מאמר שיטה

יצירת מודלים ניסיוניים אקוטיים וכרוניים של ביטוי טיק מוטורי בחולדות

DOI:

10.3791/61743

⸱

27 במאי 2021

 ,  , 
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקולים ליצירת מודלים ניסיוניים אקוטיים וכרוניים של ביטוי טיק בחולדות שמתנהגות בחופשיות. הדגמים מבוססים על השתלת קנולה סטריאטלית ויישום אנטגוניסט גאבא עוקב. המודל החריף משתמש בזריקות ארעיות ואילו המודל הכרוני משתמש בחליטות ממושכות באמצעות משאבה מיני-אוסמוטית מושתלת תת עורית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיקים מוטוריים הם תנועות פתאומיות, מהירות, חוזרות ונשנות שהן הסימפטומים העיקריים של תסמונת טורט והפרעות טיק אחרות. הפתופיזיולוגיה של דור הטיק קשורה לעיכוב חריג של הגרעינים הבסיסיים, במיוחד מבנה הקלט העיקרי שלה, הסטריאטום. במודלים של בעליחיים של מכרסמים ופרימטים שאינם אנושיים, יישום מקומי של גאבא אנטגוניסטים, כגון bicuculline ו picrotoxin, לתוך החלקים המוטוריים של הסטריאטום גורם disinhibition המקומי וכתוצאה מכך ביטוי של טיקים מוטוריים.

כאן, אנו מציגים מודלים אקוטיים וכרוניים של טיקים מוטוריים בחולדות. במודל החריף, microinjections bicuculline דרך קנולה מושתל בסטריאטום הגב לעורר את הביטוי של טיקים שנמשך פרקי זמן קצרים של עד שעה. המודל הכרוני הוא חלופה המאפשרת הארכה של ביטוי טיק לתקופות של מספר ימים או אפילו שבועות, תוך שימוש עירוי מתמשך של bicuculline באמצעות משאבה מיני עורית.

המודלים מאפשרים לחקור את המנגנונים ההתנהגותיים והנוירונים של דור הטיק לאורך מסלול הגרעינים הקורטיקו-בזל. המודלים תומכים בהשתלת מכשירי הקלטה וגירוי נוספים בנוסף לקאנולות ההזרקה, ובכך מאפשרים מגוון רחב של שימושים כגון גירוי חשמלי ואופטי והקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לכל שיטה יתרונות וחסרונות שונים: המודל החריף מאפשר השוואה בין תכונות התנועה הקינטמטיות לבין השינויים האלקטרופיזיולוגיים המתאימים לפני, במהלך ואחרי ביטוי טיק וההשפעות של מאפננים לטווח קצר על ביטוי טיק. מודל אקוטי זה הוא פשוט להקים; עם זאת, הוא מוגבל לתקופה קצרה של זמן. המודל הכרוני, אף שהוא מורכב יותר, הופך את המחקר של דינמיקת טיק והשפעות התנהגותיות על ביטוי טיק על פני תקופות ממושכות. לפיכך, סוג השאילתה האמפירית מניע את הבחירה בין שני מודלים משלימים אלה של ביטוי טיק.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיקים הם הסימפטום המגדיר של תסמונת טורט (TS) והפרעות טיק אחרות. טיקים מתוארים כתנועות פתאומיות, מהירות, חוזרות ונשנות (טיקים מוטוריים), או ניקוד (טיקים קוליים)1. ביטוי טיק משתנה בדרך כלל בזמן (תדירות)2 ומרחבי (אינטנסיביות, מיקום הגוף)3 מאפיינים על פני סולמות זמן מרובים (שעות, ימים, חודשים, ושנים). שינויים אלה מושפעים מגורמים שונים, כגון תכונות סביבתיות4,5, מצבים התנהגותיים6,7, ודיכוי מרצון וזמני8.

למרות המנגנון העצבי השולט טיקים מוטוריים עדיין לא מובן לחלוטין, מספר גדל והולך של מחקרים תיאורטיים וניסיוניים סיפקו ראיות חדשות על טבעו9. כיום, הפתופיזיולוגיה של דור הטיק נחשבת כרוכה בלולאה הגרעינית הקורטיקו-בסיסית (CBG), ובמיוחד קשורה לעיכוב חריג של הסטריאטום, גרעין הקלט העיקרי של הגרעינים הבסיסיים10,11,12. מחקרים קודמים מכרסמים ופרימטים הראו כי הסטריאטום יכול להיות מנוכה על ידי יישום מקומי של אנטגוניסטים שונים גאבאA, כגון bicuculline ו picrotoxin13,14,15,16,17,18. התערבות פרמקולוגית זו מובילה לביטוי טיק מוטורי חולף בצד הנגדי להזרקה, ובכך ליצור מודל אקוטי חזק של הפרעות טיק עם פנים ולבנות תוקף. המודל החריף הוא פשוט כדי לגרום ומאפשר ללמוד את ההשפעות של אפנון לטווח קצר כגון גירוי חשמלי ואופטי במקביל הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ו קינמטיות לפני, במהלך ואחרי ביטוי טיק. עם זאת, המודל החריף מוגבל לתקופת הזמן הקצרה שלאחר ההזרקה. בהתבסס על המודל החריף, הצענו לאחרונה מודל כרוני של דור טיק בחולדות המשתמש עירוי ממושך, קבוע של bicuculline כדי striatum באמצעות משאבה מיני אוסמוטית מושתל תת עורית19. מודל זה מאריך את התקופה של ביטוי טיק למספר ימים/שבועות. שחרור מתמיד של bicuculline על פני תקופה ארוכה של זמן מאפשר בדיקה של ההשפעות של מגוון רחב של גורמים כגון טיפולים תרופתיים מצבים התנהגותיים על ביטוי טיק.

