שילוב של תשומות סינפטיות מגוונות לנוירונים נמדד בצורה הטובה ביותר בהכנה שמשמרת את כל הגרעין הטרום-סינפטי לתזמון טבעי ול פלסטיות מעגל, אבל פרוסות מוח בדרך כלל מנתקות חיבורים רבים. פיתחנו פרוסת מוח שונה כדי לחקות פעילות מעגל vivo תוך שמירה על יכולת ניסויים במבחנה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo
במאמר זה
סיכום
תקציר
במבחנה פרוסה אלקטרופיזיולוגיה טכניקות למדוד פעילות חד תאית עם רזולוציה חשמלית וזמנית מדויקת. פרוסות המוח חייבות להיות דקות יחסית כדי לדמיין כראוי ולגשת נוירונים עבור תיקון-הידוק או הדמיה, ובדיקת מבחנה של מעגלים במוח מוגבל רק מה שקיים פיזית בפרוסה חריפה. כדי לשמור על היתרונות של ניסויי פרוסת מבחנה תוך שמירה על חלק גדול יותר של גרעין פרסינאפטי, פיתחנו הכנת פרוסה חדשנית. "פרוסת טריז" זו תוכננה עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיה טלאי-מהדק לאפיין את התשומות המנוארות, מונחות קול, לנוירונים אוליבוקוליאר (MOC) בגזע המוח. נוירונים אלה מקבלים את תשומות מעוררות ומעכבות העיקריות שלהם מנויונים המופעלים על ידי גירויים באוזן ההתפלה וגרעין השבלול המתאים (CN). פרוסת מוח אסימטרית תוכננה שהיא העבה ביותר בתחום הרוזטרו-סיבתי בקצה הצדדי של חצי כדור אחד ולאחר מכן מדללת לכיוון הקצה הצדדי של חצי הכדור הנגדי. פרוסה זו מכילה, בצד העבה, את שורש העצב השמיעתי המעביר מידע על גירויים שמיעתיים למוח, המעגלים הפנימיים של CN, וגם את המסלולים המעכבים הדיסינפטיים והטריסינופטיים המתכנסים על נוירונים MOC נגדי. ההקלטה מבוצעת מנויונים MOC בצד הדק של הפרוסה, שם הם מדמיינים באמצעות אופטיקה DIC לניסויים טיפוסיים תיקון-מהדק. גירוי ישיר של עצב השמיעה מבוצע כאשר הוא נכנס לגזע המוח השמיעתי, המאפשר פעילות מעגל CN פנימית פלסטיות סינפטית להתרחש בסינופסות במעלה הזרם של נוירונים MOC. עם טכניקה זו, ניתן לחקות את הפעלת מעגל vivo קרוב ככל האפשר בתוך הפרוסה. הכנת פרוסת טריז זו ישימה למעגלים אחרים במוח שבהם ניתוחי מעגלים ייהנו משימור קישוריות במעלה הזרם וכניסות ארוכות טווח, בשילוב עם היתרונות הטכניים של פיזיולוגיה של פרוסה חוץ-חוץית.
מבוא
תצפית על פעילות של מעגלים עצביים מבוצעת באופן אידיאלי עם תשומות חושיות ומשוב מקוריים, וקישוריות שלמה בין אזורי המוח, ב vivo. עם זאת, ביצוע ניסויים הנותנים רזולוציה של תא יחיד של תפקוד מעגל עצבי עדיין מוגבל על ידי אתגרים טכניים במוח שלם. בעוד ב-vivo אלקטרופיזיולוגיה חוץ תאית או שיטות הדמיה multiphoton יכול לשמש לחקירת פעילות במערכות עצבים שלמות, לפרש כיצד תשומות שונות לשלב או מדידה תשומות סינפטיות subthreshold נשאר קשה. בהקלטות vivo תא שלם להתגבר על מגבלות אלה, אבל הם מאתגרים לבצע, אפילו באזורים במוח אשר נגישים בקלות. אתגרים טכניים של ניסויים ברזולוציה של תא יחיד מוגברים עוד יותר באוכלוסיות נוירון מסוימות הממוקמות עמוק במוח, או באוכלוסיות מפוזרות מרחבית הדורשות כלים גנ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ / המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות טיפול בבעלי חיים וועדת שימוש.
1. הכנות ניסיוניות
הערה: פרטים לגבי הכנת פרוסה כולל תמיסת חיתוך, חיתוך טמפרטורה, טמפרטורת דגירה פרוסה וערכון (וכו ') הם ספציפיים להכנת גזע המוח שבוצעו בניסוי זה. ניתן לשנות את פרטי הדגירה לפרוסה לכל חוויית מעבדה.
- הכן פתרונות פנימיים להצמדת תיקון.
