מאמר שיטה

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

DOI:

10.3791/61680

⸱

20 בספטמבר 2020

 ,  ,  ,  , 
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שעתוק גנים הוא תהליך חיוני בביולוגיה של התא, ומאפשר לתאים לפרש ולהגיב לרמזים פנימיים וחיצוניים. שיטות אוכלוסיה בתפזורת מסורתיות (כתם צפוני, PCR ו- RNAseq) המודדות רמות mRNA חסרות את היכולת לספק מידע על שונות בין תאים לתא בתגובות. הדמיה וכימות מדויקים של תא בודד ואלילי אפשריים באמצעות פלואורסצנטיות RNA של מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH). RNA-FISH מבוצע על ידי הכלאת RNAs היעד עם תוויות אוליגונוקלאוטיד בדיקות. אלה יכולים להיות התמונה באומדים תפוקה בינונית / גבוהה, ובאמצעות צינורות ניתוח תמונה, לספק נתונים כמותיים על RNAs בוגרים ומתהווים, כל ברמת תא יחיד. שלבי הקיבעון, ההכלאה, ההכלאה וההדמיה עברו אופטימיזציה במעבדה במשך שנים רבות באמצעות מערכת המודל המתוארת כאן, אשר גורמת לניתוח מוצלח וחזק של תיוג smFISH. המטרה העיקרית עם הכנה ועיבוד מדגם היא לייצר תמונות באיכות גבוהה המאופיינת ביחס אות לרעש גבוה כדי להפחית תוצאות חיוביות שגויות ולספק נתונים מדויקים יותר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את הצינור מהכנה לדוגמה לניתוח נתונים בשילוב עם הצעות ושלבי מיטוב להתאמה לדגימות ספציפיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שעתוק ותרגום גנים הם שני התהליכים העיקריים המעורבים בדוגמה המרכזית של הביולוגיה, עוברים מרצף ה- DNA ל- RNA לחלבון1. במחקר זה, אנו מתמקדים בייצור של RNA שליח (mRNA) במהלך שעתוק. מולקולת הרנ"א המתהווה כוללת הן אינטרונים שאינם קידוד והן אקסונים קידוד. אינטרונים הם שותפים תמלול החוצה לפני mRNA עובר לתוך הציטופלסמה לתרגום על ריבוזומים2,3.

באופן מסורתי, המדידה של mRNA מבוצעת באוכלוסיות בתפזורת של תאים (מאות עד מיליונים) עם התקפות קלאסיות כגון RT-qPCR או סופג צפוני. בעוד חזק מאוד, שיטות אלה מוגבלות כפי שהם אינם מספקים תובנות על וריאציה תא לתא (הטרוגניות פנוטיפית), זיהוי של מספר אללים פעילים תמלול, ואולי חשוב מכך, חסר מידע מרחבי. לאחרונה, טכנולוגיות גנום רחב המאפשר ריצוף RNA תא יחיד (RNAseq) החלו לגשר על הפער בין שיטות הדמיה רצף4. עם זאת, RNAseq סובלת מיעילות זיהוי נמוכה יחסית ושלבי העיבוד גורמים לאובדן מוחלט של מידע מרחבי5. למרות שתא יחיד RNAseq יכול לספק תובנות על הטרוגניות פנוטיפית בקרב אוכלוסייה של תאים איזוגניים, פלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (RNA-FISH) יכולה להקל על חקירה מלאה יותר של ביטוי גן היעד ברמה המרחבית, ועל בסיס אלל-על-אלל6,7.

RNA FISH היא טכניקה המאפשרת זיהוי ולוקליזציה של מולקולות RNA היעד בתאים קבועים. שלא כמו שיטות קודמות, מייגעות, RNA-FISH החדיש הנוכחי משתמש בבדיקות חומצת גרעין זמינות מסחרית המשלימות את רצפי הרנ"א היעד, וגשושיות אלה הכלאה ליעדים שלהם על ידי ווטסון-קריק בסיס זיווג8. טכניקות ההכלאה המוקדמות של מקום כללו פרוטוקול דומה שנקבע על ידי גאל ופרדו בשנת 1969, כאשר מדגם עובד עם בדיקות חומצת גרעין שהיברידיות במיוחד ליעד RNA9. במקור, ההסתה בוצעה באמצעות זיהוי רדיואקטיבי או צבעוני; עם זאת, בשנות השמונים, התפתחות הפלואורסצנטיות בפרוטוקולי הכלאה במקום (FISH) לדגי DNA ומאוחר יותר RNA FISH פתחו את המסלול לגילוי רגיש יותר, ואת הפוטנציאל למולטיפלקס10,11.