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים ליצירת מודלים אקוטיים וכרוניים של ביטוי טיק בחולדות. כפונקציה של שאלת המחקר הספציפית, הפרוטוקולים מאפשרים כוונון עדין של הפרמטרים כולל השתלה חד צדדית לעומת דו-צדדית, אתר הטיקים (על פי הארגון הסומטוטופי של הסטריאטום)18 וזווית השתיל-קנולה (בהתאם למיקום של מכשירים מושתלים נוספים). השיטה המשמשת במודל הכרוני מבוססת בחלקה על מוצרים מסחריים אך עם התאמות קריטיות שיתאימו לדגם הטיק. מאמר זה מפרט את ההתאמות הדרושות להתאמה אישית של דגמי טיק אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים אושרו ומפוקחים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים ודבקו במדריך הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ובהנחיות אוניברסיטת בר-אילן לשימוש ולטיפול בחיות מעבדה במחקר. פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה הלאומית לניסויים בבעלי חיים במעבדה במשרד הבריאות.

הערה: פרוטוקול זה משתמש בחולדות לונג-אוונס נקבה (מודלים אקוטיים וכרוניים) וחולדות Sprague Dawley נקבה (מודל חריף) בגילאי 3-10 חודשים, 280-350 גרם. היישום של מודלים אלה זנים אחרים, משקולות או גילאים צריך להיבדק בזהירות לתגובה שונה.