- הכן תמיסת מהדק מתח המכילה (ב- mM) 76 Cs-methanesulfonate, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 מ"ג-ATP, 5 Na2-פוספוקרן, 5 QX-314, ו 0.01 אלקסה פלור-488 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בדיקה היסטולוגית של פרוסת טריז
לחקירה שלנו של תפקוד נוירון גזע המוח השמיעתי, הכנת פרוסת טריז תוכנן להכיל את שורש העצב השמיעתי ו CN נגדי לנוירונים MOC המיועדים להקלטות (פרוסה לדוגמה המוצגת איור 1B). בדיקה היסטולוגית ראשונית של ההכנה חשובה כדי לאשר כי הפרוסה מכילה את הגרעין הדרוש להפעלת מעגלים ושתחזיות אקזונל אינן שלמות. שני סוגי תאים בתוך CN לספק מידע קול לנוירונים MOC. תאי T-stellate הם שיערו כדי לספק את הקלט מעורר לנוירונים MOC39,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הליך החיתוך המתואר כאן כננה פרוסת טריז הוא רב עוצמה לשמירה על מעגלים עצביים presynaptic שלם, אבל עם הנגישות של ניסויים פרוסת המוח לניתוח של תפקוד עצבי. יש לנקוט בזהירות רבה במספר צעדים ראשוניים על מנת למקסם את התועלת של ההכנה לניתוח מעגלים. יש לאשר את ממדי הטריז באמצעות בדיקה היסטולוגית, שהיא חלק בלתי נפרד מאישור כי הן הגרעין הקדם-סינפטי והן ההקרנה האקזונלית שלהם כלולים בתוך פרוסת הטריז המוכנה. גיאומטריית הפרוסה עשויה לדרוש שינוי אם ההקרנה נחתכה או כמה אקסונים מגיעים לגרעין היעד. באופן כללי יותר, החיתוך הסופי על הויברטום.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לסופרים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-מזוראלי של NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <תכשירים ניסיוניים חזקים> | |||
| אגר, אבקת | פישר סיינטיפיק | BP1423500 | 4% בלוק אגר המשמש לייצוב רקמת המוח במהלך חתך ויברטום |
| AlexaFluor Hydrazide 488 | Invitrogen | A10436 | Fluorophore המשמש בתמיסה פנימית לאישור תיקון נוירונים MOC מוצלח |
| איזון | אנליטי גנים Scientific (Intramalls) | AV114 | כימיקלים לשקילת |
| סכין גילוח פיפיות | Ted Pella | 121-6 | להב חיתוך ויברטום |
| חומצה קינורנית (5 גרם) | Sigma Aldrich | K3375-5G | תוסף ACSF לחיתוך המשמש להפחתת פעילות הנוירונים במהלך דיסקציה וחיתוך על מנת לשפר את בריאות הרקמות להידוק טלאי |
| מד pH | פישר סיינטיפיק (Intramalls) | 13-620-451 | בודק pH תמיסה |
| צלחות פטרי מפלסטיק 100 מ"מ קוטר X 20 מ"מ | פישר סיינטיפיק (אינטרקניונים) | 12-556-002 | 4% אגר הכנה |
| ערבוב פלטה חמה | פישר סיינטיפיק (אינטרקניונים) | 11-500-150 | חימום להכנת אגר |
| <חזק>חיתוך וחיתוך | |||
| ביוציטין | סיגמא Aldrich | B4261-250MG | כימיקל המשמש למעקב אקסונלי (מצומד לסטרפטווידין 488) |
| ניתוח מיקרוסקופ | אמסקופ | SM-1BN | לדיסקציה מדויקת במהלך הסרת המוח |
| Dumont #5 מלקחיים | כלי מדע עדינים | 11252-20 | כלי דיסקציה עדינים של מלקחיים |
| פינצטה חסכונית #3 | WPI | 501976 | כלי דיסקציה מלקחיים |
| צלחת פטרי זכוכית 150 מ"מ קוטר x 15 מ"מ H | פישר סיינטיפיק (אינטרקניונים) | 08-747E | צלחת דיסקציה |
| (203 X 254 מ"מ ממברנה PCTE 10um) | תומאס סיינטיפיק | 1220823 | יישום דגירה / ביוציטין |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | 1491200S001 | ויברטום לחיתוך פרוסות טריז |
| מספריים | מאיו Roboz | RS-6872 | כלי |
| חיתוךלהבי פלדת פחמן חד פיפיות | פישר סיינטיפיק (Intramalls) | 12-640 | סכין גילוח לדיסקציה |
| דגימה, כיוון | Leica | 14048142068 | שלב ויברטום מיוחד להטיה הניתנת לשחזור |
