הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

סיכום

פרוטוקול זה מספק כלים ניסיוניים במבחנה כדי להעריך את הטרנספורמציה של תאי אם אנושיים. מתוארים שלבים מפורטים לקצב התפשטות תאים, יכולת צמיחה בלתי תלויה בעיגון והפצה של שושלת תאים בתרבויות תלת-מימד עם מטריצת קרום מרתף.

תקציר

Tumorigenesis הוא תהליך רב שלבי שבו תאים לרכוש יכולות המאפשרות הצמיחה שלהם, הישרדות, והפצה בתנאים עוינים. בדיקות שונות מבקשות לזהות ולכרות סימני היכר אלה של תאים סרטניים; עם זאת, לעתים קרובות הם מתמקדים בהיבט אחד של טרנספורמציה תאית, ולמעשה, בדיקות מרובות נדרשות לאפיון הנכון שלהם. מטרת עבודה זו היא לספק לחוקרים סט של כלים להערכת טרנספורמציה תאית במבחנה מנקודת מבט רחבה, ובכך לאפשר להסיק מסקנות קול.

הפעלת איתות מתמשך היא התכונה העיקרית של רקמות הגידול והוא יכול להיות במעקב בקלות תחת תנאים במבחנה על ידי חישוב מספר הכפלות האוכלוסייה שהושגו לאורך זמן. חוץ מזה, הצמיחה של תאים בתרבויות 3D מאפשר האינטראקציה שלהם עם התאים שמסביב, דומה למה שקורה vivo. זה מאפשר הערכה של צבירת תאים, יחד עם תיוג immunofluorescent של סמנים תאיים ייחודיים, כדי לקבל מידע על תכונה רלוונטית אחרת של טרנספורמציה גידולית: אובדן ארגון תקין. מאפיין יוצא דופן נוסף של תאים שהשתנו הוא יכולתם לגדול ללא חיבור לתאים אחרים ולמטריצה החוץ-תאית, אותה ניתן להעריך באמצעות מבחני המעגן.

נהלים ניסיוניים מפורטים להערכת קצב צמיחת התאים, לביצוע תיוג immunofluorescent של סמני שושלת תאים בתרבויות 3D, ולבדוק צמיחת תאים עצמאית מעגן אגר רך מסופקים. מתודולוגיות אלה ממוטבות לתאי אפיתל ראשוניים בשד (BPEC) בשל הרלוונטיות שלה בסרטן השד; עם זאת, ניתן להחיל שגרות על סוגי תאים אחרים לאחר התאמות מסוימות.

מבוא

אירועים רצופים מרובים נדרשים לפיתוח neoplasm. בשנת 2011, חנהאן ויינברג תיארו 10 יכולות המאפשרות צמיחה, הישרדות והפצה של תאים שהשתנו: מה שמכונה "סימני ההיכר של הסרטן"¹. המתודולוגיה המתוארת כאן אוספת שלושה כלים שונים להערכת טרנספורמציה תאית במבחנה על ידי התמקדות בכמה מהתכונות הייחודיות של התאים הגידוליים. טכניקות אלה מעריכות את שיעור התפשטות התאים, את התנהגות התאים כאשר הם מתורבתים תלת-מימד ואת יכולתם ליצור מושבות עם עצמאות מעגן.

מודלים של תאים חיוניים לבדיקת השערה במבחנה. גישות שונות פותחו כדי ליצור מודלים ניסיוניים של טרנספורמציה תאית לחקר^{הסרטן 2,3,}

פרוטוקול

דגימות אנושיות ששימשו בניסויים הבאים התקבלו מהפחתת mammoplasties שבוצעו ב Clínica פילאר סנט ג'ורדי (ברצלונה) בהסכמת הליך סטנדרטי. כל ההליכים מבוצעים בקבינט בטיחות ביולוגית מסוג II אלא אם צוין אחרת.

