מאמר שיטה

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

DOI:

10.3791/61589

⸱

19 בינואר 2021

 ,  , 
1Department of Biology, San Francisco State University, 2Department of Biochemistry & Biophysics, UCSF Mission Bay

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישות מודרניות בהדמיית תאים חיים כמותיים הפכו לכלי חיוני לחקר הביולוגיה של התאים, על ידי מתן אפשרות לשימוש בסטטיסטיקה ובמידול חישובי כדי לסווג ולהשוות תהליכים ביולוגיים. למרות שמערכות מודל תרבות התא נהדרות להדמיית תוכן גבוה, מחקרי תפוקה גבוהה של מורפולוגיה של תאים מצביעים על כך שתרביות vivo לשעבר מוגבלות בהצמדת המורכבות המורפולוגית שנמצאה בתאים בתוך אורגניזמים חיים. ככזה, יש צורך במערכת מודל תפוקה גבוהה מדרגית כדי תמונה תאים חיים בתוך אורגניזם שלם. מתואר כאן הוא פרוטוקול לשימוש מנתח תמונה תוכן גבוה כדי לרכוש בו זמנית קטעי וידאו מרובים זמן לשגות של התפתחות מלנוגסטר Drosophila עוברי במהלך שלב blastoderm syncytial. Blastoderm syncytial שימש באופן מסורתי נהדר במודל vivo עבור הדמיה אירועים ביולוגיים; עם זאת, השגת מספר משמעותי של משכפלים ניסיוניים עבור גישות כמותיות ותפוקה גבוהה היה עבודה אינטנסיבית ומו מוגבלת על ידי הדמיה של עובר יחיד לכל חוזר ניסיוני. מוצג כאן היא שיטה להתאים את גישות הדמיה ומיקרו-גישות כדי להתאים למערכת הדמיית תוכן גבוהה, או כל מיקרוסקופ הפוך המסוגל לרכישה אוטומטית של ריבוי נקודות. גישה זו מאפשרת רכישה בו-זמנית של 6-12 עוברים, בהתאם לגורמים רצויים לרכישה, בתוך מפגש הדמיה אחד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך 30 השנים האחרונות, ההתקדמות בטכנולוגיות הדמיה ובדיקות מולקולריות להדמיית תאים חיים קידמה את הבנתנו את המורכבות והמנגנונים הפנימיים של התא. ליווי התקדמות זו בטכנולוגיה הוא הסתמכות רבה יותר על השימוש במודלים לשעבר של תרבות תאי vivo לרכישת נתוני הדמיית תפוקה גבוהה. מודלים של תרבות התא מספקים מספר יתרונות, כולל שליטה על המיקרו-סביבה באמצעות מערכות מיקרו-נוזלים, והיכולת למצוא תאים מרובים בו-זמנית, ומאפשרים שימוש בגישות כמותיות הנחוצות להקרנה בתפוקה גבוהה1,2. עם זאת, ישנם גם חסרונות משמעותיים הקשורים מודלים תרבות התא בהקשר של מחקרים מורפולוגיים, כגון משטחי זכוכית דו מימדית או פלסטיק לייצר השפעות מבלבלות על מורפולוגיה תא ותקנהשלה 3,4,5. השפעות אלה יכולות לספק נתונים כוזבים או מטעים לגבי המחקר של תהליכים ביולוגיים ויסות מורפולוגיה תאית.

למרות החלופה הייתה ללמוד מורפולוגיה תאית בהקשר של אורגניזםשלם 6, כמה אורגניזמים מתאימים שלמים להקל על תפוקה גבוהה כמותית דימות תאים חיים בשל קשיים בשמירה על אורגניזמים שלמים בחיים באמצעות הדמיה החוצה, ואתגרים הקשורים הדמיה בתוך אורגניזם רב תאי גדול. כתוצאה מכך, מחקרים ביולוגיים של תאים באורגניזמים שלמים התמקדו בדרך כלל בהתבוננות אורגניזם יחיד לאורך זמן, אשר מגביל מאוד את גודל המדגם. בנוסף, מגבלה זו של בעל חיים אחד בכל פעם מקשה על הדמיה חיה ויקרה לשימוש בצורה של מסך ומגבילה את היכולת להחיל כלים אנליטיים כמותיים מכיוון שמספר הדגימות קטן בדרך כלל. לכן, נובע הצורך אורגניזם מודל רב תאי שיכול לשמש עבור גישות כמותיות מבוססות תוכן גבוה.

פרוטוקול זה מתאים את העובר Drosophila עבור הדמיית תוכן גבוה מבוססצלחת כדי ליצור גדלים מדגם ניסיוני גדול מספיק לניתוח כמותי. מלנוגסטר Drosophila ידוע בכינויו אורגניזם המודל הראשון. מחקר באמצעות Drosophila הוביל לפריצות דרך בביולוגיה תא מולקולרית, כולל העברת מידע גנטי, זיהוי של מסלולי איתות תא, ודרישות גנטיות שלהתפתחות עוברית 7,8,9. בנוסף, העובר Drosophila שימש כדי לחקור בדינמיקה microtubule vivoבמהלך חטיבה סלולרית 10,11,12. השימוש microinjection כדי לספק מולקולות קטנות ובדיקות מולקולריות מספק שליטה זמנית שעושה פיתוח עוברי Drosophila חזק במיוחד עבור חיטויתהליכים תאייםvivo 13,14. עם זאת, יצירת מספר משמעותי של חזרות ניסיוניות עם גישת הדמיה מסורתית היא עתירת עבודה מאוד ויש לה שימוש מוגבל במסכי הדמיה בתפוקה גבוהה וניתוח כמותי. הגישה שלנו עושה שימוש במנתח תוכן גבוה השמור בדרך כלל לניתוח תא יחיד ומסתגל בניתוח הדמיה vivo בסנכרון של Drosophila embryo המוקדם.

