הפרוטוקול פותח כדי לחלץ ביעילות היסטונים שלמים מחומרי עלה דורה ליצירת פרופיל של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון שיכולים לשמש כסמנים אפיגנטיים פוטנציאליים כדי לסייע בהנדסת יבולים עמידים לבצורת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של היסטון מרקמת עלה דורה עבור פרופיל ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה של סמנים אפיגנטיים פוטנציאליים
במאמר זה
סיכום
תקציר
ההיסטונים שייכים למשפחה של חלבונים שמורים מאוד באיקריוטים. הם אורזים דנ"א לגרעין כיחידות תפקודיות של כרומטין. שינויים פוסט-תרגומיים (PTMs) של היסטונים, שהם דינמיים ביותר וניתן להוסיף או להסירם על ידי אנזימים, ממלאים תפקידים קריטיים בוויסות ביטוי גנים. בצמחים, גורמים אפיגנטיים, כולל PTMs היסטון, קשורים לתגובות הסתגלות שלהם לסביבה. הבנת המנגנונים המולקולריים של בקרה אפיגנטית יכולה להביא הזדמנויות חסרות תקדים לפתרונות הנדסה ביולוגית חדשניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לבודד את הגרעינים ולטהר היסטונים מרקמת עלה דורה. ההיסטונים שחולצו ניתן לנתח בצורות שלמות שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה (MS) יחד עם כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה מקוונת (RP) נוזלית (LC). שילובים stoichiometry של PTMs מרובים על אותו פרוטאופורם היסטון ניתן לזהות בקלות. בנוסף, גזירת זנב histone ניתן לזהות באמצעות זרימת העבודה מלמעלה למטה LC-MS, ובכך, מניב את הפרופיל הגלובלי PTM של היסטונים הליבה (H4, H2A, H2B, H3). יישמנו פרוטוקול זה בעבר כדי פרופיל PTMs histone מרקמת עלה דורה שנאספו ממחקר שדה בקנה מידה גדול, שמטרתו לזהות סמנים אפיגנטיים של עמידות לבצורת. הפרוטוקול יכול להיות מותאם וממוטב עבור כרומטין immunoprecipitation-רצף (ChIP-seq), או לחקר PTMs היסטון בצמחים דומים.
מבוא
החומרה הגוברת ותדירות הבצורת צפוי להשפיע על הפרודוקטיביות של גידולי דגנים1,2. דורה היא יבול מזון ואנרגיה דגנים הידוע ביכולתו יוצאת הדופן לעמוד בתנאים מגבילים מים3,4. אנו רודפים אחר הבנה מכנית של יחסי הגומלין בין מתח בצורת, פיתוח צמחים, ואפיגנטיקה של דורה[דורה bicolor (L. ) Moench] צמחים. העבודה הקודמת שלנו הוכיחה קשרים חזקים בין מיקרוביום צמחים וריזוספירה בהסתגלות בצורת ותגובות ברמה המולקולרית5,6,7. מחקר זה יסלול את הדרך לניצול הנדסה אפיגנטית בהתאמת ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת חומר עלה דורה
הערה: צמחי דורה גדלו באדמה בשדה ב Parlier, קליפורניה.
- לאסוף עלי דורה מצמחים לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל ומיד להקפיא את הצינור בחנקן נוזלי. לאסוף רקמת עלה על ידי קריעת העלה השלישי והרביעי הגיח במלואו מן ההגה הראשי.
הערה: פרטים נוספים על מצב השדה, צמיחת המדגם והאיסוף ניתן למצוא בדוח שפורסם18. - טוחנים עלים עם חנקן נוזלי ומעבירים מיד לצינור צנטריפוגה.
- יש לאחסן את עלה הקרקע ב-80°C עד לשימוש. קח בערך 4 גרם של אבקת עלה קריו-טחון לניתוח היסטון של כל דגימה.
