הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

רקמת שומן ממלאת תפקיד מפתח בחילוף החומרים של האנרגיה. עודף אנרגיה מאוחסן בצורה של שומנים, ורקמת שומן מסוגל התרחבות משמעותית או נסיגה בהתאם למצב תזונתי וביקוש אנרגטי. הרחבת רקמת השומן יכולה לנבוע מגידול בגודל adipocyte (היפרטרופיה) ו/או מעלייה במספר adipocyte (היפרפלזיה); התהליך האחרון מוסדר בחוזקה על ידי התפשטות ובידול של תאים אב שומן^1,2. במהלך השמנת יתר, רקמת השומן מתרחבת יתר על המידה, ותפקוד לקוי של רקמות – כולל היפוקסיה, דלקת ועמידות לאינסולין – מתפתח לעתים^{קרובות 3,4}. סיבוכים אלה הם גורמי סיכון למחלות כרוניות רבות כולל יתר לחץ דם, סוכרת, מחלות לב וכלי^{דם, שבץ}מוחי וסרטן 5 . לפיכך, הגבלת הרחבת רקמת שומן בלתי מבוקרת והפתולוגיות של רקמת שומן מקלות הן בראש סדר העדיפויות המחקרי הביו-רפואי. במהלך הרחבת רקמת השומן, תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ASCs) מתרבים ומבדילים ברצף לתוך preadipocytes (תאי אב מחויבים) ולאחר מכן לתוך adipocytes^{בוגרת 6}. מחקרים אחרונים על רצף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) מראים כי אוכלוסיות אלה של תאי אב שומן (APC) (ASCs ו preadipocytes) מפגינים הטרוגניות מולקולרית ופונקציונלית משמעותית^{7,8,9,10,11,12}. לדוגמה, ASCs מציגים יכולת בידול אדיפוגנית מופחתת, תוך הפגנת יכולות התפשטות והרחבה גבוהות יותר, בהשוואה ל- preadipocytes⁷. הבדלים מולקולריים נוספים מדווחים בתוך ASC ואוכלוסיות preadipocyte, אם כי הרלוונטיות התפקודית של הבדלים אלה עדיין לא ברור⁷. יחד, נתונים אלה מדגישים את המורכבות של מאגר התאים האב השומן ומדגישים את הצורך לפתח ולתקנן כלים כדי להבין ולטפל טוב יותר באוכלוסיות תאים קריטיות אלה.

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של Sca1⁺ אוכלוסיות תאים אב שומן אדידימאלי העכבר המתאימים ניתוחים רגישים במורד הזרם, כולל מחקרים חד-תאיים (scRNA-רצף) ותרבות התא. בידוד ודיסוציאציה של רפידות שומן אפידיליות בוצעו כפי שתואר קודם לכן^7,13 עם שינויים קלים המשפרים את הכדאיות של נגמ"שים מבודדים. בקצרה, תאים מנותקים מרפידות שומן אפידימליות מוכתמים בנוגדנים נגד Sca1, סמן הן עבור ASCs והן עבור preadipocytes^6,7, וסמני שושלת אחרים (לין): Ter119 (תאי אריתרואיד), CD31 (תאי אנדותל), ו- CD45 (לויקוציטים). Sca1⁺/Ter119^{קיימא -}/CD31^-/CD45^-/DAPI^- תאים ממוינים לאחר מכן לפי מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS). חשוב לציין, פרוטוקול זה אומת על ידי בידוד וניתוח מוצלחים של Sca1⁺/ Lin^{קיימא -} תאי אב שומן דיווחו במחקר רצף RNA תא יחיד האחרון שזיהה תת-אוכלוסיות הטרוגניות תפקודית בתוך ASCs ו preadipocytes⁷.

כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מאיו קליניק.