התפתחויות נוספות ב- RNA FISH הובילו ליכולת לזהות ולכומת מולקולות RNA בודדות (smFISH)12,13. זיהוי ישיר הוא שיטה שבה הבדיקות עצמן מסומנות בפלואורופורים. אתגר עם smFISH הוא שיש צורך מספיק הכלאה בדיקות / יעד כדי להקל על זיהוי של אותות פלואורסצנטיים כנקודות ברורות, עקיפה מוגבלת. כדי לטפל בבעיה זו, ניתן להשתמש בערכת בדיקה של אוליגונוקלאוטידים קצרים חד-גדיליים של DNA המשלימים לאזורים שונים של היעד RNA8,12,14. כריכת בדיקות מרובות מגבירה את צפיפות הפלורופור המקומית, מה שהופך את ה- RNA לגלוי כנקודה נפרדת בעוצמה גבוהה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו היא יתרון כי כריכת מחוץ למטרה של אוליגונוקלאוטידים במאגר ערכת הבדיקה ניתן להבחין בין אות נקודת RNA האמיתי על ידי ניתוח כמותי של גודל הנקודה ואת עוצמתו כדי להבדיל בין אות אמיתי כריכה אוליגונוקלאוטיד מזויף, ובכך להקל על ניתוח מדויק יותר על ידי הפחתת חיובי שווא12.

שיטות חלופיות לזיהוי mRNA הן שיטת תרגום ניק המבוססת על שיבוט BAC ומערכת ה- DNA המסתעפת שפותחה לאחרונה. בשיטת BAC משובטת, ניק-תרגום, ה- DNA שיש לתייג הוא חתך אנזימטי ונוקלאוטיד חדש מתווסף לקצה 3 'חשוף. הפעילות של DNA פולימראז אני מוסיף נוקלאוטיד שכותרתו וכתוצאה מכך הבדיקה הרצויה15,16. טכניקת הדנ"א המסועפת כוללת בדיקות אוליגונוקלאוטידים המות לאיברידיות בזוגות ליעדי RNA והגשושיות הללו מוגברות תוך שימוש במולקולות הגברה מרובות של אותות. שיטה זו יכולה לשפר באופן משמעותי את יחס האות לרעש, אך ההגברה יכולה מוטה כמות מדויקת מכיוון שנקודות פלואורסצנטיות יכולות להיות שונות לחלוטין בגודל ובעוצמה17.

כמערכת מודל לפרוטוקול זה, אשר מועסק באופן מלא כחלק מתוכנית המחקר Superfund NIEHS כדי לכמת את ההשפעות של כימיקלים שיבוש אנדוקריני במפרץ גלווסטון / ערוץ הספינה יוסטון, השתמשנו קולטן אסטרוגן (ER) קו תא סרטן שד חיובי MCF-7 שטופלו בן לילה עם אגוניסט ER, 17β-אסטרדיול (E2)7,18,19. E2 מווסת גנים רבים יעד ER, כולל הגן אב טיפוס יעד ER, GREB17,20,21,22. פרוטוקול SmFISH המתואר כאן משתמש קבוצה של שתי ערכות בדיקה מופרדות ספקטרלית המתמקדות GREB1; אחד כי הכלאה אקסונס והשני introns, המאפשר את המדידה של RNA בוגר ומתהווה7. לאחר מכן אנו משתמשים במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית בשילוב עם דה-אבולציה לדגימות עם תווית SmFISH תמונה, ולאחר מכן מיישמים שגרות ניתוח תמונה כדי לכמת את מספר אללים פעילים ו- RNAs בוגרים לתא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבטיח תוצאות מיטביות, חלק המעבדה הרטוב של פרוטוקול זה דורש אמצעי זהירות סטנדרטיים ללא RNase בכל השלבים. לדוגמה, השימוש בטיפים מסוננים של פיפטה, כלי שיט סטריליים ומאגרים נטולי RNase מעודד מאוד. באמצעות מעכבי RNase כגון מתחמי ונדיל ריבונוקלאוזיד מוצע גם, במיוחד עבור RNAs היעד שפע נמוך.

