הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידול של מונוציטים לתוך מקרופאגים שונים Phenotypically לאחר טיפול עם תאי גזע דם חוט אנושי (CB-SC)נגזר אקסוזומים

5.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61562

⸱

12 בנובמבר 2020

 ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health Center, 2Department of Chemistry and Chemistry Biology, Stevens Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

יישום Exosome הוא כלי מתפתח לפיתוח תרופות ורפואה רגנרטיבית. אנו מקימים פרוטוקול בידוד אקסו-זמני עם טוהר גבוה כדי לבודד אקסוזומים מתאי גזע שזוהו על ידי רומן הנקראים CB-SC למחקרים מכניים. אנחנו גם coculture CB-SC נגזר אקסוזומים עם מונוציטים אנושיים, המוביל ההבדל שלהם לתוך מקרופאגים שונים phenotypically.

תקציר

טיפול במחנך תאי גזע (SCE) הוא גישה קלינית חדשנית לטיפול בסוכרת מסוג 1 ובמחלות אוטואימוניות אחרות. טיפול SCE מפיץ את תאי הדם החד-גרעיניים של המטופל המבודד (למשל, לימפוציטים ומונוציטים) באמצעות מכונת אפיה, תרבויות ותרביות תרבית הדם של המטופל mononuclear תאים עם תאי גזע טבור דבקים (CB-SC) במכשיר SCE, ולאחר מכן מחזיר תאים חיסוניים "משכילים" אלה לדם של המטופל. Exosomes הם שלל חוץ תאי בגודל ננו בין 30\u2012150 ננומטר קיים בכל מדיה ביו-נוזלים ותרבות תא. כדי להמשיך לחקור מנגנונים מולקולריים הבסיסיים טיפול SCE ולקבוע את הפעולות של exosomes שוחרר CB-SC, אנו חוקרים אילו תאים phagocytize אלה exosomes במהלך הטיפול עם CB-SC. על-ידי שיתוף culturing CB-SC-נגזר אקסוזומים עם תאים חד גרעיניים דם היקפיים אנושיים (PBMC), מצאנו כי exosomes נגזר CB-SC נלקחו בעיקר על ידי מונוציטים אנושיים CD14 חיובי, המוביל הבידול של מונוציטים לתוך סוג 2 מקרופאגים (M2), עם מורפולוגיה דמויי ציר וביטוי של סמנים מולקולריים משטח M2 הקשורים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ואפיון של אקסוזומים הנגזרים מ-CB-SC ולפרוטוקול לתרבות ההפוכחה של אקסוזומים שמקורם ב-CB-SC עם מונוציטים אנושיים וניטור בידול M2.

מבוא

תאי גזע דם טבורים (CB-SC) הם סוג ייחודי של תאי גזע המזוהים מדם טבור אנושי ומובדלים מסוגים ידועים אחרים של תאי גזע כגון תאי גזע mesenchymal (MSC) ותאי גזע hematopoietic (HSC)1. בהתבסס על המאפיינים הייחודיים שלהם של אפנון חיסוני והיכולת שלהם לדבוק בחוזקה על פני השטח של צחות פטרי, פיתחנו טכנולוגיה חדשה המוגדרת כטיפול מחנך תאי גזע (SCE) בניסוייםקליניים 2,3. במהלך טיפול SCE, תאים חד-גרעיניים בדם היקפי של המטופל (PBMC) נאספים ומופצים דרך מפריד תאים ויתורות בהתרבות עם CB-SC דבק במבחנה. תאים "משכילים" אלה (PBMC שטופלו ב-CB-SC) מוחזרים לאחר מכן למחזור הדם של המטופל במערכת סגורה. ניסויים קליניים כבר הוכיחו את הבטיחות הקלינית ואת היעילות של טיפול SCE לטיפול במחלות אוטואימוניות כולל סוכרת סוג 1 (T1D)2,4 והתקרחות areata (AA)5.

Exosomes הם משפחה של חלקיקים עם קטרים הנעים 30\u2012150 nm והם קיימים בכל biofluid ומדיה תרבות תא6. אקסוזומים מועשרים מולקולות ביואקטיביות רבות כולל שומנים, mRNAs, חלבונים, microRNAs (miRNA), ולשחק תפקיד חשוב בתקשורת תא לתא. לאחרונה, exosomes הפכו אטרקטיביים יותר עבור חוקרים וחברות תרופות בשל הפוטנציאל הטיפולי שלהםבמרפאות 7,8,9. לאחרונה, המחקרים המכניים שלנו הראו כי exosomes CB-SC שפורסמו לתרום אפנון חיסוני של טיפול SCE10.

