Method Article

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

DOI:

10.3791/61713

⸱

September 9th, 2020

 ,  , 
1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF - MC), Goethe-Universität

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות מבוססת יריעות אור מציעה פתרונות יעילים לחקר תהליכים מורכבים בכמה קשקשים רלוונטיים ביולוגית. הגדרות מבוססות תא לדוגמה, אשר תוכננו במיוחד כדי לשמר את השלמות התלת מימדית של הדגימה ובדרך כלל כוללות סיבוב מדגם, הן הבחירה הטובה ביותר בביולוגיה התפתחותית. למשל, הם שימשו כדי לתעד את כל מורפוגנזה עוברית של זבוב הפירות Drosophila melanogaster ואת חיפושית הקמח האדום Tribolium castaneum. עם זאת, פרוטוקולי הדמיה חיים זמינים רבים מספקים רק מסגרות ניסיוניות לעוברים בודדים. במיוחד עבור מחקרים השוואתיים, גישות כאלה אינן נוחות, שכן דגימות בתמונה רציפה מושפעות מהשונות הסביבתית. כמו כן, זה מגביל את מספר הדגימות שניתן לציין בתוך זמן נתון. אנו מספקים מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית המגבירה את התפוקה בהגדרות מבוססות תא מדגמי ובכך מבטיחה תנאי סביבה דומים לכל הדגימות. ראשית, אנו מספקים קו מנחה לכיול עבור מיקרוסקופים פלואורסצנטיים של יריעות אור. שנית, אנו מציעים שיטת הרכבה עבור עוברים מרובים התואמת לסיבוב מדגם. שלישית, אנו מספקים מודלים תלת מימדיים למופת של הדמיה חיה של Drosophila, שעבורם אנו ממקמים שלושה קווים מהונדסים עם גרעינים מתויגים פלואורסצנטיים, כמו גם של טריבוליום, שעבורו אנו משווים את הביצועים של שלושה קווי משנה מהונדסים הנושאים את אותו טרנסג'ין, אך במקומות גנומיים שונים. הפרוטוקול שלנו תוכנן במיוחד למחקרים השוואתיים מכיוון שהוא מטפל באופן פעיל בשונות הסביבה, שתמיד קיימת בהדמיה חיה רציפה. זה חשוב במיוחד לניתוחים כמותיים ואפיון של פנוטיפים חריגים, הנובעים למשל מניסויי נוקאאוט. כמו כן, הוא מגדיל את התפוקה הכוללת, וזה מאוד נוח כאשר הגישה למיקרוסקופים פלואורסצנטיים יריעות אור מוגבלת. לבסוף, שיטת ההרכבה המוצעת יכולה להיות מותאמת עבור מיני חרקים אחרים ואורגניזמים מודל נוסף, למשל, זברה, עם בעצם שום מאמץ אופטימיזציה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא אחת מטכניקות ההדמיה החיוניות ביותר במדעי החיים, במיוחד בביולוגיה התאית וההתפתחותית. במיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונפוקאליים1, שהם המדינה-of-the-art עבור הדמיית פלואורסצנטיות תלת מימדית מאז אמצע שנות התשעים, אותה עדשה משמשת עבור עירור פלואורופור וזיהוי אור פליטה. קרן הלייזר לתאורה מרגשת את כל הפלואורופורים לאורך ציר התאורה/זיהוי והאות המופרך בהתאמה מופלה לפני הגילוי על ידי חור סיכה. לפיכך, עבור כל תמונה דו מימדית, כל הדגימה מוארת. כתוצאה מכך, עבור כל תמונה תלת מימדית, כלומר, ערימה של תמונות דו מימדיות רצופות, הדגימה כולה מוארת כמה עשרות עד כמה מאות פעמים2, אשר מקדם photobleaching ו phototoxicit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. עבודת הכנה

  1. בחר עדשת תאורה / זיהוי עדשה / שילוב מצלמה עבור LSFM שמתאים לשאלה המדעית ולהגדיר את המיקרוסקופ. גודל שדה הראייה הוא המנה של גודל שבב המצלמה והגדלת עדשת הגילוי. יש לבחור בעדשת התאורה כך שכל שדה הראייה יכסה על ידי גיליון אור מישורי גס34. שלושה שילובים מומלצים מפורטים בטבלה 1.
  2. להכנת aliquots agarose ו מנות אחזור, להוסיף 2 גרם נמוך להמיס agarose כדי 200 מ"ל autoclaved מי ברז לחמם את התערובת במיקרוגל ב 600-800 W עד שכל חלקיקי agarose מומסים. הכן כמה 1 מ"ל agarose aliquots ב 1.5 מ"ל או 2 צינורות תגובה מ"ל, ולאחר מכן למלא כמה מנות Ø פטרי 90 מ"מ 3-5 מ"מ גבוה עם agarose. אחסן aliquots מוצקים ומנות ב 4 מע....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה פלואורסצנטית השוואתית בתא מדגם מבוסס LSFMs. לדוגמה, ניתן להשתמש במסגרת כדי לחבר (i) עוברים משני מינים או יותר, (ii) עוברים של קווים שבהם גנים אחד או יותר מופקים בתוספת פקדים מסוג בר, (iii) עוברים מרובים מאותו קו מהונדס, (iv) עוברים מקווים מהונדסים שונים, או (v) עוברים מקווי משנה הנושאים את אותו טרנסגן אבל במקומות גנומיים שונים. בסעיף זה, אנו מספקים דוגמאות לשני התרחישים האחרונים.