פרוטוקול זה שימש לאיסוף, שלב, ועוברי Drosophila microinject כדי לחקור את המנגנונים הנעים שינויים מורפולוגיים ברטיקולום אנדופלסמי (ER) במהלך מיטוזה15. למרות שמחקרים רבים תיארו את האופי הדינמי של ה-ERבמהלך מחזור התא 16,17,18,19, היה קשה להשוות את ההשפעות של סתיות מרובות לאורך זמן על מורפולוגיה של ER. כדי לזהות את הרכיבים המניעים שינויים מורפולוגיה ER על פני חלוקת תאים, השיטות המפורטות בפרוטוקול זה שימשו כדי לבדוק את התפקיד של microtubules וגורמים ציטו-שלד אחרים על ארגון מחדש של חדר ER מיטוטי באמצעות החטיבה הסינכרונית קליפתית בעובר Drosophila מוקדם. יחד, הזמינות של הפרעות גנטיות בתוך קהילת Drosophila, היכולת microinject תרופות ובדיקות מולקולריות בזמנים מדויקים במהלך הפיתוח, ואת העלות הזולה של עבודה עם Drosophila עושה גישה זו מאוד נוחה להקרנה מבוססת תמונה בתפוקה גבוהה. השיטות המתוארות כאן ישימות ללימוד מגוון רחב של תהליכים תאיים והתפתחותיים ב-vivo באמצעות עובר Drosophila 20. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מותאם היטב כדי ללמוד אירועים ביולוגיים המתרחשים על פני תקופה ממושכת ובתוך 100 מיקרון של קליפת המוח עובר Drosophila.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: עיין בטבלה 1 לקבלת מתכונים של מדיה ופתרון.

1. התקמה ותחזוקה של כלוב איסוף עוברים לניתוח חי21

  1. לאכלס כלוב איסוף עוברים טרי עם זבובים טריים.
    הערה: בעוד כלובי איסוף זמינים מבחינה מסחרית מומלצים, ניתן לבנות בקלות כלובי איסוף מבקבוקי זבוביםריקים 21.
    1. השליכו או העבירו זבובים בוגרים מבקבוקים כאשר גלמות רבות מתחילות להחשיך בשלב p14; ב 20 °C זה מתרחש כ 14 ימים לאחר הביצים כברהטילו 22.
    2. לאפשר גלם לבקוע ולאכלס את הבקבוקים במשך 12-24 שעות.
    3. מעבירים זבובים טריים לכלוב איסוף קטן באמצעות משפך קטן מעל פתח כלוב האיסוף כדי למנוע בריחה של זבובים. שלבו עד 3 בקבוקים כדי לייצר כלוב מאוכלס בצפיפות המכיל 200 עד 500 זבובים.
    4. מעבירים זבובים לכלוב האיסוף על ידי הקשה על בקבוק זבוב על משטח קשה שוב ושוב (כדי להמם את הזבובים). לאחר מכן פתח והפוך את בקבוק הזבוב מעל משפך כלוב האיסוף. הקש על הבקבוק הפתוח על כלוב האיסוף כמה פעמים כדי לזרוק זבובים לתוך כלוב האיסוף.
    5. סגור את בקבוק הזבוב הפתוח על-ידי הצבתו במהירות על התקע שלו. בעת העברת בקבוק הזבוב הפתוח מהמשפך לתקע שלו, ודא כי נקודות הפתיחה של הבקבוק כלפי מטה כמו זבובים נוטים לזחול למעלה ממקור ההקשה.
    6. לחצו על המשפך כנגד פתיחת כלוב הזבובים והקשו על הכלוב שוב ושוב על משטח קשה כדי להמם את הזבובים בפנים. מיד מוציאים את המשפך ומאבטחים צלחת ענבים טרייה לפתיחת כלוב הזבובים. השתמש בקלטת תיוג כדי לאבטח את צלחת הענבים. חזור על תהליך זה כדי לשלב עד 3 בקבוקים כדי לייצר כלוב איסוף מאוכלס בצפיפות.
      הערה: לחלופין, זבובים יכולים להיות מותים באמצעות CO2 או סוכני שינה אחרים לטוס; עם זאת, כך תגדיל את תקופת ההתאקלות בשלב 1.2.
  2. התאקלם את כלוב האיסוף החדש ל-24-48 שעות. אםנעשה שימוש ב-CO 2 או בכל מקרה שינה אחר, התאקלם את כלוב האיסוף למשך 48 שעות לפחות.
    1. החליפו את צלחת הענבים בכלוב האיסוף בצלחת טרייה המכילה דבק שמרים פעמיים ביום, 8-10 שעות זה מזה.
  3. הגדרת כלוב איסוף טרי כל 5 ימים.