1. דגם אקוטי

  1. הכנה לפני הניתוח
    1. הכנת קנולה לשתלים
      הערה: הצינורית השתל מאפשרת זריקות ביקולין מקומיות לתוך הסטריאטום.
      1. חותכים צינורית נירוסטה, 25 גרם (OD 0.02'', ID 0.015'') כדי להשיג צינורית השתל(איור 1, מכשיר #1). השתמש בכלי סיבובי כדי להשיג קצוות ישרים. אורך הצינורית תלוי בעומק יעד ההשתלה, בזווית השתלת הצינורית ובגובה הכובע המקודד הסופי. עומק יעד ההשתלה צריך להיות גבוה ב-2 מ"מ (0.079') מיעד ההזרקה הסופי כדי למנוע נזק לרקמות.
        הערה: האובייקט הגבוה ביותר המושתל קובע את גובה המכסה.
      2. חול להחליק את הקצוות שתל קנולה, מניעת חיכוך מכונאי נוסף למוח. הכנס מחט 30 G (0.01 '') דרכו כדי להסיר את כל החסימות הפנימיות.
    2. הכנת דמה
      הערה: הבובה היא חוט פנימי נשלף הממוקם בתוך הצינורית המושתלת. הבובה אוטמת את הצינורית המושתלת, ובכך מונעת את חסימתה.
      1. הפוך בובה על ידי חיתוך חוט 0.013 '' עם כלי סיבובי. הבובה צריכה להיות ארוכה ב-3 מ"מ (0.118 אינץ') מאורך הצינורית(איור 1, המכשיר #2).
      2. הכנס את הבובה לתוך הצינורית השתל עד שהוא מגיע לסוף. לכופף את החוט העודף על ידי צובט אותו נגד הצינורית. החלק הכפוף צריך להיות סומק עם השתלה-הצינורית כדי למנוע את הבובה ליפול מתוך הצינורית המושתלת, ולמנוע מהחולדה להסיר אותו.
    3. הכנת מזרק
      הערה: המזרק, המורכב מצינור גמיש וקנולה להזרקה(איור 1, מכשיר #3), מאפשר הזרקה ישירה של דו-קולין לתוך הסטריאטום.
      1. גזור צינור מיקרובור פולימרי גמיש של 70 ס"מ (27.559') (OD 0.06'', ID 0.02'')(איור 1, התקן #3.1).
        הערה: אורך הצינור הגמיש מוגדר על ידי המרחק בין כלוב הניסוי למיקום מכונת משאבת העירוי. זה חייב להיות ארוך מספיק כדי לאפשר תנועה חופשית של החולדה במהלך תקופת ההזרקה, אבל לא יותר מדי זמן, כדי למנוע את החולדה להסתבך בו (ראה איור 3A).
      2. חותכים צינורית נירוסטה, 30 G (OD 0.012'', ID 0.007''' צינורית כדי להשיג הזרקה-צינור(איור 1, המכשיר #3.2). השתמש בכלי סיבובי כדי להשיג קצוות ישרים. זה צריך למדוד 5 מ"מ (0.197 '') ארוך יותר מאשר השתל-צינור: 2 מ"מ (0.079 '') ארוך יותר מאשר הצינור המושתל בתוך המוח כדי להגיע ליעד ההזרקה הסופי, ו 3 מ"מ (0.118 '') כדי להכניס אותו לתוך הצינור הגמיש.
      3. חול להחליק את קצה ההזרקה-הצינורית, מניעת חיכוך מכונאי נוסף למוח. הכנס חוט בקוטר 0.005' כדי לוודא שהוא ללא הפרעה.
      4. הכנס 3 מ"מ (0.118 '') של ההזרקה-צינור לתוך הצינור הגמיש להדביק את המפרק ביניהם, כדי לקבל מזרק. השתמש דבק ציאנואקרילאט (CA) ומאיץ CA.
      5. חבר מזרק עם מחט 25 G (0.018 '') מלא מים סטריליים למזרק ולשטוף אותו דרך. זה מבטיח כי כיוון הזרימה יוצא של ההזרקה-הצינורית הוא ישר וללא מאמץ. באופן מכריע, אם הזרימה אינה ישרה, השתמש בקצה של מחט 30 G (OD 0.01 '') כדי להסיר את כל החסימות ולהגדיל את חור ההזרקה-קנולה, ולאמת מחדש את הזרימה.
    4. הכנת מחזיק קנולה
      הערה: מחזיק הצינורית מחובר לזרוע הסטראוטקסית ומחזיק את הצינורית במהלך ההשתלה. מחזיק הצינורית מורכב מבסיס מחזיק קנולה ומ עופרת מחזיקת קנולה, המודבקים יחד (איור 1, מכשיר #4). במהלך ההשתלה, בסיס מחזיק הצינורית מחובר לזרוע הסטראוטקסית, ועופרת מחזיק הצינורית מחוברת לשתול-קנולה.
      1. בסיס מחזיק קנולה: חתוך 10 ס"מ (3.947'') של נירוסטה, 22 גרם (OD 0.028'', ID 0.017'') hypo-tube(איור 1,מכשיר #4.1).