1. הכנת פתרון

1. הכן קולאז 2% (w / v) פתרון על ידי המסת קולגנאז II 2 גרם ב 100 מ"ל הנקס' פתרון מלח מאוזן (HBSS). Aliquot 200 μL כל אחד לכל שימוש.
2. הכן מדיום נטרול על ידי ערבוב 84 מ"ל F-12 בינוני, 15 מ"ל סרום סוס, ו 1 מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין.
3. הכן מאגר cytometry זרימה על ידי המסת 500 מ"ג של אלבומין סרום שור (BSA) ו 400 μL של 0.5 M EDTA ב 100 מ"ל של מלוחים אגירה פוספט של Dulbecco (DPBS).

2. ניתוח של כרית שומן אפידילית ניתוק רקמות

1. המתת חסד אנושית (נקע isoflurane / צוואר הרחם) עכבר זכר אחד. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בעכבר FVB בן ארבעה חודשים.
2. יש למרוח/לרסס 70% אתנול על הבטן ולחשוף את חלל הבטן התחתון באמצעות מספריים נקיים ומלקחיים.
3. אתר כרית שומן אפידילית (פרוקסימלית / מחוברת לאשכים). להחזיק את הצומת בין האשכים כרית שומן epididymal עם מלקחיים קהים למשוך בעדינות כדי לשחרר את כרית שומן epididymal.
4. הסר אשכים על ידי חיתוך באמצעות מספריים כרית שומן אפידילית דגירה ב 5 מ"ל של HBSS בתוספת 3% BSA בצינור חרוט 50 מ"ל בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
5. צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 7 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
6. קח כרית שומן אפידילית צפה מצינור חרוט 50 מ"ל וטחון דק את הרקמה באמצעות מספריים נקיים.
7. הוסף 200 μL קולגנאז 2% פתרון לתוך 3.8 מ"ל של HBSS בצינור תרבות 13 מ"ל. מוסיפים את הרקמה הטחונית ואת הדגירה באינקובטור מסתובב ב 5 סל"ד עבור 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס. במקום אינקובטור מסתובב, חממת תרבית תאים ב 37 °C (69 °F) ניתן להשתמש לחילופין עם תסיסה מדי פעם.
8. מעבירים את כל התוכן לצינור חרוט של 50 מ"ל ומוסיפים 10 מ"ל של מדיום נטרול. מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור 2-3 פעמים.
9. הכן עוד צינור חרוט 50 מ"ל מצויד מסננת תאים 70 מיקרומטר. לסנן את הרקמה המתעכלת לתוך הצינור החדש באמצעות מסננת התא.
10. להעביר את הזרימה דרך צינור חרוט 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 350 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
11. בזהירות להסיר את כדורי תא supernatant ו resuspend עם 5 מ"ל של DPBS. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
12. בזהירות להסיר את supernatant ולהוסיף 50 μL של מאגר cytometry זרימה. מערבבים היטב על ידי pipeting בעדינות ולשמור על התאים על הקרח. בשל נפח כדורי התא וכמות קטנה של supernatant שיורית, נפח כולל של תאים במאגר cytometry זרימה יהיה גדול מ 50 μL (כ 100 μL).

3. תיוג נוגדנים ופלואורסצנטיות מופעל מיון תאים (FACS)