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לחקור את המנגנון של טיפול SCE מיקוד מונוציטים על ידי exosomes CB-SC שפורסמו. ראשית, exosomes CB-SC שוחררו היו מבודדים מ CB-SC נגזר מדיה מותנית באמצעות שיטות ultracentrifugation ואומתו על ידי ציטומטריה זרימה, כתם מערבי (WB) ופיזור אור דינמי (DLS). שנית, אקסוזומים נגזר CB-SC סומנו עם צבע ליפופילי פלורסנט ירוק: דיו. שלישית, הם היו שיתוף תרבות עם PBMC כדי לבחון את האחוזים החיוביים של exosomes CB-SC-מתויג בתת-אוכלוסיות שונות של PBMC על ידי ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה מספק הדרכה ללמוד את הפעולה של exosomes הבסיסית אפנון חיסוני של תאי גזע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר האנושי המוסדי במרכז לגילוי וחדשנות, Hackensack Meridian Health. יחידות דם של מעיל באפי אנושי נרכשו ממרכז הדם של ניו יורק (ניו יורק, ניו יורק). יחידות דם טבור אנושי נאספו מתורמים בריאים ונרכשו מבנק הדם הבינלאומי Cryo-Cell (Oldsmar, FL). הן מרכז הדם של ניו יורק והן קריו-תא קיבלו את כל ההסמכה לאוספים והפצות דם, באישור IRB וטפסי הסכמה חתומים מתורמים.

1. תרבות תאים והכנת CB-SC נגזר בינוני מותן

  1. להעביר 25 מ"ל של דם טבור (טבלת חומרים) מעל 20 מ"ל של צפיפות הדרגתי בינוני (γ = 1.077) לתוך צינור חסין 50 מ"ל.
  2. צנטריפוגה ב 1,690 x g עבור 20 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד ללא בלם.
  3. מעבירים בזהירות את שכבת התא המונו-נו-נו-קלר (מעיל באפי) לצינור חרסי חדש של 50 מ"ל. מלא את הצינור החמור עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) עד 40 מ"ל. מערבבים וצנטריפוגה לתאי כדוריות ב-751 x g למשך 10 דקות ב-20°C.
  4. השליכו את הסופרנט והוספו 15 מ"ל שלמאגר ACK lysis ( טבלת חומרים ) לתא. להשעות מחדש תאים באמצעות צנרת. לאחר מכן דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: שלב זה מסיר את תאי הדם האדומים.
  5. מלא את הצינור חסני עם 25 מ"ל של PBS. צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant כדי להשיג תאים מונו-קלריים כדוריים.
  6. לשטוף 2x עם 40 מ"ל של PBS כדי להסיר את מאגר lysis הנותרים.
  7. צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דקות כדי גלולות התאים.
  8. השליכו את תאי הדם המונו-גרעיניים של הדם המותאם-גרעיני עם 10 מ"ל של מדיום ללא סרום המוגדר כימי(טבלת חומרים)לכל שפופרת.
  9. שלב תאים חד-קוטביים בדם טבור לצינור אחד.
  10. קח 20 μL התא מתלה ולערבב עם 20 μL של 0.4% פתרון כחול trypan(טבלת חומרים)בצינור 1.5 מ"ל.
  11. טען לתוך שקופית התא וכמת את מספר התא ואת הכדאיות בתא באמצעות מונה תא אוטומטי.
    הערה: מתלי התא מדוללים בשעה 1:10 אם ריכוז התאים הוא מעל 1 x10 7 תאים/מ"ל.
  12. זרעים חד-נשקיים בתאים חד-נשקיים ב-150 מ"מ x 15 מ"מ צ'נרי ב-1 x10 6 תאים/מ"ל, 25 מ"ל/צלחת במדיום תרבות תאים ללא סרום המוגדר כימית.
  13. דגירה ב 37 °C תחת 8% CO2 תנאים עבור 10\u201214 ימים עד CB-SC להגיע יותר מ 80% confluence.
  14. השליכו את הסופרנטנט ושטפו 15 מ"ל PBS לכל צלחת פטרי; לאחר מכן, הסר את PBS.
    הערה: CB-SC מחוברים לצלי פטרי בחוזקה.
  15. חזור על שלב 1.14 פעמיים.
  16. מוסיפים 25 מ"ל של סרום כימי ללא מדיום לכל צלחת פטרי.
  17. דגירה ב 37 °C תחת 8% CO2 תנאים עבור 3\u20124 ימים.
  18. לאסוף את CB-SC נגזר בינוני מותנה לתוך צינורות חרליים 50 מ"ל.