1. תרבות התאים וההגדרה הניסיונית

  1. לשמור על תאי סרטן השד MCF-7 דבקים (ATCC #HTB-22) בבקבוקון תרבית רקמות T75 עם פנול אדום חינם (נדרש רק לניסויי גירוי הורמונלי) בינוני (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 2 mM L-גלוטמין, 1 ננומטר נתרן pyruvate, 50 I.U./mL פניצילין ו 50 מיקרוגרם / mL סטרפטומיצין.
  2. מניחים כיסויים עגולים מצופים חומצה מצופים פולי-D-ליסין (בעובי 0.16 עד 0.19 מ"מ, קוטר 12 מ"מ) לתוך צלחת תרבית רקמות רב-וולית 24.
    הערה: השתמש 1 M HCl כדי לחרוט חומצה כיסויים ומעיל עם פתרון 1 מ"ג / מ"ל של פולי-D-ליסין מחדש PBS סטרילי (תמיסת מלח חוצץ פוספט ללא Ca++ ו Mg++) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
  3. הסר את מדיה הצמיחה מהתאים לשטוף פעם אחת עם 5 מ"ל של PBS סטרילי (תמיסת מלח חוצץ פוספט ללא Ca++ ו Mg++). נתק תאי MCF-7 באמצעות 2-3 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA 0.25%. לאחר ניתוק התאים, נטרל את פתרון טריפסין-EDTA 0.25% עם נפח שווה של מדיה צמיחה.
  4. העבר את התאים במתלה התקשורת לצינור חרוט 15 מ"ל, להסתובב למטה ב 391 x g במשך 1 דקה כדי pellet את התאים. הסר בזהירות את המדיה מן הצינור חרוטי מבלי להפריע גלולה התא resuspend התאים בכמות מתאימה של מדיה טיפול.
    הערה: מדיה טיפול הוא פנול אדום חינם DMEM בתוספת 5% פחם-dextran מופשט ודיאליג FBS, 2 mM L-גלוטמין, 1 nM נתרן פירובט, 50 I.U./mL פניצילין ו 50 מיקרוגרם / mL סטרפטומיצין. מדיה זו חיונית לניסויים גירוי הורמון סטרואידים כמו רכיב הסרום הוא מרוקן במידה רבה של סטרואידים על ידי פחם הפשטת המדיה, יש גורמי גדילה מופחתת באמצעות דיאליזה.
  5. זרע את התאים על כיסויים בצלחת multiwell 24 ב 60,000 עד 70,000 תאים לבאר ב 500 μL של מדיה טיפול. לניסוי זה, זיהום התא צריך להיות סביב 70-80% בייזום הטיפול. מטב את צפיפות זריעת התא בהתאם לסוג התא, קצב הצמיחה ואורך הניסוי כדי למנוע השפעה, מה שמסבך את ניתוח התמונה.
    הערה: לקבלת ניתוח הדמיה ותמונה מיטבי, הימנע מגוש תאים. לשם כך, לערבב את aliquot של תאים ביסודיות על ידי pipetting (או מערבולת קצרה) את התאים כמה פעמים לפני חלוקה לתוך בארות. לפני החזרת התאים המצולת לאינקובטור, מתן התאים להתיישב במכסה המנוע של תרבית הרקמות במשך כ -20 דקות מסייע להפחית את גושי התאים.
  6. דגירה תאים לפחות יומיים לפני הטיפולים כדי להבטיח סנכרון מחזור התא והפחתת רקע עקב כל מולקולות איתות שנותרו בסרום המופשט / דיאליזה של מדיה צמיחה.
  7. לאחר דגירה של 48 שעות במדיה הטיפולית, לטפל בתאי MCF-7 עם 10 nM 17β-אסטרדיול (E2) ובקרת רכב (DMSO), מדולל במדיה הטיפול במשך 24 שעות. טיפול זה משתמש במינון רווי של E2 כדי לגרום לתגובה מקסימלית. בצע קורס זמן וניסויים בתגובה במינון כדי לקבוע באופן אמפירי תנאים עבור גנים יעד שונים, מודלים תאים וסוג של טיפולים. לדוגמה, ראה את הפרסום האחרון שלנו7.