      2. עופרת מחזיקת קנולה: חותכים חוט בגודל 0.013 אינץ' לאורך של 3 מ"מ (0.118 אינץ') ארוך יותר מהתבנית-שתל הרצויה(איור 1, המכשיר #4.2).
      3. הכנס את עופרת מחזיק הצינורית לבסיס מחזיק הצינורית והדבק את המפרק ביניהם, באמצעות דבק CA ומאיץ CA. העופרת צריכה להיות קצרה ב-1 מ"מ (0.039') מהשתל-קנולה, כדי למנוע נזק לרקמות במהלך ההשתלה.
    5. הכנת ביקולין: להמיס מתיאודיד bicuculline מלוחים פיזיולוגיים או נוזל שדרתי מלאכותי (ACSF) לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μL. מחלקים את הביסקולין המומס למזרקים של 1 מ"ל, מכסים בנייר אלומיניום ומקפיאים ב-20°C עד לצורך. בעת הצורך, להפשיר את המזרק לפני השימוש.
  2. כירורגיה
    1. לגרום להרדמה ראשונית על ידי הצבת החולדה בתא מעוצב ולספק 4-5% isoflurane מעורבב עם חמצן בקצב של 0.5-1 L / min. לאחר מכן, להזריק את החולדה תוך שרירית (IM או IP) עם קטמין ו Xylazine (100 ו 10 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה) תערובת.
    2. לגלח את ראשו של החולדה באמצעות קוצץ חשמלי.
    3. שים ג'ל לידוקאין באוזני החולדה. שים ג'לי נפט על עיני החולדה כדי למנוע ייבוש קרנית וטראומה.
    4. אבטחו את החולדה במסגרת הסטריאוטיפית באמצעות מוטות אוזניים ומוט שיניים.
    5. לנגב את הקרקפת של החולדה עם יוד povidone ולאחר מכן עם אלכוהול לנגב כדי לעקר את האזור. לחדור לאורך קו החתך הרצוי עם 0.5 - 1% פתרון לידוקאין תת עורית (SC). באמצעות להב אזמל, לעשות חתך לאורך הקרקפת.
    6. משוך את fascia לכיוון הקצוות כדי לפתוח את האזור הכירורגי.
    7. לנקות את הגולגולת עם מלוחים סטריליים, באמצעות צמר גפן. במקרה של דימום, להשתמש צריבה כדי לצרוב את נימי הדם. צעד זה חיוני ליציבות הכובע לאורך זמן.
    8. מהדקים את הפאשיה בארבעה המוסטטים מעוגלים (שני חז"ל, שניים אחוריים) כדי להגדיל את האתר הכירורגי.
    9. למדוד את קואורדינטות ברגמה ולמבדה. רמה את הקואורדינטות dorsoventral (DV) של שתי הנקודות, כך שהם נמצאים בטווח של 100 מיקרומטר.
    10. באמצעות המנגנון הסטראוטקסי, למדוד ולסמן את הקואורדינטות של אזורי עניין ברגים עוגן להיות מושתל. קואורדינטות קנולה השתלה ישר עבור אינדוקציה טיק באזור forelimb הם: AP: +1 כדי +1.5, מ"ל: ±2.5, DV: 3; אזור בדיעבד: AP: -0.4 עד -0.5, מ"ל: ±3.5, DV:318,20.
      הערה: במקרה של השתלת מכשירים מרובים המונעים השתלת קנולה ישר, לשנות את הזווית של השתלת קנולה ואת הקואורדינטות שלה בהתאם (קואורדינטות forelimb: AP: +2.7, mL: ±2.5, DV: 3, זווית 15 ° מן זווית 15° מן הצפי האחורי).
    11. לקדוח חורים בגולגולת מתחת למיקרוסקופ. השתמש במכונת מקדחה דנטלית עם 1/4-1/2 סיביות בגודל קרביד עגול burs. כדי למזער את הסיכונים לפגיעה מוחית, התאם את מהירות התרגיל בהתאם לכישורי הקידוח והימנע מלחץ מכונאי. מקדחים עד שהמוח נראה לעין, בערך 1 מ"מ. סופגים כל דם עם צמר גפן ושוטפים עם מלוחים סטריליים.
      הערה: ברגי העוגן משמשים לייצוב המכסה. ודא שהברגים ממוקמים בשתי ההמיספרות ולאורך הציר האחורי-אחורי.
    12. השתלת קנולה
      1. בורג בורגי העוגן לתוך החורים. השתמש #0 נירוסטה x 1/8 ברגים בגודל.
        הערה: מספר בורגי העיגון תלוי במספר הכולל של התקנים מושתלים. ברגים קרקעיים (למשל להקלטות חשמליות או גירויים חשמליים) צריכים להגיע לפני השטח של המוח.
      2. חבר את מחזיק הצינורית לזרוע הסטראוטקסית.
      3. החלק את קנולה השתל על מחזיק הצינורית. מקם לאט את הצינורית מעל החור עד שהוא מגיע למוח.