2. אפיון CB-SC

  1. ניתוק CB-SC על ידי pipetting 10 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תא מבוסס PBS למעלה ומטה עם קצה פיפטה 5 מ"ל(טבלת חומרים).
  2. צנטריפוגה ב 1,690 x g עבור 5 דקות לתאי כדוריות ולהשעות מחדש ב 200 μL של PBS.
  3. לתקן ולחלחל תאים עבור כתמים תאיים באמצעות ערכת הכנתהכתמה (טבלת חומרים).
  4. להוסיף 5 μL של בלוק FC (טבלת חומרים) לכל דגימה דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: חוסם Fc מעכב איגוד לא ספציפי בעת הכתמה בנוגדנים.
  5. הוסף נוגדנים חד-אנושיים נגד עכבר פלואורסצינטי, כולל CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 ו- Galectin 9ב- 25 μg/mL (טבלת חומרים) לנפח של 100 μL של תאים. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הגנה קלה.
  6. לאחר הכתמה, לשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 751 x g עבור 10 דקות לתאי גלולה.
  7. להשעות מחדש תאים עם 200 μL של PBS ולהעביר לתוך צינור 5 מ"ל.
  8. בצע ציתום זרימה כדי לאמת את הביטוי של CB-SC המשויך מעל סמנים ספציפיים.

3. בידוד אקסוזומים הנגזרים מ-CB-SC

  1. צנטריפוגה המדיום מותן שנאסף מ שלב 1.18 ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C. העבר את הסופרנטנט לצינור חורט חדש של 50 מ"ל.
  2. צנטריפוגה supernatant שנאסף מ שלב 3.1 ב 2,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° C. העבר את הסופרנטנט לצינור חורט חדש של 50 מ"ל.
  3. צנטריפוגה supernatant שנאסף מ שלב 3.2 ב 10,000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° C. העבר את הסופרנטנט לצינור חורט חדש של 50 מ"ל.
    הערה: הרוטור זווית קבועה משמש כך כדורי התא מואצים לצד של הצינור. סמן את צד המכסה וצייר עיגול בצד הצינור שבו צפויה הגלולה.
  4. מסנן supernatants שנאספו מ שלב 3.3 עם מסנן 0.22 μm(טבלת חומרים).
  5. העברת 15 מ"ל מדיה לכל יחידת סינון צנטריפוגלית של 10 kDa(טבלת חומרים).
  6. צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 30 דקות כדי לבודד את התקשורת אקסוזום מרוכז.
  7. מעבירים את האקסוזומים המרוכזים לצינור אולטרה-צנטריפוגה. לאחר מכן, exosomes גלולה ב 100,000 x g עבור 80 דקות ב 4 ° C.
  8. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדורי האקסוזומים ב-10 מ"ל של PBS.
  9. צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 80 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את כדורי exosomes.
  10. להשעות מחדש את כדורי exosomes ב 200 μL של PBS על ידי pipetting למעלה למטה.