2. הכנת מאגרים

  1. כדי להכין את מאגר הקיבעון, לדלל מטוהר, פורמולדהיד מונומרי (נמכר על ידי ספקי אלקטרון מיקרוסקופיה כמו 16% paraformaldehyde) כדי 4% ב- PBS Ca סטרילי++/ Mg++ (תמיסת מלח חוצץ פוספט בתוספת Ca++ ו- Mg++). הוסף מתחמי ונדיל ריבונוקלאוזיד (VRC) למאגר הקיבעון לריכוז סופי של 2 מ"מ כדי לעכב את השפלת הרנ"א.
    1. חשב את הכמות הכוללת של מאגר קיבוע בהתבסס על דרישת 300-500 μL של קיבוע לכל באר של צלחת multiwell 24. לאחסן את פורמלדהיד 4% על קרח עד הנדרש בשלב הקיבעון.
      הערה: הפוך את מאגר הקיבעון לרענן עבור כל ניסוי.
      זהירות: פורמלדהיד הוא טרטוגן הנספג דרך העור. השתמש בכימיקל זה במכסה אדים יחד עם PPE מתאים בהתאם לתקנות המוסדיות שלך.
  2. עבור שלב permeabilization, להכין 70% אתנול במים ללא נוקלאז. אפשרות חלופית היא 0.5% טריטון-X100 ב- PBS Ca סטרילי++/ Mg++ בתוספת 2 mM של VRC. חשב את הכמות הכוללת של מאגר permeabilization הדרוש על-ידי ניצול 500 μL של מאגר לכל באר.
  3. כדי להכין 9 מ"ל של מאגר הכלאה, להוסיף 2 מ"ל של מלאי 50% dextran סולפט, ו 1 מ"ל של 20x SSC (תמיסת מלח נתרן סיטראט) חוצץ 6 מ"ל של מים ללא נוקלאז. מערבולת לערבב ביסודיות את חיץ ההיברידיזציה. מאגר זה יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (5 °F) עד שבוע אחד.
  4. ישנם חמישה שלבי שטיפה נפרדים הדורשים חיץ נתרן סיטראט (SSC) 2x מלוחים. חשב את אמצעי האחסון הסופי של מאגר SSC 2x הדרוש על-ידי צפי ל- 500 μL של מאגר לכל כיסוי לכל שלב כביסה. לדלל את הכמות הנדרשת של מלאי 20x SSC חוצץ במים ללא נוקלאז. ניתן להוסיף 2 מ"מ VRC לשטיפת צעדים כאמצעי זהירות נוסף. ניתן לאחסן מאגר זה בטמפרטורת החדר למשך שלבי העיבוד.

3. קיבעון לדגי RNA

  1. לאחר הטיפול, להסיר את המדיה מן הבארות לשטוף פעם אחת עם סטרילי, PBS Caקר ++/ Mg++. אם מודל תא הדבקה נמוך מנוצל, אין להשתמש בוואקום כדי לשאוף לנוזל; השתמש בהקטרה ידנית כדי להסיר בזהירות את המדיה מצד הבאר ולהשמיט את שלב הכביסה הראשוני. הוסף 500 מאגר קיבוע μL במשך 30 דקות על קרח.
    הערה: אם המדגם נוטה השפלת RNA, להשתמש PBS סטרילי עם 2 mM VRC עבור שלב לשטוף בשלב זה.
  2. הסר קיבוע ולהיפטר ממנו בפסולת כימית על פי תקנות מוסדיות. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי קר Ca++/ Mg++ במשך 3 דקות.
  3. הסר PBS ולהוסיף 500 μL של 70% אתנול לכל באר. אוטמים את צלחת 24 הבאר עם סרט פלסטיק פרפין. מניחים על סיבוב ב 4 °C (5 °F) לפחות ארבע שעות. עדיף להשאיר את הדגימות ב 70% אתנול לילה. הפרוטוקול יכול להיות מושהה בשלב זה ואת הדגימות ניתן לאחסן עד שבוע ב 70% אתנול.
    הערה: טריטון-X100 0.5% ב- PBS עם פתרון VRC של 2 מ"מ עשוי לשמש כחלופה. לדגור את הדגימות ב 500 μL של חיץ permeabilization זה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על סיבוב. אם אתה משתמש במאגר permeabilization זה, אין אפשרות להשהות את הפרוטוקול בשלב זה ועליך להמשיך בשלב ההכלאה.

