מאמר שיטה

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

DOI:

10.3791/61655

⸱

29 באוגוסט 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Department of Health, Animal Science and Food Safety and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano, 2Department of Veterinary Medicine, University of Sassari, 3Department of Agricultural and Environmental Sciences - Production, Landscape, Agroenergy and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים כאן שיטה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג כדי ליצור ביעילות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים, ללא צורך בטרנספקציה גנטית או בווקטורים רטרו-ויראליים. אסטרטגיה זו מבטיחה, אם כן, לרפואה תרגומית ומייצגת התקדמות ניכרת בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי הגזע.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להפוך או לשנות את הפנוטיפ של התא בשיטות שונות, עם יתרונות ומגבלות ספציפיים לכל טכניקה. כאן אנו מתארים אסטרטגיה חדשה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג, כדי ליצור תאים פלוריפוטנטיים של יונקים. נדרשים שני שלבים עיקריים. בשלב הראשון, תאים בוגרים בוגרים (ממוינים באופן סופני) נחשפים למחק האפיגנטי 5-אזה-ציטידין כדי להניע אותם למצב פלוריפוטנטי. חלק זה של הפרוטוקול פותח, בהתבסס על ההבנה הגוברת של המנגנונים האפיגנטיים השולטים בגורל התאים ובהתמיינותם, וכרוך בשימוש במשנה האפיגנטי כדי למחוק את מצב התאים המובחנים ולאחר מכן לנסוע לתוך חלון פלסטיות גבוה חולף.

בשלב השני, תאים שנמחקו עטופים במיקרו-ביוריאקטורים של פוליאטטרפלואורואתילן (PTFE), הידועים גם בשם Liquid Marbles, כדי לקדם סידור מחדש של תאים תלת-ממדיים כדי להרחיב ולשמור ביציבות על הפלסטיות הגבוהה הנרכשת. PTFE היא תרכובת סינתטית הידרופובית לא תגובתית והשימוש בה מאפשר יצירת מיקרו-סביבה תאית, שלא ניתן להשיגה במערכות תרביות דו-ממדיות מסורתיות. מערכת זו מעודדת ומגבירה את התחזוקה של פלוריפוטנטיות באמצעות רמזים הקשורים לביו-מכנוסנסינג.

ההליכים הטכניים המתוארים כאן הם אסטרטגיות פשוטות כדי לאפשר אינדוקציה ותחזוקה של מצב פלסטיות גבוהה בתאים סומטיים בוגרים. הפרוטוקול איפשר את הפקתם של תאי פלסטיות גבוהה בכל מיני היונקים שנבדקו. מכיוון שהיא אינה כרוכה בשימוש בטרנספקציה של גנים והיא נקייה מווקטורים ויראליים, היא עשויה לייצג התקדמות טכנולוגית בולטת עבור יישומי רפואה תרגומית. יתר על כן, מערכת המיקרו-ביו-ריאקטורים מספקת התקדמות משמעותית בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי גזע על ידי יצירה מחדש במבחנה של מיקרו-סביבה ספציפית המאפשרת תרבית ארוכת טווח של תאים בעלי פלסטיות גבוהה, כלומר ESCs, iPSCs, תאים שנמחקו אפיגנטית ו-MSCs.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך העשורים האחרונים, הרעיון המקובל של התקדמות חד-כיוונית לעבר מחויבות והתמיינות של תאים שונה לחלוטין. הוכח כי ניתן להפוך את אפיון התא, וניתן לדחוף תא ממוין סופני לעבר מצב פחות מחויב ומתירני גבוה יותר, בשיטות שונות.