4. אפיון אקסוזומים נגזר CB-SC

  1. כימות ריכוז החלבון הכולל של הכנה אקסוזום על ידי ערכת תסוואי חומצה bicinchoninic (BCA)
    1. פיפט 10 μL של כל תקן אלבומין ומבודד exosome מדגם מוכן בשלב 3.10 לתוך צלחת 96-באר בכפילויות.
    2. הוסף 200 μL של reagent עובד מתוך ערכת BCA לכל באר. מערבבים את תכולת הצלחת ביסודיות על שייקר הצלחת במשך 10 שניות.
      הערה: ריאגנט עבודה (WR): ריאגנט A בן 50 חלקים עם ריאגנט B של חלק אחד.
    3. מכסים את הצלחות בנייר כסף ומדגרים אותן ב-37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
    4. מצננים את הצלחות לטמפרטורת החדר (RT).
    5. מדוד ספיגה לדוגמה ב- 562 00 00 00 00:00:00,000 -
  2. הכנה והכתמה של אקסוזומים עבור ציטומטריית זרימה
    1. ללכוד exosomes על ידי הוספת 20 μL של חרוזים מגנטיים CD63 אנטי אנושי (4.5 μm גודל) (טבלת חומרים) לתוך 25 μg של exosomes נגזר CB-SC מוכן בשלב 3.10 בסך הכל 100 μL נפח של PBS.
    2. דגירה הצינור בן לילה (18\u201222 h) ב 4 ° C על שייקר ב 800 סל"ד.
    3. צנטריפוגה הצינור ב 300 x g עבור 30 s לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור.
    4. הוסף 300 μL של מאגר בידוד (0.1% אלבומין סרום של נקניק (BSA) ב- PBS) ומערבבים בעדינות על ידי pipetting.
      הערה: שלב זה שוטף את האקסוזומים המאוגדים בחרוזים.
    5. מניחים את הצינור על מעמד מגנט למשך דקה אחת (טבלת חומרים) וזורקים את הסופרנטנט.
    6. חזור על שלבים 4.2.4\u20124.2.5.
    7. להשעות מחדש את exosomes חרוזים כבול עם 400 μL של חיץ בידוד.
    8. Aliquot 100 μL של exosomes חרוזים כבולים לכל צינור.
    9. הוסף נוגדנים פלואורסצנטיים (CD9-FITC, CD81-PE ו- CD63-FITC ב- 25 μg/mL, בהתאמה) לכל צינור זרימה עם exosomes חרוז CD63 שנתפסו.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כפקדים שליליים.
    10. דגירה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר עם הגנה קלה על שייקר ב 800 סל"ד.
    11. חזור על שלבים 4.2.4\u20124.2.5.
    12. להשעות מחדש את exosomes חרוזים כבול ב 200 μL של חיץ בידוד ולהעביר צינורות זרימה 5 מ"ל.
    13. מניחים את הצינורות בהסגלה לדוגמה של ציטומטר הזרימה.
    14. פתח את הפרוטוקול לבדיקות אקסו-אקסו-סוחפת.
    15. הפעל את הדגימה באופן אוטומטי על-ידי ציטומטר זרימה.
  3. זיהוי אקסו-זו-ום על-ידי כתם מערבי
    הערה: כתם מערבי היא שיטה מבוססת היטב ולא נלך לפרטים של השיטה עצמה.
    1. Lyse כדורי exosomes נגזר CB-SC מ שלב 3.10 עם 100 μL של מאגר RIPA, פיפטה 20x, ולאחר מכן מניחים על קרח במשך 5 דקות.
    2. לכמת את ריכוז החלבון של exosome lysate על ידי ערכת BCA ולטעון 25 μg של חלבון לכל באר.
    3. הפרדו את החלבונים באמצעות אלקטרופורזה ג'ל במשך 40 דקות ב 150 V.
    4. להעביר את החלבון קרום פלואוריד פוליוינילידן (PVDF) באמצעות העברה חצי יבשה שיטה11.
    5. חוסמים את הממברנה עם 5% חלב ללא שומן למשך 30 דקות.
    6. דגירה עם 2 μg/mL אנטי-אנושי אליקס(טבלת חומרים)ו 1 μg / מ"ל נוגדנים קלנקסין אנטי אנושי(טבלת חומרים).
    7. זהה את החלבון באמצעות כימיומינציה באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית.
  4. אימות Exosome על-ידי פיזור אור דינמי (DLS)
    1. לדלל 10 μg של דגימות exosome נגזר CB-SC ב 1 מ"ל של PBS.
    2. מעבירים את ה-1 מ"ל של מדגם מדולל למיקרו-מיקרו חד פעמי(טבלת חומרים).
    3. מניחים את ה-cuvette במכשיר DLS. הגדר את אינדקס שבירה (RI) כ- 1.39 עבור כל הצג לדוגמה.
    4. הפעל דגימות ב- 25 °C ורכוש שלוש מדידות לכל שבר כדי לקבל התפלגות גודל ממוצעת.
  5. אימות אקסו-זופי על-ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)
    1. מעיל formvar על 300 רשתות נחושת רשת12 (לוח חומרים).
    2. לחזק את formvar עם השכבה הנוספת של פחמן התאדה על רשתות נחושת12.
      הערה: גישת ציפוי כזו מצוינת לתמיכה בדגימות.
    3. טען 10 μL של דגימות אקסו-זום על רשתות ולהשאיר לאוויר יבש.
    4. דגימות כתם שליליות עם אצטט אורניל במשך 5 דקות.
    5. לשטוף שלוש פעמים עם מי DI ולהשאיר לייבוש אוויר.
    6. צפה וצלם את הדגימות תחת TEM. הגדר את מתח ההאצה על 200 kV וגודל ספוט ב 2.