4. הכלאה לדגי RNA

  1. הסר את מאגר permeabilization ולשטוף פעם אחת ב 500 μL של 2x חוצץ SSC בתוספת 10% פורממיד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על סיבוב.
  2. הכן את מאגר ההיברידיות המלא. חשב כ- 30 μL של מאגר הכלאה מלא לכל כיסוי. הוסף formamide למאגר ההיברידיות כדי להגיע לאחוז הדרוש. לדוגמה, אם יש צורך ב- 500 μL של מאגר הכלאה מלא, הוא יכלול 450 μL של חיץ ההיברידיות שנעשה בעבר בתוספת 50 μL של פורממיד מולקולרי כדי להגיע ל- 10% vol/ vol. מערבולת בקצרה לערבב.
    זהירות: פורממיד הוא טרטוגן שנספג דרך העור. השתמש בכימיקל זה במכסה אדים יחד עם PPE מתאים על פי תקנות מוסדיות.
  3. לדלל את ה- GREB1 intron (המסומן עם Atto 647N) ו- GREB1 exon (המסומן עם קוואזר 570) בדיקות 1:300 במאגר הכלאה. מערבבים באמצעות צנרת. הגן על מאגר זה מפני אור והשתמש בו באופן מיידי.
    הערה: הבדיקות תוכננו ויוצרו כמפורט ב Stossi ואח'7. הבדיקות מסופקות בדרך כלל כמאגר בדיקה אוליגונוקלאוטיד מיובש שיש להחיות במאגר TE ללא RNAse בהתאם לפרוטוקול היצרן14. פתרון המלאי עבור בדיקות אלה היה 12.5 μM, ולכן; ריכוז העבודה של הבדיקות הוא 42 ננומטר.
  4. הכן תא לחות לשלב ההכלאה בן הלילה. הניחו חתיכת סרט פלסטיק פרפין, צד לא חשוף למעלה, לתוך צלחת פטרי ניקה עם מחטא משטח כדי להסיר RNases. הרווה שתי מגבות נייר עם מים סטריליים ומניחים אותם לאורך הקצוות של צלחת פטרי כדי לספק לחות, כמו ייבוש יכול להרוס תיוג ספציפי.
  5. Aliquot הבדיקות על ידי dotting 30 μL של בדיקות חוצץ הכלאה על הצד הנקי של סרט הפלסטיק פרפין. להפיץ aliquots של בדיקות, כך כיסויים לא באים במגע אחד עם השני.
  6. בעזרת מלקחיים מעוקרים, הופכים בעדינות את צד תא הכיסוי כלפי מטה אל הגשושיות בצלחת הפטרי מזכוכית. הימנע בועות אוויר ולא להפעיל לחץ על כיסויים.
    הערה: אין להשליך את צלחת תרבית הרקמה עם חיץ 2x SSC, כפי שיהיה צורך עבור השלבים הבאים.
  7. אוטמים את צלחת הפטרי מזכוכית עם סרט פלסטיק פרפין ומכסים את הצלחת בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור של הפלורופורים. דגירה לילה, עד 16 שעות, ב 37 °C (5 °F) על משטח שטוח שאינו מסתובב. זמן הדגירה יכול להיות מגוון אמפירית, אולם מומלץ מינימום של 4 שעות.
    הערה: כיסויים רגישים להחליק סביב בעת דגירה במאגר הכלאה, אשר יכול להוביל כתמים יבשים על כיסוי ולפגוע במדגם.