      4. מדוד את קואורדינטות ה- DV החל מפני השטח של המוח. הורידו את הצינורית עד ליעד ההשתלה. לספוג כל דם יוצא מהחור עם צמר גפן, לשטוף עם מלוחים סטריליים ולאחר מכן לייבש ביסודיות.
      5. הדבק את הצינורית המושתלת לגולגולת באמצעות דבק ג'ל. חכו לייבוש.
      6. יש למרוח מלט דנטלי לאורך הצינור המושתל כדי לחבר אותו לגולגולת. השאר 2 מ"מ (0.079''' להאריך מקצהו העליון כדי לאפשר החדרת דמה. חכו לייבוש.
        הערה: אין לשים מלט על מחזיק הצינורית.
      7. הרם את מחזיק הצינורית, והשאיר את הצינורית המושתלת במקומה.
      8. הכנס את הבובה לתוך הצינורית המושתלת.
      9. שתל את כל המכשירים האחרים כגון מערכי הקלטה, סיבים אופטיים, אלקטרודות גירוי וכו '. החל מלט דנטלי על שאר הגולגולת, מכסה את כל השתלים.
      10. להזריק 3 מ"ל של הפתרון של טמפרטורת החדר רינגר ו carprofen 5 מ"ג / קילוגרם SC21.
      11. לפקח על החולדה עד שהיא חוזרת להכרה (החיה זקופה, יש שליטה על דרכי הנשימה שלה והוא לא בסכנת שאיפה). החזירו את החולדה לכלוב הביתי שלה להחלמה מלאה.
  3. מיקרו-לינקים
    הערה: במהלך ההזרקה, חיוני לוודא כי זרימת bicuculline הוא שלם. זה יכול להיעשות על ידי מתן צורה בועת אוויר קטנה במזרק וניטור התנועה שלה. הנפח הנותר של המזרק עשוי להיות מלא מלוחים, כך שאין bicuculline מבוזבז.
    1. חבר את המזרק למזרק bicuculline עם מחט 25 גרם (OD 0.018 '''). למלא ~ 1/3-1/2 של המזרק ולהסיר את המזרק, המאפשר היווצרות של בועת אוויר קטנה.
    2. חבר את המזרק למזרק סטרילי מלא מלוחים עם מחט 25 גרם (OD 0.018 ''). ממלאים את המזרק עד שהביקולין מגיע לסוף ונוזל קטן יוצא ממנו.
    3. הסר את הוכנה של מיקרו-מזרק זכוכית מדויק של 10 μL.
    4. חותכים ומחברים צינור פולימר קצר גמיש (~ 3 ס"מ, 1.181 '') למיקרו-סירינג זכוכית מדויק.
    5. חבר את הקצה השני של הצינור הקצר והגמיש למזרק 1 מ"ל, מחט 25 G (OD 0.018'') מלא במים סטריליים.
    6. להזריק מים דרך הצינור קצר גמיש לתוך microsyringe זכוכית דיוק עד מים יוצאים ממנו. נתק את הצינור הקצר-גמיש.
    7. הכנס מחדש את הוכנה עד שתגיע לסימן ~ 7 μL על מיקרו-מזרק הזכוכית המדויק.
    8. הכנס את מיקרו-מזרק הזכוכית המדויק לתוך החריץ המיועד במכונת משאבת העירוי.
    9. חבר את המזרק למיקרו-מזרק הזכוכית המדויק וקבע את תצורת ההגדרות לקצב של 0.35 μL/min ולנפח כולל של 0.35 μL.
    10. שים נייר לנגב מתחת לקצה המזרק. סמן את מיקום בועת האוויר על המזרק, הפעל את מכונת משאבת העירוי וודא שמופיעה טיפת דו-קולין. לאחר ההזרקה, סמן שוב את מיקום בועת האוויר.
      הערה: ההבדל בין שני הסימנים תואם להבדל הרצוי במהלך ההזרקה הניסיונית.
    11. שים את החולדה בכלוב הניסיוני ותסיר את הבובה.
    12. הכנס את המזרק לתוך הצינורית המושתלת עד הסוף (ראו איור 3A).
    13. הפעל את מכונת משאבת העירוי. ודא שועת האוויר זזה. הפעל את שעון העצר כדי לעקוב אחר זמני ייזום וסיום טיק.
    14. דקה לאחר ההזרקה, להסיר את המזרק לאט להחזיר את הבובה.
      הערה: החדרת הבובה לאחר ההזרקה דוחפת את הביקוליין לתוך יעד ההזרקה.
  4. הזרקת פוסט
    1. נתק את המזרק ממיקרו-מזרק הזכוכית המדויק.
    2. לשטוף את הפתרון הנותר מן המזרק, באמצעות מזרק מלא אוויר. לנקות את המזרק עם מים סטריליים ולאחר מכן לנקז אותו על ידי הזרקת אוויר דרך המזרק.
    3. נתק את מיקרו-מזרק הזכוכית המדויק ממכונת משאבת העירוי ונקה אותו במים סטריליים.