5. למדוד Dio-תווית CB-SC נגזר exosomes נלקח על ידי תת אוכלוסיות שונות של PBMC

  1. תווית CB-SC נגזר אקסוזומים עם צבע ליפופילי פלורסנט ירוק Dio
    1. להעביר 100 μg של exosomes CB-SC נגזר (מוכן בשלב 3.10) לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
    2. לדלל דגימה עם PBS ל 5 מ"ל.
    3. מוסיפים צבע ליפופילי פלואורסצנטי ירוק(טבלת חומרים)עד שריכוז העבודה מגיע ל-5 μM.
    4. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור.
    5. מעבירים את הדגימה לצינור אולטרה-צנטריפוגה.
    6. צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 80 דקות כדי כדורי CB-SC נגזר exosomes.
    7. להשעות מחדש את exosomes מתויג ב 200 μL של PBS.
  2. הכנת PBMC אנושי
    1. להעביר 25 מ"ל של מעיל באפי אנושי(טבלת חומרים)מעל 20 מ"ל של צפיפות הדרגתית בינונית (γ = 1.077) לתוך צינור חסוני 50 מ"ל.
    2. חזור על שלבים 1.2 עד 1.11.
    3. מעבירים 1 x 106 PBMC לצלחת הידרופובית 24 באר שאינה מטופלת ברקמות (1 מ"ל/באר).
      הערה: צלחת שאינה מטופלת ברקמות שימשה כדי למנוע דבקות במונוציטים.
  3. אקסוזומים בעלי תווית של דיו עם PBMC
    1. להעביר 40 μL Dio-תווית CB-SC נגזר exosomes מוכן בשלב 5.1.7 לכל PBMC המכיל היטב בצלחת 24-באר באמצעות פיפטה 200 μL. הוסף את אותו אמצעי אחסון של PBS כדי לשלוט בארות.
    2. מערבבים על ידי התפתלות 10x. דגירה ל-4 שעות.
    3. לאסוף 200 μL exosome-מטופל PBMC ותווית עם Hoechst 33342 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. זרוק את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 100 μL של PBS.
    5. הר תאים על שקופיות מיקרוסקופ.
    6. צפה וצלם את האינטראקציה של exosomes CB-SC-מתויג DIO עם Hoechst 33342 תווית PBMC באמצעות מיקרוסקופ.
    7. העבר את התאים הנותרים מ- 5.3.3 לצינור 1.5 מ"ל.
    8. צנטריפוגה ב-300 x g ל-10 דקות ב-4°C. זרוק את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 200 μL של PBS.
    9. הוסף 5 μL של חוסם Fc לכל דוגמה. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    10. הוסף נוגדנים (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 ו- CD56 ב- 25 μg/mL) (טבלת חומרים) כדי להכתים PBMC.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כפקדים שליליים.
    11. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הגנה קלה.
    12. הוסף 1 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי גלולות התאים.
    13. להשעות מחדש את התאים עם 200 μL PBS. הוסף 5 μL של פרודיד פרופידיום.
    14. השתמש ציטומטריית זרימה כדי להעריך את רמת ספיגת exosome מתויג Dio באוכלוסיית משנה שונה של PBMC.