5. הכנת דגימות להדמיה

  1. למחרת, להסיר את כיסויים מן החדר לחות באמצעות מלקחיים ולהחזיר אותם צלחת 24 היטב עם הצד התא למעלה. הוסף 500 μL של חיץ SSC 2x טרי בתוספת 10% פורממיד כדי לשטוף את בדיקה עודפת והיברידיות לא ספציפיות.
    הערה: הגן על הדגימות מפני אור מנקודה זו ואילך.
  2. לשטוף את התאים פעמיים עם 500 μL של 2x חוצץ SSC בתוספת 10% פורממיד במשך 15 דקות כל אחד ב 37 °C על סיבוב מחומם.
  3. דנ"א נגדית עם DAPI ב-1 מיקרוגרם/מ"ל ב-2x חוצץ SSC למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בסיבוב.
  4. יש לשטוף פעם אחת עם חיץ 2X SSC למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הר את כיסויים על מגלשות זכוכית באמצעות מדיה הרכבה ללא התקשות לאחר הסרת כל עודף 2x חוצץ SSC עם מגבת נייר ושטיפה מהירה במים חינם נוקלאז כדי למנוע מלחים עודפים. לבסוף, לאטום את כיסויים עם לק ברור.

6. מיקרוסקופיה ועיבוד תמונה ברזולוציה גבוהה

  1. צלם את הדגימות על מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי רחב באמצעות יעד שמן 60x או 100x ומצלמת sCMOS. עיין בטבלת החומרים עבור המיקרוסקופ והמטרה הספציפיים המשמשים לניסוי זה.
    1. הדמיה מלאה ברגע שהדגימות מעובדות במלואן כדי למנוע הידרדרות תלוית זמן של האות.
      הערה: שמן טבילה עם אינדקס שבירה (RI) של 1.516 משמש בניסוי זה. בדיקות אמפיריות צריך להתבצע כדי להתאים את RI שמן לדגימות ספציפיות, כמו אי התאמות RI יגרום סטיות של פונקציית התפשטות הנקודה שתשפיע על דה-אבון התמונה.
  2. התמונות נלכדות בגודל פיקסל רוחבי של 0.10827 מיקרומטר.
  3. מטב את כמות התאורה ממקור האור (כלומר, אחוז שידור) ואת זמני החשיפה עבור כל ערוץ (מסנני DAPI, TRITC, CY5 בדוגמה מסוימת זו) באמצעות המדגם שצפוי להיות בעל העוצמה הגבוהה ביותר (כלומר, פקדים חיוביים). בניסוי זה, המדגם שטופל E2 צפוי להיות בעוצמה גבוהה יותר עבור שתי ערכות הבדיקה GREB1. בדרך כלל, אחוז השידור עבור GREB1 אינטרון ו exon בדיקות הוא 50 – 100%, ואת זמני החשיפה נעים בין 0.25 - 0.60 שניות.
  4. בנוסף, רכשו תמונות בתנאים שנמנעים מהלבנת תמונות ו/או כל רוויה של פיקסלים במצלמה. מניסיוננו, צריך להיות הבדל מינימלי של פי עשרה בין הרקע לעוצמת האות. רוויה של כמה פיקסלים/שדה יכולה להתרחש עקב אותות לא ספציפיים במדגם (כלומר, לכלוך על כיסוי, צבירה של בדיקה מחוץ לתא), אשר יכול להיות מקובל, אבל רק אם אזורים רוויים אינם כלולים בכמות.
  5. כדי להגדיר רכישה של מחסנית z, התמקד בדוגמה בערוץ DAPI. בחר את החלק העליון והתחתון של מחסנית z במרחקים שבהם הגרעינים המוכתמים של DAPI הופכים מחוץ לפוקוס. גודל שלב z-stack בו השתמשנו הוא 0.25 מיקרומטר לפרוסה ואת מחסנית z הכוללת צריך להתפרס על התא כולו (כ 10 מיקרומטר בתאי MCF-7). עם זאת, גודל שלב z-stack ישתנה בהתאם למטרה המשמשת צריך לעקוב אחר קריטריון הדגימה Nyquist.
    הערה: אינטרונים נמצאים בדרך כלל רק בגרעין; עם זאת, אקסונים הם גם בגרעין וגם בציטופלסמה. לכן, הגדרת מחסנית z כמתואר לעיל תצלם את רוב התוויות האינטרונית והאקספון כאשר מחסנית z מקיפה את התא כולו.
  6. בדרך כלל, תמונה של מינימום של 200 תאים לניתוח כמותי בניסויים ראשוניים כדי ללכוד תמונה של גודל התגובה והשונות בין תאים.
  7. תאים מסוימים בתמונה אינם נכללים בניתוח הסופי (כלומר, קצב הנשירה) מכיוון שהם יסוננו על ידי צינור הניתוח (כלומר, תאים הנוגעים בגבול התמונה, תאים אפופוטוטיים/מיטוטיים).
    הערה: בעת בחירת אזורי תמונה, יש לזכור כמה גורמים. בחר אזורים עם תאים שאינם חופפים באופן שווה כפי שהוגדרו על-ידי פלואורסצנטיות גרעינית בעלת תווית DAPI. בנוסף, נסה לבחור אזורים עם המספר הנמוך ביותר של גרעינים לאורך הקצוות של אזור התמונה כדי להימנע מספירת תאים חלקיים. הדמיה אוטומטית ובלתי משוחדת עדיפה תמיד על ניסויים הדורשים ניתוח סטטיסטי.
  8. לאחר הרכישה, פירוק תמונות באמצעות אלגוריתם משקם אגרסיבי באמצעות 10 מחזורים (כלומר, מספר איטרציות). צור תחזיות בעוצמה מרבית לניתוח תמונה (השמט שלב זה אם נדרש ניתוח תלת-ממדי ספציפי). שמור את כל תמונות ההקרנה בהתאם לעומק הסיביות של המצלמה שבה נעשה שימוש; במקרה שלנו תמונות גווני אפור של TIFF של 16 סיביות נשמרו. לתמונות RGB יש עומק סיביות מופחת וכתוצאה מכך אובדן מידע; לכן, תמונות RGB אינן מתאימות לניתוח תמונה.