1. לאחר ערבוב התאים היטב עם pipetting עדין, להעביר 54 μL של המתלה התא לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מ"ל. הוסף 6 μL של מגיב חסימת FcR ומערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שמור את כל התאים שנותרו לאחר נטילת 54 μL ולשמור אותם בקרח להשתמש כשליטה מוכתמת בשלב 3.5 וצעד 3.6.
2. במהלך הדגירה בשלב 3.1, הכינו קוקטייל נוגדנים על ידי שילוב של 11 μL כל אחד נוגדנים אנטי סקא1-APC, אנטי Ter119-FITC, אנטי CD31-FITC, נוגדנים נגד CD45-FITC בצינור microcentrifuge. מערבבים היטב על ידי צינור עדין ולשמור על קרח מוגן מפני אור.
3. לאחר הדגירה עם FcR חסימת ריאגנט במשך 10 דקות, להוסיף 40 μL של קוקטייל הנוגדנים ומערבבים היטב על ידי pipetting עדין. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
4. הוסף 500 μL של מאגר cytometry זרימה בתוספת 1 מיקרוגרם / מ"ל של DAPI לתוך התאים המוכתמים. מערבבים היטב על ידי צינור עדין לתאי סינון באמצעות מבחנה 5 מ"ל עם כובע הצמדה מסננת תאים. שמור תאים על קרח.
5. הוסף 500 μL של מאגר cytometry זרימה לתאים הנותרים בשלב 3.1 ומערבבים היטב על ידי pipetting עדין. סנן תאים באמצעות מבחנה של 5 מ"ל עם מכסה הצמדה למסננת תאים. שמור תאים אלה על הקרח ולהשתמש כפקד מוכתם בשלב הבא.
6. קח את התאים המוכתמים ואת השליטה הבלתי מוכתמת לניתוח FACS או למכשיר מיון.
   1. זהה ובודד את אוכלוסיית APC⁺/FITC^-/DAPI^- עם אסטרטגיות גטינג המוצגות באיור 1. תאים אלה מייצגים^תאים מעשיים מסוג Sca1⁺/Ter119^-/CD31^-/CD45. פסולת וצבירות תאים מתרוקנות באמצעות החלקות קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC). לאחר מכן, DAPI^- האוכלוסייה מגודרת, ואחריו gating של APC⁺/ FITC^- אוכלוסייה. יש להשתמש בפקדים לא מוכתמים כדי לסייע בהגדרת פרמטרי gating.
   2. לאסוף את התאים לתוך 500 μL של חיץ cytometry זרימה בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. בהמשך, כל ההליכים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים כדי למזער זיהום. כ 50,000 – 100,000 תאים נאספים מעכבר אחד.
7. ספירת תאים באמצעות המוציטרומטר כדי להעריך את הכדאיות של התא. מאחר שצבירות תאים עלולות להפריע לניתוחים נוספים במורד הזרם, נוכחותם של צבירות תאים מוערכת גם היא כדי להבטיח נוכחות מינימלית (<5% ממספר התאים בר-הקיימא) של אגרגטים אלה.

בניסוי זה נעשה שימוש בעכברי FVB זכרים בני ארבעה חודשים. לאחר הדרה של פסולת וכפולים באמצעות חלקות FSC / SSC, תאים קיימא (DAPI- אוכלוסייה) היו מגודרים, ואחריו הבחירה של APC+/ FITC- אוכלוסייה (איור 1). שערי DAPI, APC ו- FITC צוירו בהתבסס על הפקד הבלתי מוכתם. אסטרטגיות גטינג מוצגות באיור 1.

לאחר שעה של מיון, איכות הבידוד הוערכה כמותית על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה (איורים 2,3). התאים היו מוכתמים בתמיסת פרופידיום יודיד (1:100) עבור כתמי הכדאיות. באמצעות אותו גיתור למיון, התאים שמרו על כדאיות גבוהה וטוהר: 92.6 ± 2.2% תאים בודדים (פאנל שלישי באיור 2),86.4 ± 3.0% כדאיות (PI- תאים), ו- 86.0 ± 2.8% APC+/ FITC- תאים (n = 4, ממוצע ± סטיית תקן). אחוזים אלה הוגדרו כאחוזים של כל אוכלוסייה מגודרת (תאים בודדים, PI- תאיםו-PI - /APC+/FITC- אוכלוסייה, בהתאמה, באיור 2) ביחס למספר התא הכולל.

איור 1: בידוד של Sca1 בר קיימא+ תאים בודדים אב שומן על ידי FACS. אסטרטגיות גטינג מוצגות הן בתאים מוכתמים והן בשליטה לא מוכתמת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ניתוח cytometry זרימה מייצג כדי להעריך את הכדאיות של תאים לאחר הבידוד. כתמי הכדאיות בוצעו באמצעות יודיד פרופידיום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כימות אחוז התאים 1 שעות לאחר הבידוד בניתוח ציטומטריית זרימה. אחוזים של תאים בודדים, תאים בני קיימא, ו- APC+/ FITC- תאים כמתו כדי להעריך טוהר וכדאיות לאחר בידוד של תאים. הנתונים המוצגים מייצגים את סטיית התקן ± הממוצעת. n=4. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין מה לחשוף.