2. איסוף והכנת עוברים להדמיה

  1. השגת עוברים עם התפתחות מסונכרנת
    1. החליפו את צלחת הענבים בכלוב האיסוף עם צלחת טרייה המכילה טיפה של דבק שמרים במרכז. לאפשר לזבובים להניח עוברים למשך שעה אחת. זרוק את צלחת הענבים הישנה.
      הערה: זבובים יכולים להפרות עוברים לפני הנחתם. לוחית האיסוף הראשונה תכיל רבים מהעוברים המפותחים האלה. מתן אפשרות לזבובים לזרוק עוברים ישנים תחילה ישפר את הסנכרון ההתפתחותי בין העוברים.
    2. החליפו את צלחת הענבים בצלחת חדשה המכילה טיפה של דבק שמרים במרכז ולתת זבובים להניח עוברים במשך 10 דקות. זרוק את צלחת הענבים הישנה.
      הערה: כדי להימנע מהאטת ההתפתחות העוברית על צלחות קרות, מחממים את צלחת הענבים ואת מממת השמרים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    3. החליפו את צלחת הענבים בצלחת חדשה (ללא דבק שמרים) ושמרו את צלחת הענבים הישנה, יש לה את העוברים להדמיה. במידת הצורך, המשך לאסוף עוברים מכלוב זה על-ידי חזרה על שלב 2.1.2 ו- 2.1.3.
  2. גיל לאסוף עוברים במשך 30-45 דקות כדי חטיבות syncytial תמונה23.
    הערה: כדי למצוא את שלב blastoderm syncytial בהתפתחות עוברית, העוברים חייבים להיות מותקנים ועל המיקרוסקופ בתוך 90 דקות של אוסף. בעת ניסיון פרוטוקול זה בפעם הראשונה, עוברי גיל 10-20 דקות בשלב 2.2 כדי לספק זמן נוסף להגדרה בין שלבים.
  3. עוברים מרוקנים עם 50% אקונומיקה במים DI.
    1. מעבירים עוברים מ-2.2 למאסנת של 140 ננ"מ על ידי מילוי צלחת הענבים במים DI, ניתקה בעדינות את העוברים במברשת צבע, ושפוך המים עם עוברים לתוך מסננת 140 ננ"מ(איור 1א).
      הערה: ניתן לעשות זאת מעל כיור או 1,000 מ"ל.
    2. לשטוף במרץ עוברים עם מים DI באמצעות בקבוק להשפריץ. עוברים יבשים על ידי כתמים מסננת על מגבת נייר יבשה. לסמן את מסננת עד שהוא מפסיק להשאיר סימני מים על מגבת הנייר(איור 1B).
      הערה: להסיר את כל ממסת שמרים מן העוברים כפי שהוא יכול להפוך טיפול אקונומיקה יעיל בשלב הבא.
    3. מלאו צלחת ריקה ב-10 ס"מ עם 50% אקונומיקה טרייה מדוללת עם מי DI (1:1 אקונומיקה: מים DI). טובלים את מסננת לתוך 50% אקונומיקה במשך 2 דקות 45 s. הפעל סטופר ברגע שהסננת נוגעת ב-50% אקונומיקה. למצות את מסננת פנימה והחוצה של 50% אקונומיקה 3-4x ב 15 s הראשון כדי לשבור גושי עובר(איור 1C).
    4. לשטוף במרץ עוברים עם מים DI באמצעות בקבוק להשפריץ. יבש את העוברים על ידי כתמים מסננת על מגבת נייר יבשה. חזור על תהליך שטיפה וייבוש כתם נמרץ עבור 5x(איור 1D).
      הערה: זהו השלב החשוב ביותר להסרת שריון שנשאר. השתמש בבקבוק מתיז DI מלא ולהשתמש חצי הבקבוק בשלב זה.
    5. מעבירים את העוברים המיובשים מהסננת לצלחות ענבים ב-10ס"מ באמצעות מברשת צבע 21 (איור 1E)
      הערה: dichlorination ידני יכול לשמש כחלופה אקונומיקה24.

figure-protocol-1
איור 1: פירוק העובר. (A)עוברים נאספו באמצעות בקבוק להשפריץ DI H20, מברשת צבע, מסננת 140 ננ"מ. (ב)עוברים נשפנו במרץ באמצעות בקבוק להשפריץ DI H20 וכתם יבש מעל מגבת נייר. (ג)Dechorionation של עוברים בוצע 50% אקונומיקה במשך 2 דקות ו 45 s.(D)עוברים נשופטו במרץ באמצעות בקבוק להשפריץ DI H20 כתם יבש מעל מגבת נייר. זה חזר על עצמו 4 פעמים כדי להסיר עודף chorion. (ה)עוברים הועברו לאחר מכן לצלחת ענבים 10 ס"מ באמצעות מברשת צבע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

3. הרכבת עוברים לכיסויים

  1. תחת סטריאומיקרוסקופ המצויד בתאורת צוואר אווז עילית, ארגן שתי שורות של 15-20 עוברים על קטע נקי של צלחת ענבים באמצעות כלי קוטל ביצים. ליישר את העוברים בצד הפתח שלהם באותו כיוון ביחס לקצוות הקדמיים והישובים. כדי לגרום לקוטפי ביצים לכופף פינצטה מפלדת אל-חלד לזווית של 45 מעלות. כדי לסקור את הכיוון העוברים D /V ראה קמפוס-אורטגה ואח '20.
    הערה: חשוב למשטח הגחוני לשבת על צלחת הענבים כמו העוברים יילחצו על להחליק כיסוי בשלב 3.5, חושף את פני השטח הגב להדמיה. מכיוון שמשטח הגב מחמיא הרבה יותר ממשטר השטח האוורירי, הדמיה של משטח הגב מגדילה את מספר הגרעינים הנוכחיים בתוך מטוס Z יחיד.
  2. הכן כיסוי סיליקון 75 מ"מ x 25 מ"מ.
    הערה: ניתן להכין זאת מראש. הכן מספר כריכות ואחסן אותן בתיבת שקופיות כדי לשמור על ניקיון.
    1. עקוב אחר קווי המתאר של 75 מ"מ x 25 מ"מ כיסוי על גיליון סיליקון עבה 1.6 מ"מ לגזור את spacer סיליקון באמצעות מספריים(איור 2A).
    2. באמצעות סכין גילוח, חותכים 40 מ"מ x 15 מ"מ מהספייסר (איור 2A).
    3. דבקו במכסה ובפס 10 μL של דבק הפטן במורד ההסתעפויות של זכוכית כיסוי(איור 2A).
      הערה: ההשבתה ואפילו פס יבטיחו עוברי הדמיה באותו מישור z.
  3. בעוד דבק הפטן מ שלב 3.2.3 מי מיואש, לחתוך קטע מלבני של צלחת ענבים המכיל את העוברים מ שלב 3.1.
    1. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך מלבן (קטן מ- 40 מ"מ x 15 מ"מ) סביב שתי שורות העוברים. אל תסיר את המלבן עדיין.
    2. חותכים מלבן שני ליד הראשון. הסר את המלבן השני באמצעות הצד הישר של מרית נירוסטה.
    3. בזהירות להחליק את הקצה הישר של מרית נירוסטה מתחת למלבן הראשון ולהסיר אותו (איור 2B).
  4. מניחים את צלחת הענבים עם עוברים בצד החיצוני של צלחת 3.5 ס"מ(איור 2C).
  5. תחת סטריאומיקרוסקופ, מנמיך כיסוי מוכן מעל העוברים ולחץ בעדינות על שתי שורות העוברים על הדבק(איור 2D).
  6. אם מיקרו-אינג'יקט עוברים, דלג לשלב 4.1. אם לא מיקרו-אינחז'ן תמשיך לשלב 3.7.
  7. מכסים את העוברים על ידי מילוי מפתח הסיליקון (באמצע הדרך למעלה) עם 1:1 - שמן הלוקרבון 700: שמן הלוקרבון 27.
  8. קו הקצוות התחתונים של מתאם לוח 4 שקופיות עם סרט דו-צדדי כדי למנוע את הזזת תעודת הכיסוי אך ודא שלא למקם את הקלטת בנתיב של העדשה האובייקטיבית. הקלטת הזו קריטית. אם כיסוי יושב רק על המתאם, הוא יעבור לאורך כל הרכישה. טען את תעודת הכיסוי במתאם לוח השקופיות 4.