בין מספר השיטות המוצעות, אחת השיטות המבטיחות ביותר כוללת שימוש בתרכובות כימיות כדי לגרום לתאים למה שמכונה פלוריפוטנטיות המושרה כימית. המולקולות הקטנות המשמשות בגישה זו מסוגלות לקיים אינטראקציה ולשנות את החתימה האפיגנטית של תא בוגר בוגר, תוך הימנעות מהצורך בכל וקטור מהונדס ו/או ויראלי 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . מחקרים רבים הראו לאחרונה כי ניתן להעביר תאים מפנוטיפ אחד למשנהו על ידי מתן גירויים ביוכימיים וביולוגיים ספציפיים המעוררים הפעלה מחדש של גנים היפר-מתילים 11,12,13,14,15. אירועים אלה של דה-מתילציה מאפשרים המרה של תאים ממוינים סופניים לאב פרימיטיבי, רב-פוטנטי או לתא בעל פלסטיות גבוהה/פלוריפוטנטית 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

במקביל, מחקרים רבים התמקדו לאחרונה בהבנת רמזים הקשורים למכנוזנסינג, ובאופן ספציפי יותר, באפשרות להשתמש בכוחות מכניים כדי להשפיע ישירות על פלסטיות ו/או התמיינות של תאים 16,17,18,19. ואכן, הוכח בבירור כי המטריצה החוץ-תאית (ECM) ממלאת תפקיד מפתח בשליטה על גורל התא. בפרט, האותות הביומכניים והביו-פיזיקליים המיוצרים על ידי ECM מווסתים ישירות את המנגנונים המולקולריים ואת מסלולי האיתות, ומשפיעים על התנהגות התאים ועל תפקודיהם20,21. נתונים עדכניים אלה סללו את הדרך לפיתוח מערכות תרביות תלת-ממדיות חדשניות המחקות באופן הדוק יותר את המיקרו-סביבה של תאי in vivo, ומשכפלות גירויים מכניים ופיזיים המניעים את התנהגות התאים.

כאן אנו מתארים פרוטוקול דו-שלבי המשלב את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג, כדי ליצור תאים פלוריפוטנטיים של יונקים. בשלב הראשון, התאים מודגרים עם מולקולת הדה-מתילציה 5-אזה-ציטידין (5-aza-CR). סוכן זה מסוגל לגרום לדה-מתילציה גלובלית משמעותית של הדנ"א באמצעות השפעה משולבת של הפעולה הישירה של עשר-אחת-עשרה טרנסלוקציה 2 (TET2) בתיווך 8,10 והעיכוב העקיף של מתיל-טרנספראזות הדנ"א (DNMT)22,23. שלב זה גורם להסרת הבלוקים האפיגנטיים עם הפעלה מחדש לאחר מכן של ביטוי גנים הקשורים לפלוריפוטנטיות, ולכן, יצירת תאים בעלי פלסטיות גבוהה 1,2,3,8,10, להלן "תאים שנמחקו אפיגנטית". בשלב השני, התאים עטופים במערכת תרבית תלת-ממדית. לשם כך, התרכובת הסינתטית ההידרופובית הלא תגובתית polytetrafluoroethylene (PTFE; עם גודל חלקיק של 1 מיקרומטר) משמשת כמיקרו-ביוריאקטור, המאפשרת יצירת מיקרו-סביבה תאית שאינה ניתנת להשגה באמצעות שימוש במערכות תרבית דו-ממדיות מסורתיות10. חלקיקי אבקת ה-PTFE נצמדים לפני השטח של טיפת הנוזל שבה התאים נתלים מחדש ומבודדים את ליבת הנוזל מהמשטח התומך, תוך שהם מאפשרים חילופי גזים בין הנוזל הפנימי לסביבה24 שמסביב. "מיקרו-ביוריאקטור PTFE" שהתקבל כך, הידוע גם בשם "שיש נוזלי", מעודד את התאים לקיים אינטראקציה חופשית זה עם זה, מקדם סידור מחדש של תאים תלת-ממדיים 25,26,27, ומרחיב ושומר ביציבות על מצב הפלסטיות הגבוהה הנרכשת למרות רמזים הקשורים לביו-מכניזנסינג10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מילאנו. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן, שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (NIH). בידוד תאים אנושיים מאנשים בוגרים בריאים אושר על ידי הוועדה האתית של אוספייל מג'ורה פוליקליניקו, מילאנו. כל השיטות במחקר שלנו בוצעו בהתאם להנחיות המאושרות.