2. מודל כרוני

  1. הכנה לפני הניתוח
    1. הכנת מדריך קנולה
      הערה: מדריך הצינורית הוא חלק מצינור העירוי ומשמש לחיבור הצינור-צינורית-הצינורית למחזיק הצינורית במהלך ההשתלה.
      1. גזור 12 מ"מ (0.472''' של נירוסטה, 25 גרם (OD 0.02'', ID 0.015'') hypo-tube כדי להשיג מדריך קנולה(איור 2,#1 המכשיר). השתמש בכלי סיבובי כדי להשיג קצוות ישרים.
      2. הכינו מחזיק קנולה כמתואר בשלב 1.1.4. הכנס את מחזיק הצינורית למדריך הצינורית כדי לוודא שהוא מחובר כראוי ולהסיר אותו.
    2. הכנת אינפוזיה-קנולה
      הערה: הצינורית-הצינורית היא גם חלק מצינור העירוי. הוא מושתל לתוך המטרה הסופית של הסטריאטום ומאפשר עירוי מוקדי של bicuculline.
      1. לחתוך נירוסטה, 30 G (OD 0.012'', מזהה 0.007'') hypo-tube כדי לקבל עירוי-צינורית. השתמש בכלי סיבובי כדי להשיג קצוות ישרים. אורך העירוי-קנולה הכולל הוא סכום עומק ההשתלה הרצוי בתוספת גורם בטיחות (~ 1-2 מ"מ, 0.039'-0.079''), החלק הכפוף של הצינורית-קנולה (2 מ"מ, 0.079''), החפיפה עם מדריך הצינורית (3 מ"מ, 0.118'') והחלק האופקי (4 מ"מ, 0.157'' )(איור 2, מכשיר #2).
        הערה: שלא כמו המודל החריף, עומק ההשתלה שווה ליעד העירוי הסופי.
      2. הכנס חוט בקוטר 0.005 אינץ' לתוך הצינורית-הצינור ולכופף אותם לצורת L במיקום המיועד. החלק האנכי מתאים לעומק ההשתלה הרצוי בתוספת 4-5 מ"מ (0.157'-0.197'' והחלק האופקי באורך 4 מ"מ (0.157'').
        הערה: החדרת החוט הפנימי מונעת חסימה של הצינורית במהלך הכיפוף.
    3. הכנת צנתור צינורות גמישים
      הערה: זהו גם מרכיב של צינור עירוי. הוא מחבר את הצינור-צינורית למשאבה המיני-אוסמוטית באמצעות מתאם צינורות.
      1. גזור 8 ס"מ (3.149''' של פוליאתילן (PE)-10 צינורות (מזהה 0.011'',OD 0.025'')(איור 2, #3 המכשיר).
        הערה: אורך הקטטר נקבע לפי המרחק בין יעד ההשתלה למיקום המשאבה, ומאפשר תנועה חופשית של הראש והצוואר של החולדה (ראו איור 3B).
    4. הרכבה של צינור העירוי
      הערה: צינור העירוי מוליך את הביקולין מהמשאבה המיני-אוסמוטית למוח. הוא מורכב ממדריך הקנולה, הצינור-קנולה, צינורות הקטטר הגמישים, מתאם הצינור ומנחה הזרימה(איור 2).
      1. הסר את החוט הפנימי מן הצינור-הצינורית. בדוק את הצינורית מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שקצוותיה פתוחים ונקיים משני הצדדים; אם לא, השתמש במחט 30 G (OD 0.01'') כדי לפתוח אותה.
      2. הדבק את הצינורית-מדריך לחלק האנכי של הצינורית-הצינורית, ליד החלק העקום, על החפיפה של 3 מ"מ (0.118''), באמצעות דבק CA ומאיץ CA.
      3. הכנס את החלק האופקי של הצינור-צינורית לתוך צנתר-צינורות גמישים. החפיפה צריכה להיות לפחות 2 מ"מ (0.079'').
      4. הוצא את המכסה השקוף של מנחה הזרימה של המשאבה. זה יחשוף את צינור הצינור קנולה נירוסטה קצר(איור 2, מכשיר #5.1).
        הערה: מנחה הזרימה הוא חלק מערכת המשאבה המיני-אוסמוטית. הוא מורכב מכובע שקוף, חלק קנולה קצר, אוגן לבן וחלק קנולה ארוך. חלק הצינור הארוך מוכנס למשאבה המיני-אוסמוטית והחלק הקצר של הצינורית מחובר לצינורות הקטטר באמצעות מתאם צינורות.
      5. טבלו את מתאם הצינור(איור 2, מכשיר #4) ב-70% אלכוהול. המתן מספר דקות כדי לאפשר לחומר להתנפח.
      6. חבר את מתאם הצינור לחלק הקנולה הקצר של מנחה הזרימה, עד שהוא נוגע באגן הלבן(איור 2, ההתקן #5.2). מתאם הצינור יתכווץ באוויר כדי ליצור חיבור אטום הדוק.
      7. הכנס את צינורות הקטטר הגמישים לקצה הפתוח של מתאם הצינור, עד שהוא נוגע בחלק הקנולה הקצר של מנחה הזרימה.
      8. החזק את חלק הצינור הארוך(איור 2, התקן #5.3) באמצעות מעמד קליפ והדבק את כל החיבורים. החיבורים הם בין מתאם הצינור והאגן הלבן, מתאם הצינור וצינורות הקטטר הגמישים, ולבסוף צינורות הקטטר הגמישים והחלק האופקי של הצינורית-צינורית. המתן מספר שעות עד שהדבק יבש לחלוטין (בהתאם לסוג הדבק).
        הערה: השתמש בדבק תואם PE כדי למנוע את שחרור החיבורים.
      9. להזריק מים סטריליים דרך קנולה ארוכה-חלק של צינור עירוי, באמצעות מזרק עם 27 G (0.014 '') מחט קהה. ודא כי המים זורמים בצורה חלקה דרך הצינורית-הצינורית. להזריק אוויר דרך צינור העירוי כדי לנקז את המים.
    5. פרימינג של משאבת המיני-אוסמוטית
      הערה: הפרימינג הוא הליך סטארט-אפ המאפשר למשאבה להתחיל את העירוי מיד לאחר ההשתלה.