figure-protocol-2
איור 2: הכנה והרכבה של כיסוי. (A) קווי מתאר של 75 מ"מ x 25 מ"מ כיסוי היה נעוצים גיליון סיליקון בעובי 1.6 מ"מ. השתמש במספריים כדי לגזור את קווי המתאר. 40 מ"מ x 15 מ"מ פנימ נחתכו ממחל הסיליקון ולאחר מכן הורכבו על כיסוי. פסים 15 μL במרכז המיקום. (ב)שתי שורות של 15-20 עוברים אורגנו על צלחת ענבים באזור קטן מ 40 מ"מ x 15 מ"מ, אז אזור זה נחתך באמצעות תער ומרית נירוסטה. (ג)צלחת ענבים נחתכה הונחו על גבי צלחת ריקה 3.5 ס"מ. (ד)תחת סטריאומיקרוסקופ, הכיסוי מ-(A) הורד והעוברים היו דבוקים לפס הדבק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

4. הייענות ומיקרו-תב

  1. מניחים את כיסוי עם עוברים על מגלשה כדי למנוע את החלק התחתון של כיסוי להתלכלך במהלך היסוס ומיקרו-גירוי.
    הערה: תעודת הכיסוי תצוין ללא שקופית המצורפת אליה. לכן, מיקרוסקופ הפוך נחוץ להדמיה.
  2. יש להייסד עוברים במשך 5-10 דקות, בהתאם לטמפרטורת החדר. העוברים המשמשים להדמיה בתוצאות המייצגות היו מיובשיים במשך 7 דקות ב 20 מעלות צלזיוס בתא המכיל שכבה של 1:1 של חרוזי ג'ל סיליקה על חומרייבוש (איור 3א).
  3. מיד לאחר ההיישם, מכסים את העוברים ב-1:1 - שמן הלוקרבון 700: שמן הלוקרבון 27. מלא את מספייס הסיליקון בחצי הדרך לפסגה.
    הערה: חשוב לערבב שמן הלוקרבון צמיגות גבוהה עם שמן הלוקרבון צמיגות נמוכה. שמן הלוקרבון טהור 700 (צמיגות גבוהה) מאט את התקדמות מחזורי התאים 30 דקות לאחר יישום. תערובת של 1:1 של שמן הלוקרבון 700 ושמן הלוקרבון 27 תיקנו את החפץ הזה.
  4. לטעון מחטים microinjection עם מזרק, לאחר מכן הר אחד לininjector ולחתוך אותו פתוח תחת לחץ.
    הערה: תרגל את שלב 4.4 מספר פעמים לפני ביצוע ההסתה המלאה עם כל reagents יקר. זהו הצעד הקשה ביותר בתהליך המיקרו-ציה.
    1. לטעון מחטי microinjection עם 2 μL של מזרק באמצעות קצה טעינה מורחבת. רק מחט microinjection אחד נדרש, אבל זה טוב יש מחטים טעונות רזרבי קרוב על ידי כך להכין 2 או 3 מחטים.
      הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת מפרטים על עצות טעינה מורחבות. מחטי Microinjection לא ניתן לטעון ללא טיפים טעינה מורחבת בשל האופי הייחודי של טכניקת microinjection שלנו, אשר מסתמך על בניית לחץ אוויר בתוך מחט אטומה וטעון לפני פתיחת הקצה שלה.
    2. הר מחט על המיקרו-מזרק ומדכא את הבוכנה באמצע הדרך לקצה. המטרה היא להגביר את לחץ האוויר בתוך נמת הזכוכית(איור 4A).
      הערה: השתמש microinjector שמן מינרלי בוכנה ללא שמן מינרלי. במקום לבנות לחץ עם שמן מינרלי, השתמשו בפהפה כדי לבנות לחץ אוויר.
    3. מנמיכים את מחט הזכוכית על מגלשת זכוכית וחתכו את קצה המחט לרווחה באמצעות סכין #9 חדש. חותכים את המחט בזווית של 45 מעלות כדי לייצר קצה פתוח חד. המזרק צריך לזרום למטה לתחתית הקצה מבלי לזרום מתוך המחט. בזהירות להוסיף 20 μL של שמן הלוקרבון על קצה המחט ולחתוך אותו מחדש לפתוח ב 45 מעלות. המזרק אמור להתחיל לזרום במהירות.
    4. מיד להוריד את לחץ האוויר על ידי משיכוך הבוכנה אבל להבטיח לשמור על קצב זרימה רציף כדי למנוע את המחט סותם עם קרום העובר בין זריקות. (איור4B).
      הערה: אם המזרק ברור, להציג את קצב זרימת המזרק על ידי הרמת מחט microinjection בתוך ומחוץ שמן הלוקרבון והתבוננות בקצב היווצרות עבור טיפות מזרק תחת stereomicroscope. כוונון את לחץ האוויר על ידי מדכא הבוכנה כמה קליקים בכל פעם, לאחר מכן לטבול את קצה microinjection בתוך ומחוץ שמן הלוקרבון כדי להציג את קצב היווצרות עבור טיפות חדשות לאחר התאמה.
    5. השתמש micromanipulator כדי למקם את המחט במרכז שדה התצוגה, לאחר מכן להרים את המחט באמצעות micromanipulator ולהסיר את החלקת הזכוכית מתחתיו. המחט מכוילת כעת להזרקה.

figure-protocol-3
איור 3: דיאגרמת תא היעוב. זוהידיאגרמה של תא היעבה. התא מורכב שכבה 1:1 של חרוזי ג'ל סיליקה על שכבה של יבש. כדי לבצע הישמות, עוברים הונחו על גבי מכסה צלחת באר אחת. תא ההיעוב נסגר 7 דקות.