1. בידוד פיברובלסט בעור

הערה: ניתן ליישם את כל ההליכים המתוארים להלן על פיברובלסטים המבודדים ממיני יונקים שונים, כולל עכברים, חזירים ובני אדם. תאי מורין בודדו מעכברים זכרים בני 7 שבועות ורקמת עור חזירית נאספה בבית המטבחיים המקומי. תאים אנושיים בודדו מחולים מבוגרים, לאחר הסכמה מדעת בכתב.

  1. מכינים תמיסת ג'לטין חזירי 0.1%.
    1. שוקלים 0.1 גרם של ג'לטין חזירי וממיסים אותו ב-100 מ"ל מים. לעקר את תמיסת הג'לטין על ידי אוטוקלאב לפני השימוש.
    2. מצפים צלחת פטרי 35 מ"מ עם 0.1% ג'לטין חזירי על ידי הוספת 1.5 מ"ל של הפתרון המוכן. דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
  2. חותכים ביופסיות עור של יונקים (עכברים, חזירים ובני אדם) באורך של כ-2-5 ס"מ ומניחים אותן בתמיסת הפוספט (PBS) של Dulbecco המכילה 2% תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית. יש לאחסן בטמפרטורה של + 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    הערה: אוספי ביופסיה חייבים להתבצע בהסכמה ולאחר אישור ועדת האתיקה, בהתאם להנחיות שנקבעו.
  3. שטפו באופן נרחב את הביופסיות שנאספו שלוש פעמים ב-PBS סטרילי טרי המכיל 2% תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית.
  4. אספו ביופסיות מהשטיפה האחרונה והכניסו אותן לתוך צלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ. השתמשו באזמל סטרילי כדי לחתוך אותם לחתיכות בגודל של כ-2 מ"מ3 .
  5. בתום דגירה של 2 שעות, יש להסיר את עודף תמיסת הג'לטין מצלחת פטרי 35 מ"מ (המתוארת בשלב 1.1.2), ובאמצעות פינצטה כירורגית סטרילית, יש להניח מיד 5-6 שברי עור בכל תבשיל תרבית מצופה מראש.
  6. הרטיבו את השברים על ידי הוספת 100 μL טיפות של מדיום בידוד פיברובלסט (טבלה 1) מעל כל אחד מהם. תרבית ב 37 °C (84 °F) בחממתCO 2 5 %.
    הערה: כדי למנוע מהמדיום להתאדות, הניחו את צלחת הפטרי בקוטר 35 מ"מ בתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ ומעלה המכילה מים סטריליים. הקפידו לכסות את שתי מנות הפטרי.
  7. לאחר 24 שעות של תרבית, בדוק את כמות המדיום בצלחת פטרי תרבית 35 מ"מ. במידת הצורך, הוסיפו 500 μL של מדיום בידוד פיברובלסט כדי לשמור על הרטבת השברים.
  8. הסירו בזהירות את המדיום ורעננו אותו לפחות כל יומיים של תרבות באמצעות פיפטה.
  9. כאשר פיברובלסטים מתחילים לצמוח מתוך שברי העור המונחים בצלחת פטרי 35 מ"מ (המתוארת בשלב 1.5.) ומתחילים ליצור מונולאייר של תאים (בדרך כלל 6 ימים). הסר את חתיכות העור באמצעות פינצטה כירורגית סטרילית ותרבית ב-2 מ"ל של מדיום בידוד פיברובלסט.
  10. יש להמשיך ולתרבת את חד שכבת התא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 עד ל-80% מפגש ורענון בינוני כל יומיים.

2. תרבית תאים ראשונית פיברובלסטים

  1. כאשר פיברובלסטים מגיעים ל-80% מפגש, הסירו בזהירות את מדיום הבידוד הפיברובלסט ושטפו תאים שלוש פעמים עם 3 מ"ל של PBS המכילים תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית של 1%.
  2. לניתוק תאים, יש להוסיף 600 μL של תמיסת 0.25% טריפסין-EDTA בצלחת התרבית ולדגום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
  3. הוסיפו 5.4 מ"ל של מדיום תרבית פיברובלסטים כדי לנטרל טריפסין כאשר התאים מתחילים להתנתק מצלחת התרבית (טבלה 1).
  4. היפטרו מהתאים על ידי צנרת חוזרת ועדינה. תאי צלחת במנות תרבית חדשות (ללא ג'לטין), תוך שמירה על יחס המעבר בין 1:2 ל-1:4 (תלוי בקצב הגדילה).
    הערה: צנטריפוגה אינה הכרחית.
  5. לשמור על תאים בתרבית ולהחליף מדיום כל יומיים, עד שהם מגיעים ל-80% מפגש ומעבירים אותם.
    הערה: הפץ פיברובלסטים פעמיים בשבוע כדי לשמור על צמיחה נמרצת.