7. ניתוח תמונה

  1. קרא את ההוראות והורד את מחברת jupyter מגיתוב(https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. התקן הפצת פייתון אנקונדה (https://www.anaconda.com/distribution/) גירסה 3.6 ומעלה.
  3. פתח את בקשת אנקונדה והקלד את פקודת ההתקנה כדי להתקין ITK פשוט עבור אנקונדה (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. פתח את נווט אנקונדה והפעל מחברת jupyter. הוא יפתח דפדפן אינטרנט המציג ספריות וקבצים. דפדף בין מבני הספריות כדי להגיע לספריה המכילה את מחברת jupyter שהורדה מגיתוב.
  5. פתח את המחברת והפעל כל תא על-ידי הקשה על Shift ו- Enter בו-זמנית.
  6. בצע את הפרטים של כל פונקציה ושלל המסופקים במחברת. עבור קבוצה אחרת של תמונות, ייתכן שיהיה צורך לשנות ערכי פרמטר מסוימים.
    הערה: בקצרה, גרעינים מפולחים מערוץ DAPI באמצעות סף מקומי בגודל בלוק של 251 פיקסלים, חורים מולאו ואובייקטים קטנים מ- 100 פיקסלים הוסרו. גרעינים נוגעים ללב חולקו באמצעות אלגוריתם קו פרשת מים. לאחר מכן הופרדה המסכה הגרעינית ב-100 פיקסלים וקו פרשת המים שימש להפרדת עצמים נוגעים ללב באמצעות גרעינים כאגנים. כדי לזהות מצב יציב RNA (אקסונים), סף Otsu שימש; עבור אללים פעילים של תמלול (intron), תחילה הוחל טשטוש גאוסי (סיגמא= 1) ולאחר מכן נעשה שימוש בסף אנטרופיה מרבי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לנתח תגובות הורמונליות באמצעות smFISH, כדוגמה, בחרנו במודל קולטן האסטרוגן (ER) המשמש בהתקפות תפוקה גבוהות כדי לקבוע את נוכחותם של כימיקלים משבשים אנדוקריניים באסונות סביבתיים בהקשר של השתתפות בתוכנית המחקר של NIEHS Superfund7. בניסוי זה, תאי סרטן השד MCF-7 חסידים טופלו עם אגוניסט ER 17β-אסטרדיול (E2, 10 ננומטר) או רכב (DMSO) במשך 24 שעות. ערכות בדיקה מופרדות ספקטרלית נגד GREB1 נטוניק (Atto 647N, אדום באיור 1)ואקסוניק (קוואזר 570, ירוק באיור 1<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתודולוגיית smFISH המתוארת מבוססת על פרוטוקולים שפורסמו בעבר7,12,14. בפרוטוקול זה, אנו מסבירים את הצעדים הקריטיים שהותאמו מהמעבדה הרטובה (כולל צפיפות זריעה, זמן קיבעון, חדור וריכוז בדיקה), להדמיה וניתוח תמונה, ומספקים צינור ניסיוני מלא למעבדות המעוניינות לבצע ניתוח תאים בודדים של תמלול גנים.