6. לבחון את הפעולה של exosomes נגזר CB-SC על מונוציטים

  1. בידוד מונוציטים אנושיים CD14 חיוביים
    1. להעביר 3 x 107 PBMC אנושי לתוך צינור 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב-300 x g ל-10 דקות ב-4°C.
    3. מקם את עמודתההפרדה (טבלת חומרים)במפריד המגנט (טבלת חומרים).
    4. לשטוף עמודות ההפרדה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של מאגר ריצה קר (טבלת חומרים).
    5. להשעות מחדש את התאים ב 300 μL של PBS קר. הוסף 60 μL של MICROBeads CD14. מערבבים היטב ותדנוד על קרח במשך 15 דקות.
    6. להוסיף 6 מ"ל של PBS קר. צנטריפוגה ב-300 x g ל-10 דקות ב-4°C.
    7. להשעות מחדש את התאים כדוריים ב 500 μL של מאגר ריצה קרה.
    8. העבר תאים לעמודת ההפרדה (שהוכן בשלב 6.14) ותן להם לעבור.
    9. שטוף את עמודת ההפרדה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של מאגר ריצה לכל שטיפה. הרם את העמודה ממפריד המגנט והמקם אותו בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
      הערה: צינור 15 מ"ל צריך להיות ממוקם על קרח בשל הדבקות של CD14 חיובי מונוציטים לצינור בטמפרטורת החדר.
    10. העבר 2 מ"ל של מאגר ריצה קר לראש העמודה ולבודד את התאים CD14 חיובי לתוך צינור 15 מ"ל.
    11. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי גלולות CD14 תאים חיוביים.
    12. להשעות מחדש את התאים עם 2 מ"ל של סרום קר מוגדר כימית חינם בינוני(טבלת חומרים).
    13. להעביר 50 μL של תאים לתוך צינור 1.5 מ"ל.
    14. כתם עם 10 μL של Krome כתום-התקהלות אנטי-אדם CD14 mAb(שולחן של חומרים)במשך 20 דקות.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כפקדים שליליים.
    15. הוסף PBS 1 מ"ל לתאים. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות לתאי כדורי.
    16. להשעות מחדש תאים ב 200 μL של PBS ולהעביר אותו צינור 5 מ"ל. לקבוע את הטוהר של מונוציטים CD14 חיובי על ידי ציתום זרימה.
  2. טיפול במונוציטים עם אקסוזומים מ-CB-SC
    1. זרע 1 x 106 מונוציטים מטוהרים עם אמצעי תרבות ללא סרום המוגדר כימית (טבלתחומרים)בצלחת 6-well שטופלה בתרבות הרקמות (2 מ"ל/באר).
    2. דגירה ל2 שעות ב 37 ° C תחת 5% CO2.
    3. השליכו את הסופרנטנט עם 1 מ"ל פיפטה. הוסף 2 מ"ל של 37 °C חימום מראש כימי מוגדר סרום חינם תרבות בינונית(טבלת חומרים)בעדינות.
      הערה: מונוציטים היו דבוקים לצלחת בתוך 2 שעות. תאים צפים זוהו כמתים או מזהמים תאים אחרים.
    4. הוסף 80 μg CB-SC נגזר exosomes מבודד לשלב 3.10 לתרביות monocyte בצלחת 6-באר עם נפח כולל של 2 מ"ל.
      הערה: אותו אמצעי אחסון של PBS נוסף כדי לשלוט בארות.
    5. דגירה ב 37 °C תחת 5% CO2 עבור 3\u20124 ימים.
    6. צלם את המורפולוגיה של התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך ב- 200× הגדלה(טבלת חומרים).
    7. ניתוק תאים על-ידי התנתקות למעלה ולמעלה ב- 1 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תא מבוסס PBS עם קצה פיפטה 1 מ"ל.
    8. לקצור את התאים המצורפים הנותרים באמצעות מגרד תאים.
      הערה: מאז מונוציטים ראשיים או מקרופאגים מובדילים לצרף בחוזקה, תאים מסוימים נשארים דבודים לתחתית לאחר הטיפול עם מאגר דיסוציאציה. לכן, תאים אלה נקטפים עם מגרד תאים.
    9. לאסוף תאים ב 1,690 x g במשך 5 דקות. להשעות מחדש תאים ב 200 μL של PBS.
    10. הוסף 5 μL של חוסם Fc (25 μg/mL) כדי לחסום איגוד לא ספציפי.
    11. הוסף נוגדנים (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 ו- CD209 ב- 25 μg/mL, טבלת חומרים)לתאים. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כשליטה שלילית
    12. הוסף 1 מ"ל של PBS לתאים וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות. היפטר מהסופרנט והשעה מחדש עם 200 μL של PBS.
    13. להוסיף 5 μL של פרודיד פרופידיום לכל מדגם (200 μL) ולהעביר תאים לצינור זרימה חדש 5 מ"ל.
    14. בצע את ציתום הזרימה והערך את רמות ביטויי CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 ו- CD209.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בתחילה, הפנוטיפ והטוהר של CB-SC נבדקו על ידי ציטומיה זרימה עם סמנים הקשורים CB-SC כגון leukocyte נפוץ אנטיגן CD45, ES תא ספציפי תמלול גורמי OCT3/4, ו SOX2. CB-SC להציג רמות גבוהות של CD45, OCT3/4, SOX2, CD270, ו ביטוי galectin 9, אבל אין ביטוי של CD34 (איור 1A). ניתוח ציטומטריית זרימה אישר את הביטוי של סמנים אקסוזום ספציפיים כולל CD9, CD81, ו CD63 היו על exosomes נגזר CB-SC(איור 1B). מורפולוגיה והתפלגות גודל של אקסוזומים התאפיינו ב- TEM ו- DLS (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יישום אקסוזומים הוא תחום מתפתח לאבחון קליני, פיתוחים תרופתיים ורפואה רגנרטיבית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לגבי הכנת exosomes CB-SC נגזר והמחקר הפונקציונלי של exosomes על ההבידול של מונוציטים אנושיים. הפרוטוקול הנוכחי הוכיח כי exosomes CB-SC פונקציונלי נגזר מבודדים על ידי צנטריפוגה רציף ultracentrifugation עם טוהר גבוה ותצוגה אפנון חיסוני על מונוציטים.