1. בתרבות במבחנה של תאי אפיתל של אמא אנושית ועלילה עקומת צמיחה הצטברות

1. בתרבות במבחנה של תאי אפיתל ראשוניים בשד (BPECs): מעבר תאים
   הערה: עבור נגזרת BPEC ותרבות תאים בצע את ההוראות המתוארות על ידי Ince et al., 2007⁶.
   1. הכנה בינונית.
      1. תוספת WIT בזל מוגדר בינוני עם תוספי P או T, המסופקים על ידי היצרן, בהתאם אם BPECs ראשי או השתנה הם מתורבתים.
      2. הוסף רעלן כולרה למדי....

תוצאות

מודל ניסיוני של טרנספורמציה תאית עם כניסתה של שלושה אלמנטים גנטיים ב- BPECs נבחר להפיק תוצאות מייצגות^{של טרנספורמציה אונקוגנית 6,7} (איור 3). BPECs שאינם משתנים (N) נגזרו רקמת שד ללא מחלות כפי שתואר על ידי Ince^{ועמיתיו 6} ותרבותי בעקבות הפרוטוקול המצוין כאן. לאחר התגברות על STASIS (מתח או חריג איתות המושרה-senescence, תופעה שנצפתה בדרך כלל בתאי אפיתל ממארי במבחנה כי הוא להתגבר על כ 4 שבוע.......

דיון

הפרוטוקולים הניסיוניים המתוארים במאמר זה מספקים כלים שימושיים להערכת השינוי האונקוגני של תאים מתורבתים במבחנה. כל טכניקה מעריכה היבטים ספציפיים של תהליך השינוי, ולכן יש להקדיש תשומת לב מיוחדת בעת סיוק מסקנות מניתוח יחיד. הצטברות עקומות צמיחה היא גישה הדורשת מידע שכבר זמין בעת culturing תאים למטרות אחרות. זה עושה טכניקה זו זול יותר וקל יותר ליישם בהשוואה לתהלוכה התפשטות תאים אחרים. עם זאת, כדי להשיג תוצאות תקפות, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת בעת ספירה ותאי זריעה בכל פעם שהם subcultured. קצב צמיחה מוגבר מעיד על