3. חשיפה פיברובלסטית ל-5-aza-CR

  1. הכן פתרון מלאי טרי של 1 mM 5-aza-CR.
    1. שקלו 2.44 מ"ג של 5-אזה-CR והמיסו אותו ב-10 מ"ל של גלוקוז גבוה ב-DMEM. החייאת האבקה על ידי מערבולת. לעקר את הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
      הערה: יש להכין פתרון מלאי 5-aza-CR מיד לפני השימוש.
    2. הכן פתרון עבודה 5-aza-CR על ידי דילול 1 μL של תמיסת מלאי 5-aza-CR (3.1.1.) ב-1 מ"ל של מדיום תרבית פיברובלסט.
      הערה: הריכוז של פתרון עבודה 5-aza-CR הוא 1 μM 1,2,3,8,9.
  2. נסה את התאים כפי שתואר קודם לכן (2.1.-2.3.) ופרק תאים על ידי צנרת חוזרת ועדינה.
  3. אספו את מתלי התא והעבירו אותו לצינור חרוטי.
  4. ספירת תאים באמצעות תא ספירה תחת מיקרוסקופ אופטי בטמפרטורת החדר. חשב את נפח המדיום הדרוש להשעיית תאים מחדש כדי לקבל 4 x 104 תאים ב-30 μL של מדיום תרבית פיברובלסט בתוספת 1 μM 5-aza-CR (ראה שלב 3.1.2.).
    הערה: הנוסחה שיש להשתמש בה תלויה בסוג הספציפי של התא.
    figure-protocol-1
  5. צנטריפוגה את מתלה התא ב 150 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את גלולת הסופר-ננטנט וההחייאה עם מדיום תרבית הפיברובלסט בתוספת 1 μM 5-aza-CR (ראה שלב 3.1.2.). עבור נפח המדיום של תרבית פיברובלסט לשימוש ראה שלב 3.4.
    הערה: כבקרה שלילית, תאי החייאה מפרסמים את אותו ריכוז במדיום תרבית פיברובלסטים ללא 5-aza-CR וממשיכים עם אנקפסולציה של תאים באבקת PTFE (שלב 4.1.-4.13.).

4. אנקפסולציה פיברובלסטית במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE

  1. מלאו צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ באבקת פוליאטראפלואורואתילן (PTFE) כדי לייצר מיטה (איור 1A).
    הערה: השתמש בצלחות פטרי בקטריולוגיות 35 מ"מ כדי למנוע הידבקות שיש נוזלית. על מנת לקבל מעטפת הידרופובית ונקבובית דקה, השתמש באבקת PTFE עם גודל חלקיק ממוצע של 1 מיקרומטר ומיוצרת עם טחינה מקסימלית של 2.0 NPIRI. זה מאפשר יצירת גולות נוזליות חדירות בגז. יתר על כן, הציפוי השקוף מאפשר תצפית על תהליכי צבירה של תאים בזמן אמת גודל חלקיקים גדול יותר מוביל לפולידיספרסיות גבוהה שיכולה לגרום לאידוי מוגבר, עיוות ואובדן הצורה הכדורית, והתמוססות מוקדמת של המיקרו-ביוריאקטורים.
  2. מחלקים 30 μL טיפה בודדת המכילה 4 x 104 תאים (ראו שלבים 3.4.-3.5.) על מצע האבקה (איור 1B).
  3. סובבו בעדינות את צלחת ה-Petri בקוטר 35 מ"מ בתנועה מעגלית כדי להבטיח שאבקת PFTE תכסה לחלוטין את פני השטח של טיפת הנוזל כדי ליצור מיקרו-ביו-ריאקטור משיש נוזלי (איור 1C).
  4. הרימו את המיקרו-ביו-ריאקטור משיש נוזלי באמצעות קצה פיפטה של 1,000 μL, שנחתך בקצה, כדי להתאים לקוטר השיש (איור 1D,E). צלחת המיקרו-ביו-ריאקטור משיש נוזלי על צלחת פטרי בקטריולוגית נקייה כדי לייצב אותה (איור 1F).
    הערה: כדי ליצור חיכוך לאחיזת השיש בתוך הקצה, חתכו את קצות הפיפטה בקוטר של מעט פחות מקוטר השיש הנוזלי.
  5. העבירו את המיקרו-ביוריאקטור משיש נוזלי מצלחת הפטרי לצלחת של 96 בארות (שיש/באר אחת) (איור 1G).
  6. לאט לאט להוסיף 100 μL של מדיה משולי הבאר. המיקרו-ביו-ריאקטור מתחיל לצוף על גבי המדיה (איור 1H).
    הערה: המיקרו-ביו-ריאקטור נשבר במגע ישיר עם נוזל, עקב ההפרעה להידרופוביות של PTFE. כגישה חלופית, ניתן למקם את המיקרו-ביוריאקטורים משיש נוזלי בנפרד בצלחת תרבית בקטריולוגית של 35 מ"מ. במקרה זה, על מנת למנוע אידוי שיש נוזלי, יש להחדיר את צלחת הפטרי 35 מ"מ המכילה את המיקרו-ביוריאקטור לצלחת פטרי 100 מ"מ, שבעבר הוטבעה במים סטריליים
  7. אינקובציה של מיקרו-ביוריאקטור משיש נוזלי למשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% CO2 1,2,3,8,9.
    הערה: גודל חלקיק ה-PTFE של 1 מיקרומטר יכול להבטיח חילופי גזים אופטימליים בין הנוזל הפנימי לסביבה שמסביב.
  8. לאחר דגירה של 5-aza-CR במשך 18 שעות, אספו את המיקרו-ביוריאקטור משיש נוזלי באמצעות חתך קצה פיפטה של 1,000 μL בקצה (ראו שלב 4.5).
  9. מקם את המיקרו-ביוריאקטור בצלחת פטרי בקטריולוגית חדשה בקוטר 35 מ"מ (איור 1D-F).
  10. השתמש במחט כדי לנקב את השיש הנוזלי ולשבור אותו.
  11. ספרואידים שנוצרו משוחזרים עם קצה פיפטה של 200 μL, שנחתך בקצה, תחת סטריאומיקרוסקופ (איור 1I,J).
    הערה: תאים שנמחקו באופן אפיגנטי עטופים ב-PTFE יוצרים מבנה כדורי תלת-ממדי (צבירה אחת בכל שיש נוזלי).
  12. כדי להעריך את הרכישה של מצב פלוריפוטנטי בתגובה ל-5-aza-CR, בדקו את תחילת ביטוי הגנים הקשורים לפלוריפוטנטיות, OCT4, NANOG, REX1 ו-SOX2, על ידי PCR איכותי (טבלה 2).
  13. המשך עם השלב השני של הפרוטוקול כמתואר להלן.

5. תרבית במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE של תאים שנמחקו אפיגנטית