ביישום המופתי הראשון שלנו, אנו מראים את הדינמיקה של אות הפלואורסצנטיו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד מאזורי היישום הבלעדיים של LSFMs הוא ביולוגיה התפתחותית. במשמעת זו, יש חשיבות להסתכל על דגימות חיות, אחרת לא ניתן לתאר תהליכים מורפוגנטיים באופן דינמי. מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית ב- LSFMs מבוססי תא מדגם, כמתואר כאן, נוחה משתי סיבות עיקריות.

ניתן לטפל בשונות הסביבה, שהיא בלתי נמנעת בהדמיה חיה רציפה, באופן פרו-אקטיבי. בהדמיה חיה הקשורה לעובר חרקים, אנו רואים למשל את הרגישות הבאה. תרבויות איסוף הביצים עשויות להיות בגילאים שונים בזמן איסוף העוברים. ב Drosophila, הוכח כי זה משפי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לארנסט ה. ק. סטלייזר על ההזדמנות להשתמש במשאביו, כמו גם להערותיו החשובות בנוגע לכתב היד, אניטה אנדרול על תמיכתה בהדמיה החיה של טריבוליום, סוון פלאת' על התמיכה הטכנית, כמו גם לאילן דייוויס, ניקול גריידר וג'רולד שוביגר על שיתוף קווי הדרוסופלה המהונדסים שלהם דרך מרכז המניות בלומינגטון.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צלחת 6 בארותאורנג' סיינטיפיק4430500<חזק>  צלחת
24 בארותOrange Scientific4430300רק להדמיה חיה הכוללת Tribolium
35 מ"מ ואוסלאש; צלחת פטריפישר סיינטיפיק153066רק להדמיה חיה הכוללת Drosophila.
90 מ"מ ואוסלאש; צלחת פטריפישר סיינטיפיקL9004575
100 ומיקרו; מסננת תאים בגודל רשתm BD Biosciences352360
250 ומיקרו; m מסננת בגודל רשתVWR International200.025.222-038רק להדמיה חיה הכוללת Tribolium
300 ומיקרו; m מסננת בגודל רשתVWR International200.025.222-040רק להדמיה חיה הכוללת Tribolium
710 ומיקרו; m מסננת בגודל רשתVWR International200.025.222-050רק להדמיה חיה הכוללת Tribolium
800 ומיקרו; m מסננת בגודל רשתVWR International200.025.222-051רק להדמיה חיה הכוללת Tribolium
405 קמח חיטה דקDemeter e.V.SP061006רק להדמיה חיה הכוללת Tribolium
מדיום דרוזופילה זמין מסחריתGenesee Scientific66-115רק להדמיה חיה הכוללת Drosophila / מדיום Drosophila מותאם אישית ניתן להשתמש גם
במיקרוספירות פלואורסצנטיות, 1.0 ומיקרו; מ &אוסלאש;Thermo Fisher ScientificT7282
שמרים יבשים לא פעיליםGenesee Scientific62-108
אגרוז נמס נמוךקארל רוט6351.2
בקבוקונים צריםGenesee Scientific32-109רק להדמיה חיה הכוללת Drosophila
מברשת צבע קטנהVWR International149-2121
נתרן היפוכלוריט (NaOCl), ~12% פעיל ClCarl Roth9062.3זהירות: נתרן היפוכלוריט הוא
קמח מלאDemeter e.V.SP061036רק להדמיה חיה הכוללת Tribolium / בריטניה:
בקבוקונים רחביםGenesee Scientific32-110רק להדמיה חיה הכוללת Drosophila
מאכל מקמח מלא

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
  2. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Light Sheet MicroscopySample Chamber SetupSimultaneous Embryo ImagingCobweb Holder MountingFluorescent Microsphere CalibrationDrosophila Embryo ImagingTribolium Embryo ImagingEmbryo Dechorionation ProtocolAgarose Film EmbeddingComparative Live Imaging

Related Articles