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מ"ל פיפטות סרולוגיות	Labclinics	PLC91001
1.5 מ"ל Eppendorfs	Thermo Fisher Scientific	3451	אפנדורפים כהים עדיפים לאחסון MTT לטווח ארוך
10 μ l קצות פיפטה ללא פילטר	Biologix	20-0010
		זכוכית 100 מ"ל	עם מכסה, ניתן לחיטוי
1000 μ l קצות פיפטה עם פילטר	Labclinics	LAB1000ULFNL
1000 μ l קצות פיפטה ללא פילטר	Biologix	20-1000
15 מ"ל צינורות חרוטיים	VWR	525-0400
2 מ"ל פיפטות סרולוגיות	Labclinics	PLC91002
200 μ l קצות פיפטה עם פילטר	Labclinics	FTR200-96
5 מ"ל פיפטות סרולוגיות	Labclinics	PLC91005
50 מ"ל צינורות חרוטיים	VWR	525-0304
אצטון	PanReac AppliChem	211007	משמש לקיבוע מבנה תלת מימד לפני תיוג אימונופלואורסצנטי
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	משמש לבדיקת עיגון
נוגדן אנטי-קלודין 4	Abcam	15104, RRID:AB_301650	דילול עבודה 1:100, מארח: ארנב
אנטי-ציטוקרטין 14 [RCK107] נוגדן	Abcam	9220, RRID:AB_307087	דילול עבודה 1:100, מארח:
נוגדן נגד עכבר ציאנין Cy3	Jackson ImmunoResearch Inc.	115-165-146, RRID:AB_2338690	דילול עבודה 1:500, מארח: עז
אנטי-ארנב Alexa Fluor 488 נוגדן	Thermo Fisher Scientific	A-11034, RRID:AB_2576217	דילול עבודה 1:500, מארח:
עז חיטוי
BioVoxxel ארגז		RRID:SCR_015825
תרבית תאים 24 בארות Plate	Labclinics	PLC30024	משמש לתרביות תלת מימד ב-Matrigel. תרבית תאים תחתונה שטוחה
6 בארות	מעבדות	PLC30006	משמש לבדיקת עיגון
אינקובטור תאים (37 º C ו-5% CO2)
מסנני תאים	Fisherbrand	11587522	גודל רשת: 40 μ m
תוכנת CellSense	אולימפוס		שימש לרכישת תמונה
צנטריפוגה
כולרה רעלן מ- Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	משמש להשלמת מדיום תרבית תאים
Class II ארון בטיחות ביולוגי	Herasafe	HAEREUS HS12
מיקרוסקופ הפוך קונפוקלי	Leica	TCS SP5
משקפי כיסוי	Witeg Labortechnik GmbH	4600122	22 X 22 מ"מ, עובי 0.13 - 0.17 מ"מ
DAPI			2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine
סרום בקר	עוברי Biowest	S1810	משמש להשבתת תוכנת
פיג'י (ImageJ)	המכונים הלאומיים לבריאות	RRID:SCR_002285	הורדה בחינם, אין צורך ברישיון
זכוכית פסטר פיפטות
זכוכית מגלשות זכוכית	Fisherbrand	11844782
Goat Serum	Biowest	S2000	משמש לאימונופלואורסצנציה של מבנים תלת מימדיים
כפפות			המשמשות למניפולציה אגר לאחר חיטוי
אמבט חימום (37 º ג)			משמש למתן תמיסות לפני תת-תרבית תאים
אמבט חימום (42 º ג)			משמש לשמירה על חום
אגר צלחת			המשמשת להתייבשות מטריג'ל
תא			משמש לדגירת נוגדנים במהלך אימונופלואורסצנציה
קרח			המשמש במהלך מניפולציה של מטריג'ל
קופסת
מיקרוסקופ אופטי הפוך	אולימפוס	IX71
Matrigel Matrix	Becton Dickinson	354234	חנות ב -20 º C ולשמור על קור בעת השימוש. מכונה מטריצת ממברנת מרתף
מתנול	PanReac AppliChem	131091	משמש לקיבוע מבנה תלת מימדי לפני תיוג אימונופלואורסצנטי
Micropipette			p1000, p200 ו-p10
Microsoft Office Excel	Microsoft	RRID:SCR_016137	משמש לחישוב הכפלת האוכלוסייה ולהשגת משוואת קצב הגידול
MilliQ מים			מכונה
לק			במיוחד משמש לאיטום דגימות לאחר הרכבה
Parafilm M	Bemis	PM-999	משמש לכיסוי תמיסת נוגדנים במהלך הדגירה
PBS pH 7.4 (ללא סידן ומגנזיום)	Gibco	10010-056	סטרילי. משמש לתת-תרבית תאים
טבליות PBS	Sigma-Aldrich	P4417	מדלל במי milliQ. אין צורך בסטריליות. משמש לאימונופלואורסצנציה
Pipette Aid
Primaria T25 צלוחיות	קורנינג	353808	משמש לשרביט תרבית BPEC
מונה תאים אוטומטי	Millipore	PHCC20060	לחלופין, השתמש במספריים
			המשמשים לחיתוך קצות פיפטה ופרפילם
מסננים סטריליים 0.22 μ m	Millipore	SLGP033RS	משמש לסינון תמיסת MTT
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128	Store ב -20 º C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	משמש לאימונופלואורסצנציה של מבנים תלת מימדיים
Trypsin-EDTA 10X	Biowest	X0930	לדלל ב-PBS כדי להשיג פתרון 3X
Vectashield Antifade הרכבה	מעבדות וקטור	H-1000
WIT-P-NC CULTURE MEDIUM	Stemgent	00-0051	משמש לתרבית BPEC ראשונית
WIT-T תרבית בינונית		00-0047	משמשת לתרבית BPEC טרנספורמציה

בקבוק עכבר כלים צלחת עמידות בחום חימום לח קרח מים טהורים המוציטומטר בינוני