  1. עוברי מיקרו-פרוייקט
    1. מניחים את העוברים על שלב סטריאומיקרוסקופ תחת מחט microinjection אבל לא להוריד את המחט.
    2. התמקדו בעוברים בהגדלה של פי 50.
    3. מנמיך את המחט עד שהיא מגיעה לאותו מישור מיקוד כמו העוברים. הזזת השקופית ביד אחת והפעלת microinjector עם השני, להזריק שורה אחת של עוברים.
    4. הרם את המחט וסובב את המגלשה ב-180° כדי לחשוף את השורה השנייה של העוברים למחט microinjection. מנמיך את המחט ולהזריק את השורה השנייה של עוברים.
      הערה: נסה לעשות זאת בפחות מ- 10 דקות. תשאיר כמה עוברים שלא הוזרקו לשימוש כפקדים.

figure-protocol-4
איור 4: הכנת מחט מיקרו-אינג'ין. (א)באיורזה, עוצמת המג'טנטה במחט מייצגת את לחץ האוויר. מחט טעונה הורכבה על microinjector ואת הבוכנה הורחבה 50% כדי להגביר את לחץ האוויר בתוך המחט. ודא שהנוכנה נסוגה באופן מקסימת לפני ההרכבה. (ב)קצה המחט נחתך תחת לחץ והנוכנה נסוגה כדי להקטין את לחץ האוויר ואת קצב הזרימה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

5. הדמיה על מנתח תוכן גבוה

  1. לפני הפעלת אסה זו צור מפת לוח עבור מתאם שקופיות. השתמש בעורך בעל הצלחת שנמצא בתפריט מנהל מפת לוחות כדי להזין את הממד עבור מתאם לוח מותאם אישית.
    הערה: מפת לוחות מותאמת אישית נעשתה עבור מתאם לוח זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים). מפת הלוחות מכילה את ההגדרות הבאות; עובי שקופית: 1000 μm, גובה תחתון: 1.607 מ"מ, השתנות גובה תחתון: 100 μm, חומר המצע: זכוכית, עובי מכסה: 150 μm, מיקום כיסוי: למטה – שורות: 1 – מרווח: 56.987 מ"מ, עמודות: 4 – מרווח 28.391, גודל וצורה: מלבן, רוחב 23.00 מ"מ, גובה: 73.00 מ"מ, היסט ל- A1 21.29 מ"מ – 42.74 מ"מ)
  2. טען את מתאם השקופיות במיקרוסקופ והשתמש בתכונה 'תצוגה מקדימה' כדי לתפור תמונת שדה בהיר פי 10 של הכיסוי.
  3. בחר עובר מההעליון או התחתון של השורה ולאחר מכן בחר אובייקטיבי ולעבור ל- 60x (NA 0.95). קבע חשיפה מתאימה לערוץ הפלואורסקנציה הרצוי.
    הערה: שמור על עוצמת הלייזר מתחת ל- 25% עבור הדמיית תאים חיים.
  4. בלוח המחוונים הראשי, השתמש בתכונה 'תצוגה מקדימה' כדי לתחוב תמונת פלורסנט פי 60 המכילה את שתי שורות העוברים.
  5. בלוח המחוונים הראשי, בחר בתפריט הנפתח Binning והגדר את השיכוך ל- 1 x 1 לרזולוציה מיטבית.
  6. השתמש בכרטיסיה הגדרת מחסנית z כדי להגדיר פרמטרים עבור ערימות z.
    1. בכרטיסיה הגדרת מחסנית z, השתמש בחצים למעלה ולמטה כדי לחפש ולאחר מכן להגדיר מגבלות מחסנית z עליון ותחתון. לאחר הגדרת המגבלות העליך והתחתון, בחר בסמל העיפרון הירוק כדי לשמור את מיקום מחסנית z. שים לב למיקום מחסנית z כפי שהוא ישמש בשלב 5.6.5.
    2. בכרטיסיה z Stack Setup, השתמש בתיבת הקלט z Step והגדר מרווח בין פרוסות z.
      הערה: המספר הכולל של פרוסות נקבע על-ידי פננות של שלב 5.6.1 ו- 5.6.2.
    3. בלוח המחוונים הראשי, לחץ לחיצה ימנית על ערוץ פלורסנט והשתמש בתפריט הנפתח מצב תמונה כדי להגדיר את מצב ההדמיה לתלת-ממדי.
    4. בלוח המחוונים הראשי, בחר בתיבת מיקוד אוטומטי בלייזר כדי להפוך מיקוד אוטומטי ללא זמין.
    5. בלוח המחוונים הראשי, הגדר את המוקד הראשוני עם מיקום z-stack מ- 5.6.1 ולאחר מכן בחר בתיבת המוקד הראשוני כדי להפוך את התכונה "מיקוד מחדשבכל נקודת זמן ".
  7. בכרטיסיה שדות, השתמש בתפריט הנפתח מיקום שדה כדי להפוך נקודות מותאמות אישית לזמינותולאחר מכן השתמש בחצים כדי לבחור נקודות להדמיה.
    הערה: מרווח הזמן בין רכישות (שלב 5.8) יקבע כמה נקודות מותאמות אישית ניתן למצוא בו-זמנית.
  8. בכרטיסיה סידרת זמן, בחר בתיבה רכוש סידרת זמן כדי להפוך את התכונה סידרת שעה לזמינה ולאחר מכן הגדר את המספר הכולל של נקודות זמן.
    הערה: 6 נקודות מותאמות אישית x 5 z פרוסות x 80 ערימות = 2,400 תמונות, 2,400 תמונות x 8.2 מגה-בתים לתמונה = 19.68 GB שטח דיסק.
  9. בלוח המחוונים הראשי, השתמש בתיבת קלט שם כדי לתת שם להגדרות הרכישה ולאחר מכן בחר קובץ ושמירה כדי לשמור את הגדרות הרכישה.
  10. בלוח המחוונים הראשי, בחר בלחצן סרוק כדי להפעיל את הרכישה.