      1. ממלאים אמבט חימום במים בטמפרטורת הגוף (~ 37 מעלות צלזיוס). ממלאים תמיסת מלח קטנה עם מלוחים סטריליים ומניחים אותה באמבט החימום.
      2. לעטוף את המשאבה osmotic מיני עם נייר לנגב, ולתקן אותו אנכית עם הפתח פונה כלפי מעלה, באמצעות מעמד מחזיק קליפ.
      3. למלא את המשאבה עם ACSF באמצעות מזרק עם 27 G (0.014 '') מחט קהה. בעת הסרת המזרק, להמשיך להזריק את ACSF כדי למנוע אוויר מלהיכנס. בועת ACSF תופיע בצמצם של המשאבה.
        הערה: עירוי ACSF הראשוני מאפשר לחולדה להתאושש באופן מלא מניתוח לפני טיקים הם המושרה. לחלופין, ניתן להשתיל את המשאבה המלאה בביקוקולין במהלך הניתוח הראשוני כדי למנוע את החלפת המשאבה הבאה, אך היא אינה אופטימלית19.
      4. חבר מזרק, 27 G (0.014 '') מחט בוטה לחלק קנולה ארוך של צינור עירוי ולהזריק ACSF דרכו. בעת הסרת המזרק, להמשיך להזריק את ACSF, כדי למנוע אוויר מלהיכנס. בועת ACSF תופיע בחלק הקנולה הארוך.
      5. הכנס את חלק הצינורית הארוך לתוך המשאבה, בועה לבועה. בועת ACSF צריכה להופיע בקצה הצינור-הצינורית.
      6. שים את המשאבה בקס. ראש המשאבה, מחובר צינור עירוי, לפחות 4-6 שעות (ב ~ 37 מעלות צלזיוס) לפני השתלת משאבה. ודא שרק המשאבה יוצרת קשר עם מלוחים.
    6. ניתוח השתלת משאבה
      1. הרדמה החולדה על פי פרוטוקול ההרדמה. ראה שלב 1.2.1.
      2. גילחו את ראש החולדה ובגב, בעזרת קוצץ חשמלי, מעט אחורי לשכם.
      3. בצע את השלבים הבסיסיים בניתוח, כמתואר בשלבים 1.2.3-1.2.11. החתך צריך להיות לאורך הקרקפת עד העצם העורפית.
      4. לעקר hemostat גדול (~ 14 ס"מ אורך, 5.512 '') ב autoclave. הכנס את ההמוסטט דרך החתך וצור כיס תת עורי בגב החולדה על ידי פתיחה וסגירה לסירוגין מתחת לעור דרך קו האמצע.
        הערה: הכיס צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל את המשאבה ולאפשר לו לנוע מעט.
    7. משאבה מיני אוסמוטית והשתלת צינור עירוי
      1. מחברים את מחזיק הצינורית לזרוע הסטראוטקסית ומניחים אותה בתנוחה הרצויה להשתלה.
      2. מוציאים את המשאבה מאמבטיית החימום ומניחים אותה על גב החולדה מכוסה במגבון נייר.
      3. החלק את המדריך קנולה של צינור עירוי על מחזיק הקנולה.
      4. החזיקו את המשאבה עם המוסטט והכניסו אותה בעדינות לכיס התת עורי.
      5. שתל את ברגי העוגן.
        הערה: שתל את ברגי העוגן לאחר החדרת המשאבה, כדי למנוע חסימה של פתח הכיס, ולפני השתלת הצינורית כדי למנוע עקירת קנולה.
      6. השתל את הצינורית-הצינורית במטרה והדבק אותה לגולגולת באמצעות דבק ג'ל. חכו לייבוש. הקואורדינטות עבור אינדוקציה טיק forelimb הם: AP: +1 כדי +1.5, מ"ל: ±2.5, DV: 5.
      7. החל מלט שיניים לאורך הצינורית-הצינורית כדי לתקן אותו לגולגולת. חכו לייבוש.
      8. הרם את מחזיק הצינורית והשאיר את הצינורית המושתלת במקומה.
      9. שתל את כל המכשירים האחרים. החל מלט דנטלי על שאר הגולגולת, מכסה את כל השתלים. השאירו מספיק צינורות קטטר גמישים בכיס התת עורי ללא תיקונים כדי לאפשר תנועה חופשית של החולדה.
        הערה: ודא שאין אזורים חשופים בין הגולגולת לבין פתח הכיס, וכי הקטטר אינו כפוף.
      10. סיים את הניתוח כמפורט בשלבים 1.2.12.10-1.2.12.11.
  2. ניתוח החלפת משאבה
    הערה: לכל סוג משאבה מיני-אוסמוטי יש תקופת עירוי משלוח קבועה מראש משלו. לפיכך, ניתוח החלפת המשאבה צריך להתבצע לפני תאריך התפוגה.
    1. הכנה לפני הניתוח
      1. חזור על שלבים 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. למלא את המשאבה עם bicuculline באמצעות מזרק עם 27 גרם (0.014 '') מחט קהה. בעת הסרת המזרק, להמשיך להזריק bicuculline, כדי למנוע אוויר מלהיכנס.
      3. הכנס את מנחה הזרימה (המחובר למכסה השקוף שלו) בתוך המשאבה.
      4. שים את המשאבה בקס. ראש המשאבה לפחות 4-6 שעות (ב ~ 37 מעלות צלזיוס) לפני החלפת משאבה.
    2. כירורגיה
      1. יש למרדים את החולדה (ראו שלב 1.2.1.1) לגלח את גבה באמצעות קוצץ חשמלי.
      2. לנגב את הגב של החולדה עם יוד povidone ולאחר מכן עם אלכוהול לנגב כדי לעקר את האזור. לחדור לאורך קו החתך הרצוי עם פתרון לידוקאין 0.5-1% (SC).
      3. בצע חתך על העור מעל המשאבה המושתלת. לשטוף את הכיס עם טמפרטורת החדר ACSF ויבש עם רפידות גזה. השתמש וילונות חד פעמיים autoclaved כדי לכסות את האזור ליד החתך.
      4. נתק את המשאבה המלאה ב- ACSF ממנחה הזרימה באמצעות היסטט והשליך.
      5. מוציאים את המשאבה המלאה בביקולין מאמבט החימום. נתק והשליך את מנחה הזרימה מהמשאבה המלאה בביקוקולין.