כדי להקל על ניתוח תאים בודדים, חשוב שהתאים ית-קרקעיים ולא יחפפו כך שגבולות התא מוערכים ללא צורך בגבול תא. אנו מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAM, FS ו- MGM ממומנים על ידי NIEHS (פרויקט 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM ו- PKS נתמכים על ידי מרכז GCC במימון CPRIT למיקרוסקופיה מתקדמת ו- Image Informatics (RP170719). הדמיה נתמכת גם על ידי הליבה מיקרוסקופית משולבת במכללת ביילור לרפואה במימון NIH (DK56338, ו CA125123), CPRIT (RP150578), מרכז הסרטן המקיף דן ל דאנקן, וקונסורציום חוף המפרץ ג'ון ס דאן לגנומיקה כימית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
17&בטא; אסטרדיולסיגמא-אולדריץ'E2257CAS מספר 50-28-2
אמביון SSC (20X) מאגר, ללא רנאזThermoFisher ScientificAM9770
Corning DMEM עם L-גלוטמין ו-4.5 גרם/ליטר גלוקוזפישר סיינטיפיקMT10017CVמיוצר על ידי Invitrogen
DAPISigma-AldrichD8417ללא נתרן פירובט
דקסטרן סולפט, 50% תמיסה סטריליתסיגמא-אולדריץ3730-100 מ"ל
פוספט מבודד של Dulbecco Ca++/Mg++קורנינג21030CVמיוצר על ידי Calbiochem
אתנול, 200 הוכחה (100%)Fisher Scientific07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom מטופל TC צלחות תרבית תאים Multiwell353047מיוצר על ידי Decon
Laboratories Fetal סרום בקר (FBS), 500 מ"לפישר סיינטיפיק50-753-2978מיוצר על ידי Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ דה-קונבולוציהGE Healthcare
Hyclone מים, ביולוגיה מולקולרית בדרגהפישר סיינטיפיקSH3053802
שמן טבילה 1.516GE Healthcare Life Sciences29162940מיוצר על ידי GE בריאות ביו-מדע
L-גלוטמין תמיסתפישר סיינטיפיקMT25005Clמיוצר על ידי תאי קורנינג
MCF-7 ATCCHTB-22
פורממיד בדרגה מולקולריתפרומגהPAH5051
אולימפוס 60x/1.42 NA אובייקטיביאולימפוס
פרפילםBemis Company, Inc.52858-076מופץ על ידי VWR
Paraformaldehyde, תמיסה 16%,EM Grade Electron Microscopy Sciences15710
תמיסת Penicilin-StreptomycinFisher ScientificMT3001Clמיוצר על ידי Corning
Ribonucleoside Vanadyl ComplexVWR101229-716מיוצר על ידי New England Biosciences
RNase AwayAmbion9780
נתרן פירובט, 100 מ"מפישר סיינטיפיק11-360-070מיוצר על ידי Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5Fisher Scientific12-545-81P
Triton X-100, 100 מ"לFisher ScientificBP151-100מיוצר על ידי Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Solution 0.25%Sigma-AldrichT4049-500ML
Vectashield Antifade הרכבה בינונית 10 מ"לFisher ScientificNC9265087מיוצר על ידי Vector Laboratories
'

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ibr RNA RNA FISHGREB1DAPI

מאמרים קשורים