6. פרסם עיבוד תמונה

  1. גרור ושחרר את קובץ ה- xdce לתוך פיג'י כדי לפתוח את סידרת התמונה כגרימת יתר רב-מימדית.
  2. שמור את hyperstack כקובץ tif.
  3. צור הקרנות בעוצמה מרה ושמור אותן כקבצי tif.
  4. להרכיב ספרייה של הקרנת עוצמה מקסימלית ולבנות צינור עבור חילוץ נתונים וניתוח.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגישה המוצגת בפרוטוקול זה שימשה כדי לבחון את התפקיד של microtubules בארגון מחדש של רשתית אנדופלסמית (ER) במהלך מיטוזה בעובר Drosophila 15. במהלך המיטוזה, המבנה של חדר ההתכונה מציג ארגון מחדש דרמטי, עם זאת, הכוחות שנוהגים בשינויים אלה אינם מובנים כהלכה. לאחרונה, משפחה של חלבוני עיצוב חדר ER הוצגו כדי לקדם את היווצרות צינורER 25,26,27,28, אשר ידועים בקרבה שלהם עם microtubules28. כדי ללמוד את גליל microtubules על מורפולוגיה ER, השיטות שסופקו בפרוטוקול שימשו כדי ליצור נתונים כדי להשוות כמותית את ההשפעות של מספר טיפולים תרופתיים microinjected על ארגון מחדש של חדר השלום במהלך מיטוזה. קולכיצין, אשר מונע פולימר מיקרוטובול חדש, נמצאה כדי להפחית באופן דרסטי את ארגון מחדש של הER במהלך המיטוזה כפי שמצג איור 5 ואיור 6. יתר על כן, הגישה המתוארת כאן אפשרה את הייצור של נתוני הדמיה הקפות זמן עבור 32 עוברים. מדידות אינטנסיביות ממוצעות ומקסימום הופקו מ-12,800 תחומי עניין באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית, אשר גם יצר נתונים סטטיסטיים תיאוריים ולא נחותים החיוניים להשוואות בין טיפולים תרופתיים. בשל הזמינות של בדיקות מולקולריות ואת הקלות של microinjections, השיטות המתוארות כאן ניתנות להתאמה בקלות ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים באמצעות כימות עוצמת פלואורסצנטית.

figure-results-1
איור 5: תמונות מייצגות של העשרה של Rtnl1-GFP ו- ReepB-GFP במוטות ציר במהלך המיטוזה. (A) שדה תצוגה 60x של ReepB-GFP במהלך מיטוזה במחזור תא 10. הריבוע הכחול מייצג את שדה התצוגה המשמש עבור לוחות B-E. לוח א' מעובד עם מסנן בינארי של סף. מסנן זה לא הוחל על לוחות B-E מאחר שהוא אינו כולל נתונים מפיקסלים מתחת לסף שנקבע. (B, D) אני לא יודע אם אני יכול לעשות את זה. ReepB-GFP בשליטה, בקולכיצין. אני לאיודע מה לעשות. Rtnl1-GFP בשליטה, ובקולכיצין. נתון זה שונה מדיאז ואח'15. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2
איור 6: כמות של העשרה Rtnl1-GFP ו- ReepB-GFP במוטות ציר במהלך המיטוזה. 20 צירים ו 20 cytoplasm ROIs על פני 10 מסגרות נותחו עבור 32 עוברים בתנאים הבאים. (A) 10% זריקות בקרת DMSO עבור Rtnl1-GFP. עוברי בקרה הראו עלייה של פי 0.1 בהעשרה (p<0.001 עבור כל הדגימות ב- T210) בהשוואה לדגימות שאינן מוזרקות (p < 0.001 עבור כל הדגימות ב- T210). (ב)עוברי ReepB-GFP מוזרקים עם 10% DMSO לשמש כשליטה. עוברי בקרה הראו עלייה של פי 0.1 בהעשרה (p<0.001 עבור כל הדגימות ב-T210) בהשוואה לדגימות שאינןמוזרקות (איור 1E; p < 0.001 עבור כל הדגימות ב- T210). (ג)עוברי Rtnl1-GFP מוזרקים עם 5 μM קולכיצין. כאן מדדנו הפחתה בהעשרת Rtnl1-GFP לתרשים (p < 0.001 עבור כל הדגימות ב- T210) בהשוואה לפקדים (A) (p < 0.001 עבור כל הדגימות ב- T210). (ד)עוברי ReepB-GFP מוזרקים עם 5 μM קולכיצין. מדדנו הפחתה בהעשרת ReepB-GFP לתרשים (p<0.001 עבור כל הדגימות ב- T210) בהשוואה לפקדים (B) (p<0.001 עבור כל הדגימות ב- T210). נתון זה שונה מדיאז ואח'15. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

1. הדבק שמרים212. צלחות ענבים213. דבק הפטן24
1.1 מוסיפים 7 גרם שמרים יבשים פעילים ל-50 מ"ל חסום. מוסיפים 9 מיליליטר של מי DI ומערבבים אפילו לקונסטרנס עם מרית מתכת.2.1 להפוך את הפתרון: להוסיף 6 גרם של אגר 140 מ"ל של מים DI בקבוקון 250 מ"ל autoclave זה.3.1 מלא בקבוקון מבריק זכוכית עם 50 אינץ' של סרט הדבקה דו-צדדי.
1.1 מוסיפים 7 גרם שמרים יבשים פעילים ל-50 מ"ל חסום. מוסיפים 9 מיליליטר של מי DI ומערבבים אפילו לקונסטרנס עם מרית מתכת.2.2 להפוך את הפתרון b: לערבב 0.1 גרם של מתיל פרבן ב 2 מ"ל של אתנול, ואז להוסיף פתרון זה 60 מ"ל של מיץ אשכוליות להתרכז.3.2 הוסף 20 מ"ל של הפטן וזכוכית חותם בקבוקון מבריק עם פרפילם. סובבו למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
2.3 מיד לאחר תמיסת אוטומציה a, מערבבים בתמיסה ב' ושופכים את התערובת ל-10 x 35 מ"מ. (עושה 35 צלחות ענבים)3.3 להסיר פסולת קלטת פלסטיק על ידי העברת דבק לתוך 2 15 מ"ל צינורות חסונים צנטריפוגות ב 3000 סל"ד במשך 15 דקות.
2.4 אפשרו ללחליות ענבים להגדיר בטמפרטורת החדר למשך הלילה עם מכסי צלחת כבויים. מכסים צלחות עם מכסים ומאחסנים ב-4C° לאחר ההגדרה.3.4 העבר דבק supernatant לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge לאחסון.