| Spoonula | FisherSci | 14-375-10 | כלי חיתוך |
| דבק סופר Newegg | 15187 | משמש להדבקת רקמות לשלב | |
| הרטטVannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | כלי |
| <חזק>אלקטרופיזיולוגיה | |||
| A1R מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף | Nikon Instruments | אלקטרופיזיולוגיה ומיקרוסקופ הדמיה, יכול להיות כל מיקרוסקופ התואם לאלקטרופיזיולוגיה | |
| אלקטרודה זכוכית בורוסיליקט עם נימה OD 1.5 מ"מ, מזהה 1.1 מ"מ, אורך 10 ס"מ | מכשיר סאטר | BF150-110-10 | תיקון הידוק פיפטה זכוכית |
| מילוי אלקטרודה MicroFil | WPI | CMF20G | תיקון מילוי פיפטה אלקטרודה |
| מחמם תמיסה מקוון וורנר | אינסטרומנטס (GSAdvantage) | SH-27B | מחמם מערכת זלוף פרוסות |
| מערכות Multi-Micromanipulator Sutter | Intruments | MPC-200 עם MP285 | מיקרומניפולטורים לתיקון מהדק וגירוי מיקום אלקטרודות |
| P-1000 חולץ פיפטה אופקי למיקרופיפטות זכוכית | מכשירי סאטר | FG-P1000 | חולץ מהדק תיקון |
| מגבר ותוכנה | HEKA | EPC-10 / Patchmaster הבא | יכול להיות כל מגבר / תוכנה |
| תא הקלטה | וורנר אינסטרומנטס | RC26G | פרוסה "אמבטיה" במהלך ההקלטה |
| תא הקלטה נבל | וורנר אינסטרומנטס | 640253 | מייצב פרוסה במהלך הקלטת אלקטרופיזיולוגיה |
| תא דגירה של פרוסות | תא | אחיזה מחומם ומחומצן לפרוסות במהלך ההתאוששות לאחר חיתוך | |
| יחידת בידוד גירוי | A.M.P.I. | Iso-Flex | לאלקטרופיזיולוגיה |
| מזרק 60CC | Fischer Scientific (Intramalls) | 14-820-11 | אלקטרופיזיולוגיה טיפול בנוזל זלוף |
| בקר טמפרטורה | Warner Instruments (GSAdvantage) | TC-324C | בקר טמפרטורה של מערכת זלוף פרוסות |
| צינורות 1/8 OD 1/16 ID | Fischer Scientific (Intramalls) | 14-171-129 | אלקטרופיזיולוגיה טיפול בנוזל זלוף |
| טוגסטן מיקרואלקטרודה דו קוטבית קונצנטרית | WPI | TM33CCINS | אלקטרודה מגרה לאלקטרופיזיולוגיה |
| <חזקה>היסטולוגיה | |||
| 24 באר צלחת | פישר סיינטיפיק (אינטרקניונים) | 12-556006 | איסוף פרוסות היסטולוגיה וצביעה |
| Alexa Fluor 488 Streptavidin | Jackson Immuno labs | 016-540-084 | נוגדן משני להדמיית ביוציטין |
| קורנינג אורביטל | סיגמא | שייקר CLS6780FP | לתסיסה אימונוהיסטוכימית |
| קרסיל סגול אצטט | סיגמא אולדריץ' (Intramalls) | C5042-10G | כתם סלולרי להיסטולוגיה |
| להבי מיקרוטום חד פעמיים | פישר סיינטיפיק | 22-210-052 | להב מיקרוטום הזזה |
| מסנן-מזרק Nalgene 4 מ"מ תאית אצטט 0.2um | Fisher Scientific (Intramalls) | 09-740-34A | מסנן מזרק למילוי פיפטות הקלטה בתמיסה פנימית |
| Fluoromount-G הרכבה שקופית בינונית | פישר סיינטיפיק | OB100-01 | אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטי הרכבה זכוכית בינונית |
| שקופיות צלחת מכתים עם מתלה | פישר סיינטיפיק ( Intramalls) | 08-812 | תא צביעה סגול Cresyl |
| Microm HM450 הזזה Microtome | ThermoFisher | 910020 | הקפאת מיקרוטום להיסטולוגיה |
| מיקרוסקופ כיסוי משקפיים: מלבנים 50 מ"מ X 24 מ"מ | פישר סיינטיפיק (אינטרקניונים) | 12-543D | היסטוכימיה כיסוי שקופיות זכוכית |
| הרכבה מדיום הרכבה | פישר סיינטיפיק | SP15-100 | קרסיל סגול קטע הרכבה |
| שקופיות סופרפרוסט בינוניות | פישר סיינטיפיק | 22-034980 | שקופיות היסטולוגיה |
מקורות
- Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
- Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