  1. הכינו מדיום תרבות ESC טרי (טבלה 1).
  2. העברת אורגנואידים בצלחת פטרי המכילה מדיום ESC לשטיפת שאריות 5-aza-CR (ראה שלבים 5.1.-5.2.).
  3. הכינו צלחת פטרי בקטריולוגית חדשה בקוטר 35 מ"מ המכילה מצע אבקת PTFE (ראו גם שלב 4.1).
  4. מחלקים אורגנואיד יחיד בטיפה של 30 μL מדיום תרבית ESC על מצע האבקה באמצעות קצה פיפטה של 200 μL, שנחתך בקצה (ראו שלבים 4.9.; 5.3.).
  5. סובבו בעדינות את צלחת הפטרי בקוטר 35 מ"מ בתנועה מעגלית כדי ליצור מיקרו-ביו-ריאקטור חדש משיש נוזלי, הרימו אותה באמצעות קצה פיפטה של 1,000 μL, נחתכו בקצה, והניחו את המיקרו-ביוריאקטור החדש שנוצר לתוך באר של צלחת בת 96 בארות (שיש/באר אחת) (ראו שלבים 4.3.-4.6).).
  6. כדי להציף את המיקרו-ביוריאקטורים, הוסיפו 100 μL של מדיה משולי הבאר כדי לרחוץ לאט את השיש (ראו הערה 4.7)."
  7. מיקרו-ביוריאקטורים משיש נוזלי תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 של 5% למשך זמן רב ככל שנדרש. שינוי בינוני כל יומיים, בעקבות ההליך המתואר ב 5.3.-5.7.
    הערה: בכתב היד הנוכחי, מסופקות תוצאות המתקבלות עם תרבית אורגנואידים במשך 28 ימים. עם זאת, במידת הצורך ניתן לבצע תקופת תרבות ארוכה יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את כל השלבים שיש לבצע כדי ליצור ולתחזק ביציבות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים מתאים סומטיים בוגרים. שיטה זו הצליחה עם פיברובלסטים שבודדו ממיני יונקים שונים, כלומר עכברים, חזירים ובני אדם. התוצאות הייצוגיות כאן המדווחות מתקבלות מכל קווי התאים, ללא קשר למיני המוצא.

ניתוחים מורפולוגיים מראים כי לאחר דגירה של 18 שעות עם חומר הדה-מתילציה 5-אזה-CR, פיברובלסטים עטפו במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE (3D Post 5-aza-CR) הצטברו ויצרו מבנים כדוריים תלת-ממדיים המציגים גיאומטריית גודל אחידה, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך העשורים האחרונים, מספר מחקרים התמקדו בפיתוח אסטרטגיות להחזרת תא מובחנות סופנית לעבר מצב פחות מחויב ומתירני גבוה יותר. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ייצור ותחזוקה ארוכת טווח של תאים פלוריפוטנטיים החל מתאים בוגרים בוגרים שהתמיינו באופן סופני. השיטה משלבת שני שלבים בלתי תלויים הכוללים אינדוקציה של מצב מתירני גבוה אשר מושג באמצעות מחיקה אפיגנטית כימית ותחזוקתו לאחר מכן מובטחת באמצעות מערכת תרבית תלת-ממדית.

היווצרותם של מבנים ספרואידיים תלת-ממדיים שנצפו בתאים עטופים ב-PTFE (...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי קרן Carraresi ומזהה מרכז המזון MiND: 1176436. כל המחברים הם חברים ב- COST Action CA16119 In vitro 3-D סה"כ הדרכה וכושר תאים (CellFit).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M7522רכיב של מדיום ESC
5-אזציטידיןסיגמא-אולדריץ'A23855-aza-CR, למחיקת פיברובלסטים אפיגנטית
אדנוזיןסיגמא-אולדריץ'A4036רכיב של תערובת נוקלאוזידים
לתמיסה אנטיביוטית בינונית ESC (100 ופעמים;)Sigma-AldrichA5955רכיב של פיברובלסטים ומדיה ESC
CFX96 בזמן אמת PCRBio-Rad LaboratoriesNAThermal cycler עבור PCR כמותי
CytidineSigma-AldrichC4654רכיב של תערובת נוקלאוזידים עבור מדיום ESC
DMEM, גלוקוז גבוה, פירובטThermo Fisher Scientific41966052לבידוד פיברובלסטים ומדיום
תרביתDMEM, גלוקוז נמוך, פירובטתרמו פישר 31885023 מדעיעבור ESC בינוני
Dulbecco' s פוספט חוצץ מלחSigma-AldrichD5652PBS; לביופסיה ושטיפת תאים ולהכנת תמיסה
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification KitThermo Fisher Scientific61021mRNA estraction
ESGRO Recombinant Mouse LIF חלבוןSigma-AldrichESG1106רכיב של ESC
בינוני סרום בקר עוברי, מוסמך, מומת בחוםThermo Fisher Scientific10500064 רכיב של פיברובלסטים ומדיה ESC
FGF-Basic (AA10-155) חלבון אנושי רקומביננטיתרמו פישר PHG0024 מדעירכיב של ג'לטין בינוני ESC
מעור חזירסיגמא-אולדריץ'G1890לציפוי צלחת
GeneAmp PCR מערכת 2700יישומי ביוסיסטמסNAתרמי מחזור למתילציה של DNA גלובלי PCR
ELISA ערכתCELL BIOLABSSTA-380מחקר מתילציה
GoTaq G2 Flexi DNA פולימראזPromegaM7801PCR איכותי
גואנוזיןסיגמא-אולדריץ'G6264רכיב של תערובת נוקלאוזידים למדיום ESC
תערובת התזונה F-10 של HamThermo Fisher Scientific31550031להחלפת
סרום נוקאאוטתרמו פישר 10828028 מדעירכיב של מדיום ESC
KOVA שקופית זכוכיתית 10 עם רשתותHycor Biomedical87144לספירת תאים
Leica MZ APO מיקרוסקופ סטריאוLeicaNAלתצפית אורגנואידית
תמיסת L-גלוטמיןSigma-AldrichG7513רכיב של פיברובלסטים ומדיה ESC
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)Thermo Fisher Scientific11140035רכיב של מדיום ESC
Millex-GS 0.22 ומיקרו; מסנני נקבוביות mMilliporeSLGS033SBלעיקור תמיסה
M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H מינוס, מוטציה נקודתיתPromegaM3681mRNA תמלול הפוך
Multiskan FC Microplate PhotometerThermo Fisher Scientific51119000לקריאת צלחת ELISA
ניקון Eclipse TE300 מיקרוסקופ ניגודיות שלב הפוךNikonNAלתא תצפית
Perkin Elmer Thermal Cycler 480Perkin ElmerNAThermal Cycler לשעתוק הפוך
Poly (tetrafluoroethylene) 1 μ m גודל חלקיקיםסיגמא-אולדריץ'430935ליצירת מיקרו-ביו-ריאקטור
PureLink גנומי DNA מיני ערכתתרמו פישר K182001DNA אסטריקציה
TaqMan ביטוי גנים תאים ל-CT ערכתתרמו פישר מדעיAM1728כמותי PCR
תימידיןסיגמא-אולדריץ'T1895רכיב של תערובת נוקלאוזידים למדיום ESC
צלחת תרבית רקמות 100X20 מ"מ,833902Sarstedtלבידוד פיברובלסטים
צלחת תרבית רקמות 35X10 מ"מ, תקןSarstedt833900לבידוד פיברובלסטים
צלחת תרבית רקמות 35X10 מ"מ, תרחיףSarstedt833900500צלחת פטרי בקטריולוגיה לתרבית שיש נוזלי
צלחת תרבית רקמות 96 באר, סטנדרטית, FSarstedt833924005לתרבית שיש נוזלית
תמיסת טריפסין-EDTASigma-AldrichT3924לצינור דיסוציאציה פיברובלסטים
15 מ"ל, 120x17 מ"מ, PSSarstedt62553041לצנטריפוגה של תרחיף תאים
UridineSigma-AldrichU3003רכיב של תערובת נוקלאוזידים למדיום ESC
איכותי בינוני ESC גנומי סטנדרטית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  2. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
  3. Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
  4. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
  5. Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333(2015).
  6. Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
  7. Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
  8. Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017(2016).
  9. Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
  10. Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
  11. Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
  12. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  13. Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
  14. Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
  15. Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
  16. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728(2017).
  17. Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
  18. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41(2012).
  19. Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
  20. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
  21. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  22. Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
  23. Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
  24. Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  25. Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083(2015).
  26. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).
  27. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).
  28. Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
  29. Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
  30. Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Epigenetic ModificationBiomechanical CuesPluripotent Cells5 Aza CytidinePTFE Micro BioreactorsLiquid MarblesCell RearrangementPluripotency MaintenanceDNA Methylation AnalysisMorphological Analysis

מאמרים קשורים