בהשוואה לפרוטוקולים קונבנציונליים אחרים, ultrafiltration היא גישה מבוססת לבידוד וטיהור של exosomes מתאי או מדיה שונים, בהתבסס על משקל מולקו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ד"ר זאו הוא מייסד של Tianhe תאי גזע ביוטכנולוגיה Inc. ד"ר זאו הוא ממציא של טכנולוגיית מחנך תאי גזע. לכל המחברים האחרים אין אינטרסים כלכליים שעשויים להיות רלוונטיים לעבודה שהוגשה.

תודות

אנו אסירי תודה למר פודדר ולמר לודוויג על תמיכה נדיבה במימון באמצעות קרן האקנסק UMC. אנו מעריכים את לורה זאו לעריכה אנגלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לפישר סיינטיפיק05-408-129
15 מ"ל צינור חרוטיפלקון352196
צלחת 24 בארותפלקון351147תרבית ללא רקמות
צלחת
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate (Dio)Millipore sigmaD4292-20MGחנות ב-4 מעלות; C
300 רשתות רשתטד פלה1GC300
50 מ"ל צינור חרוטיפלקון352070
צלחת 6 בארותפלקון353046צלחת תרבית רקמות
96 בארותפלקון353072צלחת תרבית רקמות
ACK מאגר ליזהלונזה10-548E100 מ"ל
Amicon-15 10kDa צנטריפוגה יחידת ליטרחנות Millipore sigmaUFC901024
Anti-Human AlixBiolegend634501ב-4 מעלות; C, RRID: AB_2268110
חנות Calnexin Biolegend אנטי-אנושית699401ב-4 מעלות; C, RRID: נוגדן
CD11c אנטי אנושי AB_2728519, Pe-Cy7BD Bioscience561356חנות ב-4 מעלות; C, RRID:
נוגדן CD14 אנטי אנושי AB_10611859, חנות Karma OrangeBeckman CoulterB36294ב-4 מעלות; C, RRID: נוגדן
CD163 אנטי אנושי AB_2728099,BD Bioscience556018חנות ב-4 מעלות; C, RRID: נוגדן
CD19 אנטי אנושי AB_396296, חנות PC5Beckman CoulterIM2643Uב-4 מעלות; C, RRID: נוגדן
CD206 אנטי אנושי AB_131160, חנות 551135 של FITCBD Bioscienceב-4 מעלות; C, RRID:
נוגדן CD209 אנטי אנושי AB_394065, Brilliant Violet 421BD Bioscience564127חנות ב-4 מעלות; C, RRID: נוגדן
CD270 אנטי אנושי AB_2738610, חנות PEBiolegend318806ב-4 מעלות; C, RRID:
AB_2203703 נוגדן CD3 אנטי-אנושי, חנות Pacfic BlueBiolegend300431ב-4 מעלות; C, RRID:
נוגדן CD34 אנטי אנושי AB_1595437, APCBeckman CoulterIM2427Uחנות ב-4 מעלות; C, RRID: N/
A נוגדן CD4 אנטי אנושי, APCBD Bioscience555349לאחסן ב-4 מעלות; C, RRID: נוגדן
CD45 אנטי אנושי AB_398593, חנות Pe-Cy7Beckman CoulterIM3548Uב-4 מעלות; C, RRID:
נוגדן CD56 אנטי-אנושי AB_1575969,Beckman CoulterIM2073Uחנות ב-4 מעלות; C, RRID:
נוגדן CD63 אנטי אנושי AB_131195,BD Bioscience561925חנות ב-4 מעלות; C, RRID:
נוגדן CD8 אנטי אנושי AB_10896821, חנות APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterA94686ב-4 מעלות; C, RRID: N/
A נוגדן CD80 אנטי אנושי, חנות APCBeckman CoulterB30642ב-4 מעלות; C, RRID: N
/A נוגדן CD81 אנטי אנושי, חנות FITCBD Bioscience561956ב-4 מעלות; C, RRID:
AB_394049 נוגדן CD86 אנטי אנושי, APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterB30646חנות ב-4 מעלות; C, RRID: N/
A נוגדן CD9 אנטי אנושי, חנות FITCThermoScienticMA5-16860ב-4 מעלות; C, RRID:
נוגדן גלקטין 9 אנטי אנושי AB_2538339, חנות Brilliant Violet 421Biolegend348919ב-4 מעלות; C, RRID: נוגדן
OCT3/4 אנטי אנושי AB_2716134, eFluor660ThermoScientic50-5841-82חנות בטמפרטורה של 4 מעלות; C, RRID: נוגדן