2. הכנת מאגרים וחומרים (3-4 שעות)
הערה: ניתן לבצע את פת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות הפרוטוקול, ניתן לחלץ ולזהות את ההיסטונים באמצעות ניתוח LC-MS. הנתונים הגולמיים והתוצאות המעובדות זמינים ב- MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) באמצעות הצטרפות: MSV000085770. בהתבסס על תוצאות TopPIC מהמדגם הייצוגי (זמין גם מ MassIVE), זיהינו 303 פרוטאופורות histone (106 H2A, 72 H2B, 103 H3, ו 22 פרוטאופורות H4). פרוטאופורמים ריבוזומליים מטוהרים זוהו גם הם, בדרך כלל מגיעים מוקדם ב- LC. הם בדרך כלל מורכבים ~ 20% של proteoforms מזוהה, אבל לא חופפים עם פרוטאופורות histone eluting בשלב מאוחר יותר של שיפוע LC. ניתן לדמיי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המוצג מתאר כיצד לחלץ היסטונים מדגימות עלה דורה (או בדרך כלל עלה צמחי). התשואה הממוצעת של היסטון צפויה להיות 2-20 מיקרוגרם לכל חומר עלה דורה 4-5 גרם. החומרים טהורים מספיק לניתוח היסטון במורד הזרם על ידי LC-MS (בעיקר היסטון עם זיהום חלבון ריבוזומלי ~ 20%). ניתן להשיג תשואה נמוכה יותר עקב וריאציות מדגם, או טיפול/כשלים פוטנציאליים לאורך הפרוטוקול. שמירה על שלמות הגרעינים לפני שלב התזה הגרעיני הוא קריטי; לכן, מערבולת אגרסיבית pipetting יש להימנע לפני הוספת NLB. בנוסף, אובדן גרעינים עלול להתרחש בעת הסרת supernatants .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מודים לרונלד מור ותומאס פילמור על שעזרו בניסויי ספקטרומטריית מסה, ומתיו מונרו על תצהיר הנתונים. מחקר זה מומן על ידי מענקים ממשרד האנרגיה האמריקאי (DOE) מחקר ביולוגי וסביבתי באמצעות בקרת אפיגנטיקה של תגובת בצורת בסורגום (EPICON) פרויקט תחת מספר הפרס DE-SC0014081, ממשרד החקלאות האמריקאי (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), ובאמצעות מכון BioEnergy המשותף (JBEI), מתקן בחסות DOE (חוזה DE-AC02-05CH11231) בין המעבדה הלאומית לורנס ברקלי DOE. המחקר בוצע באמצעות המעבדה למדעי המולקולריים הסביבתיים (EMSL) (grid.436923.9), משרד DOE של מתקן משתמש מדע בחסות המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אצטוניטריל | פישר כימיקל | A955-4L | |
| דיתיותרייטול (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, תמיסה של 500 מ"מ, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500 מ"ל | |
| חומצה פורמית | Thermo Scientific | 28905 | |
| גואנידין הידרוכלוריד | סיגמא | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| אשלגן פוספט, קוקטייל מעכב | Sigma | P3786-100G | |
| , טבליות cOmplete | Roche | 5892791001 | |
| נתרן בוטיראט | סיגמא | 303410-5G | משמש למעכב היסטון דאצטילאז |
| נתרן נתרן (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| פלואוריד | סיגמא | S7020-100G | משמש למעכב פוספטאז |
| נתרן אורתוואנדאט | סיגמא | 450243-10G | משמש למעכב פוספטאז |
| סוכרוז | סיגמא | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 גרם | |
| טריטון X-100 | סיגמא | T9284-100ML | |
| שרף חילופי קטיון חלש, רשת 100-200 אנליטי (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| <חזק>חד פעמי | |||
| עמודת כרומטוגרפיה (ביו-ספין) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| רשת 100 בד סינון | Millipore Sigma | NY1H09000 | זהו חלק מערכת סיגמא (קטלוג # CELLYTPN1) למיצוי גרעיני צמחים. ניתן להשתמש במסננים דומים עם אותו גודל רשת. |
| קצות מיקרופיפטה (P20, P200, P1000) | סיגמא | ||
| , 50 מ"ל/15 מ"ל, צנטריפוגה, צינור חרוטי | Genesee Scientific | 28-103 | |
| , מיקרוצנטריפוגה, 1.5/2 מ"ל | סיגמא | ||
| <חזק>ציוד | |||
| איזון אנליטי | פישר סיינטיפיק | 01-912-401 | |
| כוסות ( 50 מ"ל – 2L) | |||
| מיקרוצנטריפוגה עם קירור | פישר סיינטיפיק | 13-690-006 | |
| מיקרופיפטות | |||
| צנטריפוגה דלי מתנדנדת עם קירור | פישר סיינטיפיק | ||
| וורטקס | פישר סיינטיפיק | 50-728-002 | |
| סוניקטור אמבט מים | פישר סיינטיפיק | 15-336-120 |
מקורות
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Clim....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
