מאמר שיטה

ניתוח רשת α-Actinin בקרדיומיוציטים אנושיים הנגזרים מ-iPSC באמצעות מיקרוסקופיה לתיאום מולקולה אחת

DOI:

10.3791/61605

⸱

3 בנובמבר 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היווצרות של רשת sarcomere נכונה חשובה להתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC. אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר המאפשרת הערכה כמותית של התבגרות מבנית של תאי גזע נגזר cardiomyocytes, כדי לשפר את תנאי התרבות קידום התפתחות הלב.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC היא בעיה קריטית עבור היישום שלהם בטיפול רגנרטיבי, בדיקות סמים ומידול מחלות. למרות הפיתוח של פרוטוקולי בידול מרובים, הדור של קרדיומיוציטים iPSC הדומה לפנוטיפ כמו מבוגר נשאר מאתגר. אחד ההיבטים העיקריים של התבגרות cardiomyocytes כרוך היווצרות של רשת sarcomere מאורגן היטב כדי להבטיח קיבולת התכווצות גבוהה. כאן, אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר לניתוח חצי כמותי של רשת α-actin ב cardiomyocytes. באמצעות מיקרוסקופית מקומיות פוטואקטיבית השוואה של אורך sarcomere ועובי z-disc של קרדיומיוציטים נגזר iPSC ותאי לב מבודדים רקמת יילודים בוצע. במקביל, אנו מדגימים את החשיבות של תנאי הדמיה נאותים להשגת נתונים אמינים. התוצאות שלנו מראות כי שיטה זו מתאימה לניטור כמותי של הבשלות המבנית של תאי לב ברזולוציה מרחבית גבוהה, המאפשרת זיהוי של שינויים עדינים אף יותר של ארגון sarcomere.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות לב וכלי דם (CVD) כגון אוטם שריר הלב או קרדיומיופתיה להישאר הגורם העיקרי למוות בעולם המערבי1. מכיוון שללב האנושי יש יכולת התחדשות ירודה בלבד, יש צורך באסטרטגיות לקידום ההתאוששות מ-CVDs. זה כולל טיפולים להחלפת תאים כדי לחדש את קרדיומיוציטים אבודים (CM), כמו גם את הפיתוח של תרופות אנטי-קצביות חדשות להתערבות יעילה ובטוחה בסמים. המושרה תאי גזע pluripotent (iPSC) הוצגו כמקור תא מבטיח לדור בלתי מוגבל של CM אנושי במבחנה, מתאים טיפולים רגנרטיביים, מידול מחלות, ופיתוח של תרופות הקרנה assays2,,3,,4.

למרות פרוטוקולים רבים ושונים של בידול לב קיימים, CM נגזר iPSC עדיין חסר היבטים פנוטיפיים ופונקציונליים מסוימים המנועים במבחנה וביישום vivo5,6. לצד שינויים אלקטרופיזיולוגיים, מטבוליים ומולקולריים, תהליך ההתבגרות הלברית כרוך בארגון המבני של סרקומרים, שהם היחידות הבסיסיות הנדרשות להדרת כוח והתכווצותתאים 7. בעוד CMs למבוגרים להפגין מערכת התכווצות מאורגן היטב, CMs נגזר iPSC בדרך כלל להפגין נרים סרקום פירוק, הקשורים יכולת התכווצות מופחתת דינמיקת התכווצותשונה 8,9. בניגוד ל-CM בוגר ההראה תבנית התכווצות חד-אקסיאלית, המבנים המבולבלים ב-CM לא בוגר גורמת להתכווצות רדיאלית של התא כולו או מקדמים את הופעתם שלנקודות מוקד התכווצות 9,10.

לשיפור התבגרות הלב, גישות מרובות הוחלו, כולל שיטות תרבות תא 3D, גירוי חשמלי ומכני, כמו גם את השימוש מטריצות חוץ תאיות מחקה בתנאי vivo11,12,13. כדי להעריך את ההצלחה והיעילות של תנאי תרבות שונים אלה, יש צורך בטכניקות כדי לפקח ולהעריך את מידת ההתבגרות המבנית של iPSC CM, למשל, על ידי טכניקות מיקרוסקופיות. בניגוד להדמיה קונבנציונלית, הרזולוציה במקרה של מיקרוסקופיה פוטואקטיבית לתיקליזציה (PALM) גבוהה בכ-10 פעמים. טכניקה זו בתורה מאפשרת ניתוח מדויק יותר, זיהוי שינויים עדינים אפילו של מבנים תאיים14. בהתחשב ברזולוציה גבוהה של הדמיה מבוססת PALM, המטרה הכוללת של שיטה זו הייתה הערכה מיקרוסקופית של בגרות sarcomere ב-iPSC נגזר CMs על ידי קביעה מדויקת של עובי z-Disc ואורך sarcomere. במחקרים קודמים, תכונות מבניות אלה הראו להיות פרמטרים מתאימים כדי להעריך את בגרות הלב15. לדוגמה, iPSC-CM מחלה חסר תצוגת דיסטרופין באורך מלא מופחת אורך sarcomere ורוחב z-band בהשוואה לתאי סוג בר16. כמו כן, אורך סרקומרים בודדים נמדד כדי לחקור את ההשפעה של רמזים טופוגרפיים על התפתחות הלב16. לפיכך, יישם גישה זו כדי להעריך את ההתבגרות המבנית של רשת sarcomere ב iPSC-CM על ידי מדידה כמותית של אורך sarcomere ועובי z-disc.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הצעדים בפרוטוקול זה מעורבים עכברים יילודים ומבוגרים בוצעו על פי ההנחיות האתיות לטיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק.

1. טיפוח ופירוק של קרדיומיוציטים הנגזרים מ-iPSC

  1. הבדיל hiPSC-CMs במשך 25 ימים באמצעות שיטת מונומרד דו-מיו-מיתי כמתוארקודם לכן 17.
  2. דיסוציאציה לפני המלחמה בינונית עד 37 °C ותומכת בטמפרטורת חדר בינונית עד בינונית.
  3. לשטוף תאים פעמיים עם PBS.
  4. הוסף מדיום דיסוציאציה חום מראש לתאים ותדגירה במשך 12 דקות ב- 37 °C ו- 5% CO2.
  5. הוסף אמצעי תמיכה לתאים.
    הערה: אמצעי האחסון של אמצעי האחסון שנוסף לתמיכה בינונית צריך להיות כפול מנפח אמצעי האחסון של אמצעי הדיסוציאציה המשמש בשלב 1.4.
  6. תנתקו את התאים באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל.
  7. צנטריפוגה תאים ב 200 x g עבור 5 דקות ולנוע מחדש את הכדור ב 3 מ"ל של hiPSC-CM תרבות בינוני17.
  8. תאי זרעים ב 8 תאים תחתון זכוכית גם בצפיפות תא של 75,000 תאים / באר ותרבות במשך 3 ימים.

2. בידוד קרדיומיוציט למבוגרים

  1. בידוד וטיפוח של קרדיומיוציטים בוגרים מעכברי NMRI בוצע כפי שדווח בעבר18.
  2. תאי זרעים ב 8 גם זכוכית תא שקופיות ותרבות ליום אחד.

3. בידוד וטיפוח של קרדיומיוציטים יילודים

  1. הליך בידוד של קרדיומיוציטים יילודים, שהושג מעכברי NMRI, בוצע כמתואר קודםלכן 19.
  2. זרע מבודד תא ב 8 גם זכוכית תא להחליק בצפיפות תא של 75,000 תאים / גם ותרבות במשך 3 ימים בתרבות CM יילודים בינוני19.

4. תיוג אימונו-α של רשת α-אקפטין

הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, התאים מתורתים ב-8 תאים תחתונים מזכוכית. תיוג צריך להתבצע יום אחד לפני ההדמיה.

  1. לפני המלחמה 4% PFA ב 37 °C.
  2. תקן iPSC-CM על ידי הוספת 4% paraformaldehyde ישירות למדיית התרבות (1:1 דילול) דגירה ב 37 ° C במשך 15 דקות. הריכוז הסופי של PFA עבור קיבעון הוא 2%.
  3. דגירה תאים קבועים ב 0.2% Triton-X, מדולל PBS, במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לשטוף תאים פעמיים עם PBS, 5 דקות כל אחד.
  5. הוסף 1% תמיסת BSA (מדוללת ב-PBS) ומדגם במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. להכין 150 μL של פתרון נוגדן ראשי על ידי דילול α-actinin נוגדן 1:100 ב 1% BSA, המכיל 0.05% Triton-X. מוסיפים לתאים ומעוררים בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות.
  7. לשטוף תאים פעמיים עם 0.2% פתרון BSA, 5 דקות כל אחד.
  8. להכין 150 μL של פתרון נוגדן משני על ידי דילול נוגדן אלקסה647 עיזים נגד עכבר 1:100 ב 1% BSA, המכיל 0.05% Triton-X. מוסיפים לתאים ותדנו בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות.
  9. לשטוף תאים פעמיים עם 0.2% פתרון BSA, 5 דקות כל אחד.
  10. לשטוף תאים פעמיים עם PBS, 5 דקות כל אחד. שמור תאים מסומנים בחושך ב- 4 °C עד הדמיית PALM.

5. הכנת מאגר ההדמיה PALM

הערה: חשוב להכין מחדש את מאגר ההדמיה PALM עבור כל ניסוי.

  1. להכין 50% תמיסת גלוקוז על ידי המסת 25 גרם גלוקוז ב 50 מ"ל של מים מזוקקים.
  2. הכן מאגר בסיסי המכיל 50 מ'מ טריס-HCl, 10% גלוקוז ו-10 מ"מ נתרן כלורי.
    1. כוונן את רמת החומציות ל~ 8.0 באמצעות חומצה הידרוכלורית.
  3. להכין תמיסת אוקסיד אזידז pyranose על ידי המסת 0.6 מ"ג pyranose oxidase ב 316 μL של חוצץ בסיסי.
  4. להכין פתרון קטלאז על ידי המסת 7 מ"ג של קטלאז ב 500 μL של חוצץ בסיסי. מערבבים היטב וצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 3 דקות. שמור את הסופרנטנט לשימוש נוסף. פתרון Catalase ניתן לשמור ב 4 °C במשך מספר ימים.
  5. להכין 500 μL של מאגר הדמיה PALM על ידי ערבוב 316 μL של תמיסת אוקסיד אזידז פיראנוז, 25 μL של פתרון קטלאז, 100 μL של 50% תמיסת גלוקוז, 50 μL של ציסטאמין, 5 μL של cyclooctatetraene ו 3.5 μL של β-Mercaptoethanol. הפעילות הקטאליטית הסופית של אוקסידס וקטלאז פיראנוז צריכה להיות 7.5 U, 35,00U בהתאמה.
    הערה: מאגר ההדמיה PALM מספק תנאי הדמיה אופטימליים למשך 3-5 שעות. אם יכולת ההבהוב של צבע הפלורסנט פוחתת, הכינו מאגר חדש aliquot.

6. רכישת תמונה של PALM

  1. הפעל את המיקרוסקופ לפחות 3 שעות לפני השימוש ולהביא את הדגימה לטמפרטורת החדר לפני ההדמיה כדי לאפשר שיווי משקל תרמי. אם המיקרוסקופ מצויד בתא דגירה, התאם את הטמפרטורה ל-30°C.
  2. נקה את המטרה והתחתון של החלקה התא באמצעות ממס ניקוי מתאים.
  3. הוסף 300 μL של מאגר הדמיה PALM לתוך באר אחת של תאים מסומנים והכנס את השקופית התא לתוך מחזיק הבמה של המיקרוסקופ.
  4. הגדר את הפרמטרים של רכישת תמונה PALM.
    1. בחר 1.57 N.A. 100x יעד נפט לרכישה.
    2. בחר מצב PALM והפעל את הגדרות TIRF.
    3. התאם את מספר המסגרות שיש לרכוש. בדרך כלל 5, 000-10, 000 מסגרות מספיקות כדי להשיג תוצאות אופטימליות. עם זאת, מספר המסגרות שנרכשו תלוי מאוד ביעילות התיוג וביכולת ההבהוב של צבע הפלורסנט, והמשתמש עשוי להתאים אותו.
    4. הגדר את כוח לייזר UV ל- 0.1% ו- 647 לייזר ל- 0.2%.
    5. הגדר את רמת הרווח ל- 50-100.
    6. הפעל את תאורת הלייזר ובחר תא יעד. ניתן להגדיל את רמת הרווח אם עוצמת האות נמוכה (בהתאם לתיוג פלואורסץ).)
    7. כבה את תאורת הלייזר
  5. רכישת תמונה של PALM
    1. להפחית את הרווח ל- 0 ולהגדיל את כוח הלייזר (לשעבר 647) ל- 100%.
    2. להלבין את תא היעד עבור ~ 5 s.
    3. הגדל את הרווח ל- 50 והתחיל ברכישת תמונה של PALM.
      הערה: יש לכוונן את 'רווח' כדי לקבל עוצמת אות מספקת, בעוד שיש להימנע מפיקסלים עם ערך יתר. אם עוצמת האות תפחת, הגדל את רמת הרווח.
  6. לחלופין, שפר בהתמדה את כוח הלייזר UV (0.1%-10%) כדי להגביר את עוצמת האות ולקדם את המצמוץ של הפלואורופור.

7. שחזור נתוני PALM

  1. פתח את תוכנת Image J וייבוא נתוני PALM.
  2. פתח תוסף סופתרעמים ו " הפעל ניתוח"
    1. בתפריט " הגדרתמצלמה" הזן גודל פיקסל ו- EM רווח.
      הערה: בעת שימוש ביעדי 100x ועדשת הגדלה של 1.6x, גודל פיקסל של 100 נה"מ מתאים. עם זאת, מכיוון שגודל הפיקסל תלוי בתכונות החומרה של המיקרוסקופ והמצלמה המשמשות להדמיית PALM, על המשתמשים לבדוק ולהתאים פרמטר זה בזהירות. ניתן להשיג ערכי רווח EM מהמטה-נתונים.
    2. בתפריט " הפעלניתוח" להגדיר פרמטרים כדלקמן: B-spline סדר: 3, B-סולם קו: 2.0, סף עוצמת שיא: stf (Wave.F1), רדיוס מתאים: 3, סיגמא ראשוני: 1.6, הגדלה: 5.0, תדירות עדכון: 50, משמרות לרוחב: 2 אשר על ידי לחיצה על"אישור"כפתור.
  3. ר''ר עיבוד של תמונת PALM משוחזרת
    1. בתפריט "התוויית היסטוגרמה" בחר בפרמטר "Sigma".
    2. השתמשובכלי" מלבן " לבחירת החזר השקעה, לא כולל פריטים אפשריים ולהחיל החזר השקעה על המסנן. ערכי ROI יופיעו בתיבת הפקודה של המסנן.
    3. הוסף "& אי ודאות <25" לערכי ההחזר על ההשקעה. פקודת סינון אפשרית תיראה כך: "(סיגמה > 48.6821 וסיגמא < 1117.40) ואי ודאות <25". החל ערכי סיגמא נבחרים.
    4. בתפריט "הסרת כפילויות", הזן סף מרחק של "10 נה"מ" והחיל.
    5. ב " תפריט מיזוג ",הגדר מרחקמרבי ל- "20", מסגרות מרביות לכל מולקולה ל- "0" ומקסימום מסגרות ל- "1". החל הגדרות.
    6. ב " תפריטתיקון סחף", בחר מתאם צולב והגדר "מספר סלים" ל- "5" ו - "הגדלה" ל- "5.0". החל הגדרות תיקון סחף.
    7. שמור את תמונת PALM הסופית וצא נתונים מעובדים לפוסט אם תרצה.

8. ניתוח של נרים סרקום

  1. ניתוח אורך סרקומר
    1. פתח את תוכנת Image J וייבוא תמונת PALM המושחזרת.
    2. צייר קו בין מבני סרקומר נבחרים בניצב לדיסק z כדי למדוד את המרחק הקצר ביותר בין נכי actinin.
    3. בחר "התוויהפרופיל " בתפריט "נתח" ולרכוש את האורך בין שתי פסגות. כמו אורך sarcomere עשוי להשתנות בתוך תא אחד, מינימום של 20 סרקומרים יש למדוד באזורים שונים של תא היעד.
  2. ניתוח עובי Z-Disc
    1. פתח את תוכנת Image J וייבוא תמונת PALM המושחזרת.
    2. המר את תמונת PALM המושחזרת לתמונה במצב של 8 סיביות.
    3. פתח את תוסף זיהוי הרכס והזן את הפרמטרים הבאים: רוחב קו: 20, ניגודיות גבוהה: 230, ניגודיות נמוכה: 10, סיגמה: 0.79, סף נמוך יותר: 25.84, אורך קו מינימלי: 20.
    4. הגדר "הערכת רוחב", "הרחב קו" ו "הצגת תוצאות".
    5. לחץעל" אישור " והשתמש "רוחב קוממוצע " מטבלת התוצאות לניתוחים נוספים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להערכת מידת ההתבגרות המבנית של CM, יילודים, מבוגר בוגר לחלוטין, ו- iPSC CM סומנו בתחילה CM עם נוגדן α-actinin כדי לדמיין את רשת sarcomere. לאחר רכישת PALM, התמונות שוחזרו, ועובי z-disc נמדד באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מבוססת תוסף לזיהוי אוטומטי של רוחב של ניביים בודדים. אורך Sarcomere חושב על ידי מדידת המרחק בין שתי פסגות עוצמה סמוכות, המקבילה לניבים שכנים. איור 1 מציג את ההערכה של הארגון sarcomere ב- CM הנגזר מ- iPSCs.

כפי שהוצג באיור 2A

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדור של CM פונקציונלי נגזר iPSC במבחנה חשוב עבור טיפולים רגנרטיביים, מידול מחלות ופיתוח של פלטפורמות סינון סמים. עם זאת, בגרות לא מספיקה של CM אלה הוא מכשול מרכזי במחקר לב וכלידם 20. בהקשר זה, דרושות טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרות ניטור של מצב ההתבגרות המבנית של CM הנגזר מ-iPSC. במקביל, מיקרוסקופית סופר רזולוציה יכול להיות כלי רב ערך לנתח במדויק את הפונקציה של חלבונים ספציפיים, נדרש היווצרות sarcomere נכונה כפי שהוכח לאחרונה עבור טיטין וטרופונין10,,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים לא מצהירים על ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הקרן המבנית של האיחוד האירופי (ESF/14-BM-A55-0024/18). בנוסף, H.L. נתמכת על ידי תוכנית FORUN של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק (889001 ו 889003) וקרן יוזף וקתה קלינץ (T319/29737/2017). C.I.L. נתמך על ידי תוכנית המדען הקליני של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק. R.D נתמכת על ידי ה-DFG (DA1296/6-1), קרן DAMP, קרן הלב הגרמנית (F/01/12) וה-BMBF (VIP+ 00240).

אנו מודים מדלן Bartsch על התמיכה הטכנית שלה בתרבות תאי iPSC ובידול לב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קו תאי iPSC אנושיTakaraY00325
µ-Slide 8 באר זכוכית תחתונהibidi80827
0.5 מ"ל צינור אפנדורף 30121023
אלבומין סרום בקרסיגמא אולדריץ'A906
ערכת דיסוציאציה קרדיומיוציטיםטכנולוגיות תאי גזע05025
קטלאזSigma AldrichC40-1G
CyclooctatetraeneSigma Aldrich138924-1G
CysteamineSigma Aldrich30070-10g
תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco ללא Ca2+ ו-Mg2+Thermo Fisher14190169
F(ab')2-Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647Thermo FisherA-21237
תוכנת עיבוד תמונה פיג'י (תמונה J)
גלוקוזקארל רות'X997.2
חומצה הידרוכלוריתסיגמא אולדריץ'H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 מערכתZeiss
ParaformaldehydeMerck8187150100
פירנוז אוקסידאזסיגמא אולדריץ'P4234-250UN
נוגדן סרקומרי ואלפא;-אקטינין [EA-53]Abcamab9465
נתרן כלוריסיגמא אולדריץ'S7653
מים סטרילייםקארל רות'3255.1
טריטון X-100סיגמא אולדריץ'X100
בסיס טריזמהסיגמא אולדריץ'T1503
&בטא;-מרקפטואתנולסיגמא אולדריץ'63689

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
  2. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331(2019).
  3. Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077(2018).
  4. Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73(2019).
  5. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  6. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
  7. Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
  8. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  9. Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
  10. Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  13. Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
  14. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  15. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  16. Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
  17. Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819(2020).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
  20. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  21. Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  22. Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
  23. Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
  24. Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173(2017).
  25. Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
  26. Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
  27. Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
  28. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  29. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  30. Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810(2016).
  31. Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  32. Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004(2013).
  33. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  34. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  35. Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
  36. Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
  37. McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275(2014).
  38. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  39. Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Alpha Actinin NetworkPhotoactivated Localization MicroscopySarcomere Length AnalysisZ Disc Thickness MeasurementCardiomyocyte Maturation AssessmentSuper Resolution ImagingPALM Image ReconstructionFluorescent Molecule Localization

מאמרים קשורים