SOX2 אנטי אנושי AB_11218882, Alexa Fluor 488ThermoScientic53-9811-82חנות בטמפרטורה של 4 מעלות; C, RRID:
ערכת בדיקת חלבון BCAThermoFisher Scientific23227
סרום בקר אלבומיןMillipore SigmaA1933
מעיל באפימרכז40-60 מ"ל ליחידה
מגרד תאיםפלקון353085
קובטה חד פעמית למחצה מיקרוVWR97000590
מאגר דיסוציאציהGibco131510014100 מ"ל
שקופיות ספירת תאים כפולות ChanberBio-Rad1450015
מגיב זיהוי CD63 אקסוזום-אנושיThermoFisher Scientific10606Dחנות ב-4 מעלות; C
Ficoll-Paque PLUS צפיפות מדיה גרנדינטיתGE Health17-1440-03500 מ"ל
רוטור זווית קבועה (25°)Thermo Scientifc75003698Maxium 24,700 x g
Gallios זרימה ציטומטרבקמן קולטר3 לייזרים
10 צבע מקסימום
דם טבורי אנושיCryo-Cell International40-100 מ"ל / יחידה
אנושי Fc בלוקBD Bioscience564220חנות ב 4 & deg; C
Immun-Blot PVDF ממברנהBio-Rad1620177
Millex-GP יחידת מסנן מזרק, 0.22 ומיקרו; mMillipore SigmaSLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentrigugeבקמן קולטר
שייקר אורביטלי MP4BioExpressS-3500-1
PBSThermoFisher Scientific10010049500 מ"ל
Propidium IodideBD Bioscience56-66211Eחנות ב-4 מעלות; C
Nikon Eclipse Ti2 מיקרוסקופNikon instruments IncEclipse Ti2NIS-Elements גרסת תוכנה 5.11.02
Hochest 33342Thermo Scientifc622495 ml
Revert microsopyפישר 12563518
רוטור 41 Tiבקמן קולטר331362Maxium 41,000 סל"ד
Sorvall St 16R צנטריפוגהתרמו Scientifc75004381
מתנדנד דלי רוטורThermo Scientifc75003655
TC-20 מונה תאיםBio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 אינקובטורThermoFisher מיקרוסקופ
JEOLJEM-2100 PLUS
צינור אולטרה-צנטריפוגהבקמן Coulter331372
X'VIVO 15 סרום בינוני ללא סרוםLonzaBEBP04-744Q1000 מ"ל מדיום תרבית, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; ג
PE PE PE AB_2574479 הדם של ניו יורק מדעי אלקטרונים שידור מדעי

מקורות

  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3(2012).
  3. Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160(2013).
  4. Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
  5. Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87(2015).
  6. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  7. Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763(2018).
  8. Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
  9. Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
  10. Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165(2020).
  11. Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
  12. Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
  13. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  15. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דיפרנציאציה של מונוציטיםבידוד אקסוזומיםמונוציטים חיוביים ל-CD14סממנים של מקרופאגים M2אנליזת ציטומטריה מזרימהפרוטוקול אולטרה-צנטריפוגציהתאי גזע מדם חבלה אנושיתאים מונונוקליאריים של דם פריפריטיפול בתאי גזע מחנכים
בידול של מונוציטים לתוך מקרופאגים שונים Phenotypically לאחר טיפול עם תאי גזע דם חוט אנושי (CB-SC)נגזר אקסוזומים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.