טבלה 1: מתכונים של מדיה ופתרונות.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן הוא רב-תכליתי מאוד וניתן להתאמה בקלות ללימוד אירועים ביולוגיים במגוון שלבים בהתפתחות העוברית של דרוסופילה. פרוטוקול זה מתאים היטב ללימוד תהליכים ביולוגיים המתרחשים על פני פרקי זמן ארוכים. לדוגמה, מחקרים שלהסלולר 29,30 או היווצרות של תחומים הטרוכרומטין ב Drosophila31,32 יכול להפיק תועלת מנוצל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה מאז תהליכים אלה מתרחשים על פני תקופה ממושכת של זמן. בנוסף, ניתן להגדיל את גודל המדגם על-ידי הקטנת ההגדלה כדי ללמוד שאלות הדורשות רזולוציה אופטית פחות, כגון התזמון ביןחטיבות סנכרון 33 או משך הזמן של gastrulation34.  כמו כן, יעד של פי 20 מאפשר תדמית של שני עוברים בתוך מטוס הדמיה אחד. השיטות בפרוטוקול זה מספקות פלטפורמה דינמית לשאול שאלות ביולוגיות באמצעות פיתוח עוברי כמערכת מודל לניתוח כמותי.

קיימים 3 שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. לאחר ההתנקשות ב-50% אקונומיקה זה הכרחי שהעוברים יצונו ויתייבשו במרץ 5 פעמים (2.3.4). שלב זה מסיר את כל שאריות חתיכות קטנות של כוריון. שאריות כוריון יחסמו את שדה התצוגה בעת הדמיית העובר. בעת הרכבת העוברים על כיסוי הזכוכית (3.5), חשוב ללחוץ על העוברים על הדבק בלחץ אחיד. זה ילמקם את העוברים באותו מטוס Z. בעת חיתוך לפתוח את מחט microinjection, חשוב למשוך את הבוכנה באופן מיידי כדי להתאים את קצב הזרימה של המחט או תאבד את כל המזרק שלך.

המחקר שלנו הוגבל על ידי שני גורמים. הגורם הראשון לא היה תהליך פילוח אוטומטי. עם זאת, עיצבנו סקריפט פילוח ידני באמצעות MATLAB; עם סמן ציר מקודד גנטית תהליך זה יכול להיות אוטומטי. בעתיד ברצוננו לייצר CNN-RFP21, Rtln1-GFP ו- CNN-RFP; קווים טרנסגניים ReepB-GFP כדי לאפשר פילוח ציר אוטומטי. לקבלת מידע נוסף לגבי שלנו MATLAB סקריפט וניתוח צינור, עיין בחומרים משלימים של דיאז ואח'15. שנית, היינו מוגבלים גם על ידי מרווח הרכישה שלנו של 35 s, אשר אפשר לנו רק למצוא 6 עוברים בו זמנית. מרווח רכישה ארוך יותר יאפשר לנו למצוא יותר עוברים בו זמנית. למרות תפוקת משלוח תרופות יכול להיות להגדיל על ידי החלפת microinjection עם צעד חחלה, מצאנו את זה להיות מיותר מאז גודל המדגם שלנו כבר היה מוגבל על ידי מרווח רכישה.

בעוד פרוטוקול זה שימש כדי למצוא את ההתפתחות העוברית Drosophila, הגישה הכוללת ניתנת להתאמה ללימוד התפתחות עוברית במערכות מודל רב-תאיות אחרות, כגון C. elegans, קיפודי ים, ו Xenopus. עוברים שימושיים מאוד לניתוח כמותי שכן הם מסונכרנים בקלות באמצעות איסוף או הפריה. בנוסף, עוברים אינם זזים או שוחים הרחק תחום תצוגה, ומאפשרים שימוש בתוכנה פשוטה המסוגלת לרכישת נקודות מרובות כדי להפיק סרטוני וידאו מרובים לשגות זמן לניתוח כמותי. למרות שהשתמשנו במנתח תוכן גבוה במחקר שלנו, כל מערכת מיקרוסקופ הפוכה המסוגלת להשיג ריבוי נקודות יכולה להיות מזווגת לשיטות המוזכרות בזאת.

תוצאות דומות ניתן להשיג באמצעות רכישה מרובת נקודות מסוגל מיקרוסקופ confocal הפוך; עם זאת, היתרונות של מנתח תוכן גבוה מופיעים כאחד מגדיל את גודל המדגם כדי ללמוד שאלות הדורשות פחות רזולוציה בזמן. יתרון ברור לשימוש במנתח תוכן גבוה הוא היכולת ליצור תמונה של 4 שקופיות נפרדות בו-זמנית בהשוואה לשקופית אחת במערכות מסורתיות. עם קבוצה מלאה של 4 שקופיות ו-40 עוברים בכל שקופית, ניתן למצוא 160 עוברים על פני מספר שעות, כל עוד מרווח הרכישה הוא לפחות 15 דקות בין מסגרות. יתרון חשוב נוסף בשימוש במנתח תוכן גבוה הוא שהדגימות אטומות לחלוטין ממקורות אור חיצוניים, דבר הנחוץ למדידות מבוססות עוצמה פלואורססייטית. לבסוף, מנתח התוכן הגבוה המשמש במחקר שלנו יש מצלמת CMOS 5.5 מגה פיקסל המספק שדה תצוגה נדיב 221.87 μm בהגדלה 60x. שדה תצוגה גדול זה איפשר לנו למצוא חצי עובר לכל נקודת רכישה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסופרים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UD, WFM ו-BR נתמכים על ידי המרכז לבנייה סלולרית, מרכז מדע וטכנולוגיה של הקרן הלאומית למדע (NSF), במסגרת הסכם מענק DBI-1548297. BR נתמכת גם באמצעות פרס NSF CAREER, 1553695.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 x 35 מ"מ מיקרו צלחתVWRחתול #: 10799-192N/A
100% תרכיז מיץ ענביםWelch's, 100% תרכיז מיץ ענביםN/Aרכישה במכולת
250 מ"ל צלוחיות ארלנמאייר, חתול VWR עם פה צר#: 10536-914N/A
3 אינץ' מסננת לא מתכתית מס' 140חברת גילסוןSV-165 #140N/A
4 הדמיית שקופיות מגשגרייס ביולאבסמק"ט: 400104N/A
ACROS Organics , N-Heptane, 99+%, לספקטרוסקופיהFisher ScientificCat #: AC411255000
Acros Organics, אתנול, 99.5%, מגיב ACS, אבסולוטי, 200 הוכחהFisher ScientificCat# : AC615095000N/A
Acros Organics, מתיל 4-הידרוקסיבנזואט, 99% . (מתיל פראבן)Fisher ScientificCat#: AC126961000N/A
תלוש כיסוי, מלבני, 25 x 75 מ"מ, #1 צף זכוכיתפישר סיינטיפיקחתול #: 50-143-782N/A
חומר יריעת סיליקון באר תרבית - עובי 1.6 מ"מGrace Biolabsמק"ט: 664273N/A
DWK Life Sciences Wheaton 20 מ"ל בקבוקוני נצנוץ נוזלי PETפישר סיינטיפיקחתול #: 03-341-71AN/A
כלוב איסוף עוברים-מיניג'נסי חתול מדעי#: 59-105N/A
Eppendorf Microloader טיפים לפיפטהפישר סיינטיפיקקוד מוצר: 10289651
פלקון 15 מ"ל צנטריפוגה חרוטיתפישר חתול מדעי#: 05-527-90/A
פלקון 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםפישר חתול מדעי#: 14-432-22N/A
פליישמן של פליישמן יבשים פעילים של פליישמןבמכולת
צלחות ענביםREFFER TO RECIPE PREPN/A N/A
Halocarbon 27 OilGenesee ScientificCat #: 59-133N/A
Halocarbon 700 OilGeneseeScientific Cat #: 59-131N/A
דבק הפטןREFFER TO RECIPE PREPN/AN/A
סכיני גילוח תעשייתיים (פלדת פחמן כירורגית) חד שוליים מס' 9VWRCat #: 55411-050N/A
Parafilm M סרט איטום מעבדה, 4 אינץ' x 250 רגל רולפישר סיינטיפיקחתול #: 50-998-944/A
סרט דו צדדי סקוטי עם מתקן, רוחב צר, מהונדס להדבקה, 1/2 אינץ' x 7 יארד, 3/חבילה קאדיפישר סיינטיפיקחתול #: NC0879005לא ישים
חרוזי ג'ל סיליקה, חומר ייבוש ~ 2 - 5 מ"מMillipore Sigmaמק"ט: 1077351000N / A
כף נירוסטה/מריתVWRחתול #: 470149-044N/A
W.A. Hammond Drierite המציין סופגיםפישר סיינטיפיקחתול #: 23-116582N/A
משחת שמריםהפניה להכנת מתכוןN/AN/A N/A
<חזק>ציוד
Allegra X-12 Benchtop, צנטריפוגהבקמן קולטרN/Aתזדקק לגישה לתוספות צנטריפוגות חרוטיות של 15 מ"ל.
אוטוקלאבN/AN/Aכל חיטוי יסתדר בסדר.
דראמונד Nanoject II מיקרו-מזרק.Drummond ScientificN/Aזוהי מערכת הזרקה מבוססת שמן מינרלי.
GE Healthcare IN מנתח תאים 6000.GE healthcareN/Aניתן להחליף מיקרוסקופ קונפוקלי מהיר המסוגל לרכישה מרובת נקודות.
מקרר (4C°)N/AN/Aיש לאחסן מדיה זבובה ומשחת שמרים ב-(4C°).
מיקרוסקופ סטריאו Zies Stemi 508 עם בסיס Transillumination 300 ותאורת צוואר אווז עילית.Zeiss MicroscopyN/Aבסיס התאורה ותאורת צוואר האווז נחוצים.
N רכישה של שמרים N

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zanella, F., Lorens, J., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).
  2. Jennings, B. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  3. Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7 (5), 38147(2010).
  4. Bickle, M. The beautiful cell: high-content screening in drug discovery. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).
  5. Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy based high content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
  6. Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144(2018).
  7. Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
  8. Letsou, A., Bohmann, D. Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).
  9. Sullivan, W., Theurkauf, W. The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo. Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).
  10. Schejter, E., Wieschaus, E. Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo. Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).
  11. Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos. Development. 103 (4), 675-686 (1988).
  12. Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development. Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).
  13. Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).
  14. Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
  15. Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis. PLoS One. 14 (12), 0226327(2019).
  16. Shibata, Y., et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).
  17. Bergman, Z., et al. Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo. PloS One. 10 (2), 0117859(2015).
  18. Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
  19. Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells. The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer Science & Business Media. eBook ISBN 978-3-662-22489-2 (2013).
  21. Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-087969827-0 (2000).
  22. Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
  23. Bate, M., et al. Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. Chapter 3. ISBN 978-087969899-7 (1993).
  24. Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, Academic Press. 113-123 (2001).
  25. Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
  26. Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules. Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).
  27. Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).
  28. Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network. The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).
  29. Loncar, D., Singer, S. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
  30. Mazumdar, A., Mazumdar, M. How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster. Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).
  31. Yuan, K., O'Farrell, P. TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos. Genes & Development. 30 (5), 579-593 (2016).
  32. Walther, M., et al. Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis. Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).
  33. McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos. Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).
  34. Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos. Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Time Lapse

מאמרים קשורים