורייזר Vetfloקנט סיינטיפיק
הניתנות לחיטוי מעוקלים מעבדהג'ונסון מעוקלים

מקורות

  1. Franchi, F., et al. The Myocardial Microenvironment Modulates the Biology of Transplanted Mesenchymal Stem Cells. Molecular Imaging Biology. , (2020).
  2. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  3. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38(2016).
  4. Gersh, B. J., Simari, R. D., Behfar, A., Terzic, C. M., Terzic, A. Cardiac cell repair therapy: a clinical perspective. Mayo Clinic Protocol. 84 (10), 876-892 (2009).
  5. Terzic, A., Behfar, A. Regenerative heart failure therapy headed for optimization. European Heart Journal. 35 (19), 1231-1234 (2014).
  6. Beegle, J., et al. Hypoxic preconditioning of mesenchymal stromal cells induces metabolic changes, enhances survival, and promotes cell retention in vivo. Stem Cells. 33 (6), 1818-1828 (2015).
  7. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circulation Research. 111 (9), 1208-1221 (2012).
  8. Psaltis, P. J., et al. Noninvasive monitoring of oxidative stress in transplanted mesenchymal stromal cells. JACC Cardiovascular Imaging. 6 (7), 795-802 (2013).
  9. Peet, C., Ivetic, A., Bromage, D. I., Shah, A. M. Cardiac monocytes and macrophages after myocardial infarction. Cardiovasc Research. 16 (6), 1101-1112 (2020).
  10. Swirski, F. K., Nahrendorf, M. Cardioimmunology: the immune system in cardiac homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (12), 733-744 (2018).
  11. Zhang, Z., et al. Mesenchymal Stem Cells Promote the Resolution of Cardiac Inflammation After Ischemia Reperfusion Via Enhancing Efferocytosis of Neutrophils. Journal of the American Heart Association. 9 (5), 014397(2020).
  12. Saxena, A., Russo, I., Frangogiannis, N. G. Inflammation as a therapeutic target in myocardial infarction: learning from past failures to meet future challenges. Translational Research. 167 (1), 152-166 (2016).
  13. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים