מאמר שיטה

מודל ריפוי פצעים מרין וניתוח פצעים מורפומטריים היסטולוגיים

13.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61616

⸱

21 באוגוסט 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פצעים דו-צדדיים בעובי מלא בעכברים וכיצד לעקוב אחר, לקצור ולהכין את הפצעים לניתוח מורפומטרי. כלול תיאור מעמיק של אופן השימוש בסעיפים היסטולוגיים טוריים כדי להגדיר, לכמת ולזהות פגמים מורפומטריים במדויק.

תקציר

מודל הפצע ים-10-00 שימש בהרחבה כדי לחקור כל אחד מהשלבים החופפים באופן רציפה של ריפוי פצעים: דלקת, התפשטות ושיפוץ. פצעים מורין יש היסטולוגית מוגדר היטב ומיטה לזיהוי בקלות פצע שעליה שלבים שונים אלה של תהליך הריפוי הם מדידים. בתוך השדה, נפוץ להשתמש ב"אמצע" המוגדר באופן שרירותי של הפצע לניתוחים היסטולוגיים. עם זאת, פצעים הם ישות תלת מימדית ולעתים קרובות לא סימטרית היסטולוגית, התומכת בצורך בשיטה מוגדרת היטב וחזקה של כימות כדי לזהות פגמים מורפומטריים עם גודל אפקט קטן. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההליך ליצירת פצעים דו-צדדיים בעובי מלא בעכברים, כמו גם הוראה מפורטת כיצד למדוד פרמטרים מורפומטריים באמצעות תוכנית עיבוד תמונה על מקטעים טוריים נבחרים. המדידות הדו-ממדיות של אורך הפצע, אורך האפידרמיס, אזור האפידרמיס, אזור הפצע משמשים בשילוב עם המרחק הידוע בין מקטעים כדי לשער את האזור האפידרמיס תלת מימד מכסה את הפצע, אזור הפצע הכולל, נפח אפידרמי ונפח הפצע. למרות ניתוח היסטולוגי מפורט זה הוא יותר זמן ומשאבים רב מאשר ניתוחים קונבנציונליים, הקשיחות שלה מגבירה את הסבירות של גילוי פנוטיפים חדשניים בתהליך ריפוי פצע מורכב מטבעו.

מבוא

ריפוי פצעים עוריים הוא תהליך ביולוגי מורכב עם שלבים חופפים באופן רצף. היא דורשת תיאום של תהליכים תאיים ומולקולריים המוסדרים באופן זמני ומרחבי על מנת לשחזר את תפקוד המחסום של האפיתל הפגוע. בשלב הראשון, דלקת, נויטרופילים מקרופאגים נודדים לתוך הפצע, מגייסים הגנות מקומיות ומערכתיות1. מעקב וחפיפה של השלב הדלקתי הוא שלב ההתפשטות. פיברובלסטים מתחילים להתרבות במהירות ולנדוד לתוך רקמת הגרגר. Keratinocytes הרחק מהקצה המוביל להתרבות לכיוון הפצע כמו keratinocytes מובדיל בקצה המוביל לנדוד כדי לאפיתל מחדש את הפצע2. לבסוף, שלב השיפוץ וההתבגרות מתחיל, שבמהלכו פיברובלסטים ברקמת הגרגר מתחילים לסנתז ולהפקיד קולגן. השיפוץ והארגון של המטריצה החדשה יכולים להימשך עד שנה אחת בעקבות פציעה3. בשל המורכבות של אירועים חופפים מעורבים שיחה צולבת בין סוגי תאים מרובים, ולמרות שנים של מחקר, רבים מהמנגנונים הסלולריים והמולקולריים הבסיסיים ריפוי הפצע להישאר מובן היטב.

מודל העכבר הוא המודל היונקים הדומיננטי לחקירת מנגנונים של ריפוי פצעים בשל קלות השימוש שלהם, עלות נמוכה יחסיתוניפולנטיות גנטית 1,4,5. למרות סוגים שונים של פצעים תוארו במודל murine, הנפוץ ביותר הוא פצע excisional (או אגרוף דו צדדי או ביופסיה אגרוף ישיר), ואחריו מודלים פצעחתך 4. מודל הפצע excisional יש יתרון מובהק על המודל החתך כפי שהוא מטבעו יוצר רקמת שליטה שלא עברה את תהליך הריפוי. רקמת ביופסיית הפונץ' המחרוטת כחלק מהפרוטוקול הכירורגי יכולה להיות מעובדת באותו אופן כמו הרקמה הפצועה ולהשתמש בה כדי לבסס את התנאים ההמו-סטטיים לקריטריון הרצוי. רקמת בקרה excised עשוי להיות שימושי גם אם להעריך את ההשפעות של טיפול מוקדם בעור או אישור שינוי גנים מוצלח בזמן פציעה4.

ניתן להעריך פרמטרי ריפוי על ידי טכניקות רבות ושונות, כולל תכנון או היסטרולוגיה. עם זאת, planimetry יכול רק להעריך מאפיינים גלויים של הפצע, ו בשל הנוכחות של גלד, לעתים קרובות אינו תואם למדידות של ריפוי כי הם הדמיה על ידי היסטולוגיה, ובכך מה שהופך את ההיטולוגיה "תקן הזהב" שלניתוח 4. למרות ניתוח היסטולוגי להיות תקן הזהב, הוא מבוצע בדרך כלל על קבוצת משנה שרירותית שלהפצע 6,7. לדוגמה, חיתוך הפצע ב"חצי" לפני הטבעה וניתוח הפצע הוא כיום נוהג נפוץ כדי להפחית את הזמן והמשאבים שהושקעו על חומרי ניתוח נתונים וחיתוך. שיטת הניתוח המורפומטרי המתואר בפרוטוקול זה פותחה כדי להקיף את רקמת הפצע כולה, כדי לשקף במדויק את המאפיינים המורפולוגיים של הפצע, ולהגדיל את הסבירות לגילוי פגמים בריפוי פצעים עם גודל אפקט קטן. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים שיטה כירורגית ליצירת פצע murine הנפוץ ביותר, פצע כריתה בעובי מלא דו צדדי, כמו גם שיטה מפורטת וקפדנית לניתוח היסטולוגי כזה משמש לעתים נדירות בתחום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים הושלמו בהתאם לתקנות הפדרליות ומדיניות ונהלים של אוניברסיטת איווה אושרו על ידי אוניברסיטת איווה IACUC.

1. בעלי חיים ותונו

  1. השתמש בעכברים בוגרים של קו העכבר הרצוי בגיל 8-10 שבועות כאשר שלב זקיק השיער הוא בטלוגן.
  2. ביום הניתוח, להפריד עכברים לכלובים נקיים ובאופן אישי בית כדי למזער את ההפרעה הפצע.

2. כירורגיה

הערה: אין צורך לשמור על תנאים כירורגיים סטריליים. בעוד יש לנקוט טיפול כדי לשמור על עקירות בין בעלי חיים, ביופסיית הפונץ' עצמה נעשית על משטח נקי אך לא סטרילי. משך הניתוח לכל בעל חיים הוא בין 10 ל-15 דקות.

  1. ההתסה
    1. להמריד את החיה במשך 1-2 דקות בתא אינדוקציה עם מאדה isoflurane להגדיר קצב זרימה 4-5% ואת מד זרימת החמצן להגדיר על 1 ליטר לדקה. ראה דיון באפשרויות הרדמה חלופיות.
    2. אשר ההסתה תקינה לפני תחילת ההליך. עומק ההרדמה יכול להיות מאושר על ידי צביטה מוצקה.
    3. העבר את העכבר ממכל האינדוקציה לקונוס האף והפחית את קצב זרימת isoflurane ל- 1.5% ואת מד זרימת החמצן ל- 0.5 L/min.
    4. למרוח משחה אופטלמית על שתי העיניים כמו ההליך עולה על 5 דקות.
    5. שמור על טמפרטורת גוף נורמלית באמצעות משטח תרמי.
  2. הכנת אתר הפצע
    1. השתמש במקצץ גילוח חשמלי בתנועה קאודילית כדי להסיר את הפרווה בגב העכבר ברמת הכתף. הסר את השיער נמוך יותר בגב במידת הצורך בעת ביצוע יותר משני פצעים.
    2. הסר את השיער הנותר באמצעות סכין גילוח בתנוע סיבתי rostral המוחזק ב 20° מגב העכבר כדי לגלח מקרוב את האזור הקצץ(איור 1A).
    3. נקה את האזור המגולח עם ספוגית פובידון יוד.
    4. נגב את העור עם משטח סטרילי של 70% הכנת אלכוהול שופרופיל כדי להפחית גירוי עורי פוטנציאלי מספוגית היוד.
  3. פצע ופציעה
    1. צובטים את העור בין להבי הכתף לאורך קו האמצע הגבי ומשוך את כיסוי העור הסנדוויץ' מהגוף(איור 1B).
    2. מקם את העכבר על צידו עם כיסוי העור על משטח שטוח עטוף במבת נייר נקייה או שווה ערך. השתמש גיליון של שעווה דנטלית מתחת המגבת כדי להגן על פני השטח הבסיסי מפני נזק (איור 1C).
    3. מניחים את פונץ' הביופסיה בגודל הרצוי קרוב ככל האפשר לגוף ואפשרו לעור להירגע. אין למתוח את העור, או שגודל הפצע יהיה גדול יותר מגודל הניקוב המיועד(איור 1D).
    4. הכה את העור על ידי לחיצה למטה, תנועת נדנדה עשוי לשמש כדי להבטיח את כל שכבות העור משני הצדדים כבר חדרו(איור 1E). השתמש בפונץ ביופסיה חדש לכל חיה.
    5. הסר את ביופסיות הניקוב מהפצעים(איור 1F). אם יש עדיין אתרים של קובץ מצורף להשתמש במספריים סטריליים פינצטה כדי לשחרר את האגרוף מהעור שמסביב. עבדו את רקמת בקרת הביופסיה של פונץ' כנדרש בהתבסס על תוכניות במורד הזרם לניתוחי ריפוי פצעים (ראה דיון לקבלת הצעות).
    6. צלם תמונות מאקרוסקופיות ממרחק שווה לאתרי הפצע או עם סרגל במסגרת כדי למדוד את אזור הפצע הראשוני ולחסל חריגים מניתוח.
    7. ניהול משכך כאבים למשך 24 שעות לפחות בהתאם לפרוטוקול בעל חיים מאושר. לדוגמה: Buprenorphine SR-LAB, מוזרק כמנה אחת subcutaneously ב 0.5-2 מ"ג/ק"ג עבור 48 שעות של שיכוך כאבים (ראה דיון להצעות חלופיות ושיקולים).
    8. לפקח על העכבר כפי שהוא יוצא מהרדמה עד שהוא שומר על תנוחה זקופה והוא הולך כרגיל סביב הכלוב.

3. ניטור פצעים פוסט

  1. נטר עכברים מדי יום לקבלת נקודות קצה ניסיוניות כפי שנקבעו על ידי החוקר ובהתאם לתאימות לפרוטוקולים מוסדיים. דוגמאות כוללות: זיהום, ירידה במשקל גלויה, או תנוחה רכונה.
  2. צלם תמונות מאקרוסקופיות יומיות באופן מבוקר כפי שנעשה לאחר הניתוח הראשוני.

4. קצירת פצעים

  1. המתת סד לעכברים בנקודת הזמן הרצויה לאחר הפציעה בהתאם לפרוטוקול בעלי חיים מאושר.
  2. צלם תצלומים מאקרוסקופיים של אתרי הפצע באופן מבוקר העולה בקנה אחד עם רכישתתמונות קודמות( איור 2A,C).
  3. חותכים מלבן רחב סביב אתרי הפצע באמצעות אזמל(איור 2D,E).
  4. שחררו את פיסת הרקמה המלבנית באמצעות מספריים ופינצטה כדי לקלף בחזרה ולחתוך את העור מהרקמות הבסיסיות(איור 2F). מניחים בצלחת פטרי(איור 2G).
  5. לקצור את הפצעים. לקצץ עד 2 מ"מ של רקמה לא נפגעה המקיפה את כל צידי הפצע בצורה מלבנית(איור 2H, I). ראה דיון על אפשרויות חלופיות לקצור את הפצע.
  6. לעבד את הפצעים כנדרש עבור מחקרים עוקבים. שמור לפחות פצע אחד לכל עכבר להטמיע פרפין וניתוח היסטולוגי.

5. קיבעון וההטביעה של הפצע

  1. תקן את הפצע
    1. לתקן את רקמת הפצע בתמיסה חדשה מוכן 4% paraformaldehyde8 עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להעביר 4 מעלות צלזיוס לילה. מיקרוסקופאלקטרונים (EM) כיתה paraformaldehyde ו סינון פתרון אינו נדרש.
    2. לשטוף את הפצעים פעמיים במשך 30 דקות ב 1x PBS.
    3. החליפו PBS ב-70% ETOH ואחסן ב-4°C עד להטביעה. לעבד רקמות בתוך 24-48 שעות כדי למנוע אובדן אנטיגן או בתוך 1-2 שבועות אם רק הערכת מאפיינים היסטולוגיים.
  2. לעבד ולהטביע את הפצע
    1. מעבירים כל פצע לקלטת הטבעה. תווית הטבעת קלטות בעיפרון כמו התהליך יסיר צבעי דיו.
    2. לעבד את הרקמה באופן ידני או באמצעות מעבד אוטומטי על ידי התייבשות הרקמה עם הגדלת אחוזי אתנול, ניקוי עם קסילן, ולאחר מכן חדירה הרקמה עם שעוות פרפין (שולחן 1).
    3. הטבע את הפצע 90° ("עומד") מהמשטח האופקי של תבנית ההטבעה(איור 3א', ב).

6. יום 0 ניתוח אזור הפצע

  1. הורד NIH-Image J או NIH-פיג'י תוכנה חופשית (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
  2. פתח קובץ עם תמונה של יום 0 פצעים.
  3. סמן את התיבה עבור "אזור" תחת ניתוח | הגדר מידות.
  4. בחר "הגדר קנה מידה" תחת נתח. הזן את המרחק בפיקסלים, את המרחק המתאים המוכר ואת יחידת המרחק (= יחידת אורך) אם מדידות מאקרוסקופיות הן חלק מהמחקר או דלג על שלב זה אם נדרשות מדידות יחסיות בלבד.
  5. בחר "בחירות יד חופשית " בסרגלהכלים פיג'י.
  6. תאר את היקף הפצע.
  7. לחץ על מידה תחת נתח.
  8. צור גיליון אלקטרוני כדי לעקוב אחר המידות לכל בעל חיים לכל פצע.
  9. העתק את המדידה של אזור הפצע בגיליון האלקטרוני.
  10. חשב את האזור ממוצע ואת סטיית התקן של כל הפצעים לניסוי נתון.
  11. אל תכלול פצעים מחוץ לשתי סטיות תקן של המקרה מניתוח היסטולוגי.

7. מקטע טורי

  1. מצננים את בלוקי הפצע משובצים בפרפין ב-4 מעלות צלזיוס בלילה.
  2. הכנס את בלוק הפרפין על מחזיק הבלוק של המיקרוטומיה והכיוון כך שהלהב יחתוך ישר על פני הבלוק. לכוון את הבלוק כך הרקמה "עומד" ב 90° המאפשר את החלק בו זמנית של האפידרמיסוהדרמיס (איור 3C,D).
  3. להפוך 2-4 סרטים של 20-30 פרפין קטעים של 7 μm כל אחד.
  4. השתמש במברשת צבע יבשה ומחט נתגרת כדי להעביר כל סרט למשטח מוצק אך ניתן למניפולציה, כגון יריעת פלסטיק שחורה איתנה.
  5. נתק את החלק העליון של כל סרט עם סכין גילוח והישם על מגלשת מיקרוסקופ.
  6. שים לב למקטעים הלא מוכתמים תחת מיקרוסקופ brightfield כדי לקבוע אילו מהם מכילים רקמה פצועה, אשר ניתן לזהות על ידי היעדר זקיק שיער, שינויים במראה של רקמת החיבור או האפידרמיס, ו / או הנוכחות שלגלד (איור 4A,B).
  7. זרוק חלקים ללא נפגעים עד 20 חלקים לפני תחילת הפצע.
  8. מקטע דרך הפצע על ידי חזרה על שלבים 7.3 ו 7.4 עד שלא זוהה פצע בחלקים לא מוכתמים.

8. הרכבה של מקטעים פרפין

  1. מחלקי פרפין נפרדים כל 5 מקטעים עם סכין גילוח, החל ברצועת הכלים הראשונה(איור 3E).
  2. שקופיות מיקרוסקופ תוויות הן עם מספר השקופית והן עם כל מספרי המקטעים.
  3. תפוס את הקבוצה של 5 קטעים עם מברשת צבע רטובה ולהציף אותם על פני המים של אמבט מים חמים (40-45 ° C) כדי לשטח אותם.
  4. בחר את הקבוצה של 5 קטעים מתוך אמבט המים באמצעות אחת מגלשות מיקרוסקופ מתויג(איור 3F) והמקםעל סט חם שקופיות ב 37 °C עבור עד 24 שעות.
  5. אחסן את השקופיות זקוף בתיבת שקופיות.

9. כתמים היסטולוגיים

  1. מעבירים כלמגלשת מיקרוסקופ 8 (שווה ערך לכל קטע פרפין 40) למדףכתמים וכתם עם המטוקסילין ואאוסין.

10. הדמיה מיקרוסקופית

  1. רכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר המצויד ביכולות רכישה אובייקטיביות ודיגיטליות של פי 4. רטוט את קנה המידה שבו התמונה נלקחה.
  2. תמונה הפצע כולו של החלק העליון של כל שקופית מוכתמת וודא לכלול כמה רקמה לא נפגעה משני הצדדים. צלם מספר תמונות חופפות אם הפצע גדול יותר מהמסגרת של תמונה בודדת.
  3. שמור את הקובץ כולל מספר המקטע לניתוח מורפומטרי. השתמש במספר המקטע ואחריו a, b, c, וכו ' עבור תמונות חופפות של אותו פצע.

11. ניתוח מורפומטרי

הערה: כאשר הפצע משתרע על פני תמונות מרובות, סכם את המידות שנלקחו מהתמונות הבודדות כדי להשיג ערך אחד לכל מטרי לכל מקטע פצע כדי להקליט בגיליון האלקטרוני.

  1. בתמונה J, פתח קובץ דיגיטלי של תמונת פצע מוכתמת. אין להשתמש בתמונות תפורות לניתוח. בצע מדידות על תמונות חופפות עם התקרבות על-ידי איתור ציוני דרך שיש לעזוב ולאסוף מדידות מתמונה לתמונה.
  2. הגדר את העדפות קנה המידה והמדידה.
    1. בחר "הגדר קנה מידה" תחת נתח. הזן את המרחק בפיקסלים, את המרחק המתאים המוכר ואת יחידת המרחק (= יחידת אורך). קנה המידה אמור להופיע בחלון ואם להתאים את קנה המידה בו התמונה נרכשה.
    2. סמן אתהתיבה" כללי " כדי לשמור על קנה המידה זהה עבור כל תמונה פתוחה.
    3. חזור על שלבים 11.2.1 עד 11.2.2 בכל פעם ש- Image J נסגר ונפתח מחדש.
    4. סמן את התיבה עבור "אזור" תחת ניתוח | הגדר מידות.
  3. למדוד את אורך הפצע
    1. בחר "בחירות יד חופשית " בסרגלהכלים פיג'י.
    2. למדוד החל זקיק השיער האחרון של הרקמה ללא פגע בצד אחד של הפצע לזקיק השיער הראשון של הרקמה הלא פצועה בצד השני של הפצע(איור 4א', ב).
    3. עקבות לאורך צומת דרמו-אפידרמיס כדי להגיע לשני ציוני הדרך האלה. אם האפידרמיס אינו מכסה את כל הפצע, בצע את צומת dermo-epidermal בצד אחד של הפצע ואיפה הלשון הנודדת מסתיימת להמשיך בעקבות ההיבט העליון של רקמת הגרגר או הצומת בין רקמת הגרגר וגלד עד שאתה מגיע ללשון נודדת ולאחר מכן לבסוף זקיק השיער הראשון של הרקמה הלא פצועה בצד השני(איור 4E,F).
    4. תחת נתח , לחץעל מידה. אורך המדידה יופיע באותן יחידות כמו שנקבעו בקנה המידה.
    5. צור גיליון אלקטרוני כדי לעקוב אחר המידות (טבלה משלימה 1).
    6. העתק את אורך הפצע לתוך הגיליון האלקטרוני.
  4. למדוד את אורך האפידרמיס
    1. אם האפידרמיס מכסה את כל הפצע, אורך האפידרמיס זהה לאורך הפצע.
      1. העתק את המדידה "אורך פצע" לעמודה "אורך אפידרמיס" בגיליון האלקטרוני של Excel ולדלג לשלב 11.5.
    2. אם האפידרמיס אינו מכסה את הפצע כולו, בחר את "בחירות ידחופשית " ומדד את המרחק בין כל קצה מוביל אפידרמיס בעקבות ההיבט המעולה של רקמת הגרגרן או הצומת בין רקמת הגרגרן לבין גלד לזקיק השיער הראשון(איור 4C,D).
      1. תחת נתח , לחץעל מידה.
      2. הפחת מדידה זו מאורך הפצע והרשם את המספר תחת "אורך אפידרמיס" בגיליון האלקטרוני של Excel.
  5. למדוד את אזור הפצע
    1. בחר "בחירות יד חופשית " בסרגלהכלים פיג'י.
    2. למדוד החל זקיק השיער האחרון של הרקמה ללא פגע בצד אחד של הפצע לזקיק השיער הראשון של הרקמה הלא פצועה בצד השני של הפצע(איור 4A, B, E, F).
    3. מעקב לאורך ההיבט העליון של האפידרמיס (לא כוללים את גלד) או את ההיבט העליון של רקמת הגרגרן אם הפצע אינו מכוסה באופן מלא על ידי האפידרמיס.
    4. המשיכו להתחקות אנכית לאורך זקיק השיער לתוך רקמת הגרגרן ברגע שזקיק השיער הנגדי מגיע ועד לעצם השומן או לשריר. בצע את הגבול יצנון של רקמת הגרגרן לצד השני של הפצע ולהצטרף לנקודת ההתחלה לאורך זקיק השיער כדי לסגור את האזור(איור 4E,F).
    5. תחת נתח , לחץעל מידה.
    6. העתק את אזור הפצע לגיליון האלקטרוני תחת "אזור הפצע נמדד".
  6. למדוד את אזור האפידרמיס
    1. בחר "בחירות יד חופשית " בסרגלהכלים פיג'י.
    2. אם הפצע הוא אפיתל מלא:
      1. מעקב לאורך ההיבט העליון של האפידרמיס עד זקיק השיער הנגדי הוא הגיע להשלים את האזור על ידי "חוזר" לנקודת ההתחלה בעקבות צומת dermo-epidermal בין האפידרמיסוdermis (איור 4D).
      2. תחת נתח , לחץעל מידה.
      3. העתק את אזור האפידרמיס לגיליון האלקטרוני של Excel תחת "אזור אפידרמי נמדד" ולדלג לשלב 11.7.
    3. אם הפצע אינו אפיתל מלא:
      1. עקבו אחר ההיבט העילוי של האפידרמיס עד לקצה המוביל וחזרו לנקודת ההתחלה בעקבות צומת דרמו-אפידרמיס(איור 4C).
      2. תחת נתח , לחץעל מידה.
      3. חזור על שלב 11.6.3.1 ו- 11.6.3.2 בצד השני של הפצע.
      4. תחת נתח, לחץ על מידה.
      5. סכום את שני המספרים שהושגו בשלבים 11.6.3.2 ו- 11.6.3.4 והזן את התוצאה תחת "אזור אפידרמי נמדד" בגיליון האלקטרוני.
  7. חזור על שלבים 11.3 עד 11.6 בכלקטע 40 (כל שקופית8).
  8. חשב את אזור האפידרמיס של הפצע כולו.
    1. צור עמודה חדשה בגיליון האלקטרוני "אזור אפידרמי מחושב" לצד "אורך אפידרמיס".
    2. הכפל את המספר עבור "אורך אפידרמי" ב- 280 עבור כל מקטע פרט לאחרון (סעיף 7 μm עבה x 40 מקטעים).
    3. הכפל את המספר עבור "אורך אפידרמי" ב- 7 עבור המקטע האחרון (עובי המקטע).
    4. סכום את הערך של "אזור האפידרמיס מחושב" עבור כל סעיף כדי לקבל את האזור האפידרמיס של הפצע כולו.
  9. חשב את אזור הפצע של הפצע כולו.
    1. חזור על שלבים 11.8.1 עד 11.8.4 באמצעות מדידות אורך הפצע.
  10. חשב את נפח האפידרמיס של הפצע כולו.
    1. חזור על שלבים 11.8.1 עד 11.8.4 באמצעות המדידות "אזור אפידרמיס נמדד".
  11. חשב את נפח הפצע של הפצע כולו.
    1. חזור על שלבים 11.8.1 עד 11.8.4 באמצעות המדידות "אזור הפצע נמדד".
  12. חשב את אחוז נפח האפידרמיס בפצע.
    1. חלק את נפח האפידרמיס הכולל בנפח הפצע הכולל והכפל ב- 100 כדי לקבל את האחוז (אל תעשה יחס זה עבור כל מקטע).
  13. חשב את אחוז האזור האפידרמיס בין אזור הפצע.
    1. חלקו את אזור האפידרמיס הכולל באזור הפצע הכולל והכפלו ב-100 כדי להשיג את האחוז. אם פצע הוא אפיתל מלא, מספר זה צריך להיות 100.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 5 מתאר את הטווח בערכים מדודים ומחושבים שהושגו על ידי ביצוע ניתוח מורפומטרי על פצעים מסוג פראי שנוצרו בזנים שונים של העכבר על ידי מנתחים מרובים וניתחו על ידי אנשים שונים. עכברים מסוג פראי זנים שונים יכולים להציג הבדלים סטטיסטיים כמתואר הן במחקרים שלנו והןבספרות 9,10. בהתבסס על תוצאות מייצגות אלה, אנו ממליצים כי, בתוך מחקר אחד, עכברים מזן אחד בלבד ישמשו. למרות שאנו ממליצים כי אותו אדם לבצע את כל הפצעים בתוך מחקר מסוים, אנשים מרובי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מודל הפצע ים דו צדדי הוא הליך להתאמה אישית מאוד אשר יכול לשמש כדי ללמוד היבטים רבים ושונים של ריפוי הפצע. לפני תחילת פרויקט ריפוי הפצע, החוקרים צריכים לבצע ניתוח כוח כדי לקבוע את מספר הפצעים הדרושים כדי לזהות פגם בגודל אפקט מסוים. חוסר עקביות קיים בתוך הספרות על אם עכברים בודדים או פצעים צריך לשמש משכפלים ביולוגיים, עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי אין מתאם משמעותי בין שני פצעים על בעלחיים יחיד 4. הדבר מצביע על כך שפצעים מאדם יחיד אינם תלויים זה בזה ותוכלים להיחשב כמשכפלים ביולוגיים, מה שמפחית א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו אסירי תודה לכל חברי מעבדת דאנוולד שתרמו לייעול הפרוטוקול הזה לאורך השנים, וגם לג'ינה שטמן, שהתעקשותה לקדם את השימוש במקטעים סדרתיים לניתוח פצעים אפשרה את יצירתה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מ-NIH/NIAMS למרטין דנוואלד (AR067739).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100% אתנול
70% אתנול
80% אתנול
95% אתנול
הכנה לאלכוהולNOVAPLUSV910070% אלכוהול איזופרופיל
אמוניום הידרוקסיד
סטרילי רפידות ביופסיהCellpath22-222-012
יריעתשחורה משהו מוצק אך ניתן למניפולציה בגודל של גיליון נייר
מיקרוסקופעם יכולות רכישה דיגיטליות ואובייקטיבי פי 4
אפליקטורים
כיסויים22 x 60 #1
יריעות
שעווה דנטליותמצלמה דיגיטליתכלול סרגל לקנה מידה, אם רלוונטי
מחט התגרות דיסקציה (ישרה)
תבניות הטבעה22 x 22 x 12
טבעות הטבעהSimport Scientific Inc.M460
Eosin Y
חומצה
קוצץ
כרית חימוםConairלחות יבשה כרית חימום
Hematoxylin
Microtome להבי
מברשות
פרפין סוג 6
Paraformaldehyde
Permount
תמיסת חיץ פוספט (PBS)
Povidone-iodineAplicare82-255
קלטת עיבודSimport Scientific Inc.M490-2
ASR.009
להבי אזמל רגילים #10
ידית
כירורגיים חדיםסטריליים לניתוח
אגרופיםגודל כפי שנקבע על ידי החוקר
קופסאות
מחממי שקופיות שקופיות
מיקרוסקופ SuperfrostedFisher Scientific22 037 246
בקרת טמפרטורה אמבט
תחנתמינימום מתקן פרפין וצלחת קרה
מעבדמינימום תנור עם משאבת ואקום
אנטיביוטיקה משולשת
, קצהסטרילי לניתוח
פינצטה, קצהסטרילי לניתוח
WypAll X60Kimberly-Clark34865
, פלסטיק ברייטפילד עם קצה כותנהאצטית קרחוניתשיער מיקרוטום צבעסכיני גילוח אזמלמספריים ביופסיית עור שקופיותמים הטמעת רקמות רקמות פינצטה משחה אופתלמית מעוקל מחודד

מקורות

  1. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  2. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  3. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  4. Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
  5. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  6. Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
  7. Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
  8. Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
  9. Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
  10. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
  11. Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040(2012).
  12. Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
  13. Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
  14. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
  15. Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
  16. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  17. Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
  18. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  19. Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

rap

מאמרים קשורים