      6. חברו בעדינות את המשאבה המלאה בביקוקולין למתווך הזרימה המושתל. הימנע מנגיעה בעור שמסביב.
        הערה: יש לבצע במהירות שלבים 2.2.2.4-2.2.2.6 כדי למנוע בועות אוויר. עם זאת, המשאבה צריכה להיות מוכנסת לאט כדי למנוע כניסה מהירה של bicuculline לתוך המוח.
      7. הקש על שני השוליים של החתך באופן הדוק זה לזה, באמצעות מלקחיים. הדבק את קו החתך עם דבק רקמה. כחלופה, סגור את החתך באמצעות תפרים.
      8. לנגב את האזור עם יוד povidone ולהשלים את הניתוח כמפורט בשלבים 1.2.12.10-1.2.12.11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים ליצירת מודלים אקוטיים וכרוניים עבור אינדוקציה טיק בחולדות הוצגו לעיל. הפרוטוקולים מכסים את ההכנה המלאה לניתוחים ולניסויים (איור 1 לדגם החריף, איור 2 לדגם הכרוני). היישום של bicuculline לתוך האזורים המוטוריים של הסטריאטום תוצאות הביטוי של טיקים מוטוריים מתמשכים. טיקים מופיעים בצד הנגדי ליישום ומאופיינים בהתכווצויות שרירים קצרות וחוזרות על עצמו. לאחר יישום bicuculline לחלקים האחוריים של הסטריאטום, טיקים באים לידי ביטוי בדרך כלל בחזית החולדה, הראש ו / או...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בכתב יד זה, פירטנו את הפרוטוקולים של המודלים החריפים וה הכרוניים לאיחוי טיק בחולדה שמתנהגת בחופשיות. פרוטוקולים אלה מתארים את הכנת כל הרכיבים, הניתוח ואת התהליך הניסיוני אשר ניתן להתאים להתאמה אישית כדי לענות על צרכי מחקר ספציפיים. העיקרון העיקרי שבבסיס מודלים אלה הוא יישום מקומי ישיר של bicuculline לאזורים המוטוריים של הסטריאטום, אשר ידוע לשחק תפקיד מפתח בפתופיזיולוגיה של הפרעות טיק10,11,12. בשני הדגמים, bicuculline מועבר למטרה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק של הקרן הלאומית למדע (ISF) (297/18). המחברים מודים למ' ברונפלד על הקמת מודל המכרסמים החריף ולמר ישראלשווילי על דבריה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ברגי עוגןמחברים מיקרו SMPPS0002#0 x 1/8 - ברגי מתכת עם ראש פאן
Bicuculline methiodideSigma Aldrich14343
מאיץ ציאנואקרילט (CA)ZapPT29
Cyanoacrylate (CA) דבקBSIIC-2000דבק זה נמצא חזק יותר מאחרים
מלט שינייםקולטןH00322חומר תיקון סלסול היגייני Reline שרף ריפוי עצמי
דבק ג'לLoctiteאולטרה ג'ל בקרת
HemostatWPI501242כל המוסטט בגודל של כ 14 ס"מ יספיק
היפו-צינור, קיר דק במיוחד 25Gחברת אספקת רכיביםHTX-25X
היפו-צינור, קיר רגיל 22Gחברת אספקת רכיביםHTX-22R
היפו-צינור, קיר רגיל 30Gחברת אספקת רכיביםHTX-30R
מכונת משאבת עירוי מערכותמשאבות עידן חדשNE-1000
משאבה מיני אוסמוטיתALZET20011.0 ומיקרו; l לשעה, 7 ימים
דבק תואם PECEYSפלסטיק קשה מיוחד (מתאים ל-PE)
צינורות קטטר PE-10ALZETPE-10ID = 0.28 מ"מ, OD = 0.61 מ"מ
מיקרו-מזרק זכוכית מדויק, 10µ lהמילטון800651701 RNR 10 ומיקרו; l syr (22s / 51/3)
דבק רקמות3M1469SbVetbond
צינורות מתאםCMA3409500
Tygon מיקרו קידוח צינורות, 0.02 אינץ 'מזהה * 0.06 ODחברת אספקת רכיביםTND80-020
חוט 0.005 אינץ'חברת אספקת רכיביםGWX-0050
חוט 0.013 אינץ'חברת אספקת רכיביםGWX-0130

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Psychiatric Association. DSM-5. American Psychiatric Association. , (2013).
  2. Peterson, B. S., Leckman, J. F. The temporal dynamics of tics in Gilles de la Tourette syndrome. Biol.Psychiatry. 44, 1337-1348 (1998).
  3. Ganos, C., et al. The somatotopy of tic inhibition: where and how much. Movement Disorders. , (2015).
  4. Barnea, M., et al. Subjective versus objective measures of tic severity in Tourette syndrome - The influence of environment. Psychiatry Research. 242, 204-209 (2016).
  5. Silva, R. R., Munoz, D. M., Barickman, J., Friedhoff, A. J. Environmental Factors and Related Fluctuation of Symptoms in Children and Adolescents with Tourette's Disorder. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 36 (2), 305-312 (1995).
  6. Rothenberger, A., et al. Sleep and Tourette syndrome. Advances in Neurology. 85, 245-259 (2001).
  7. Conelea, C. a, Woods, D. W., Brandt, B. C. The impact of a stress induction task on tic frequencies in youth with Tourette Syndrome. Behaviour Research and Therapy. 49 (8), 492-497 (2011).
  8. Ganos, C., Rothwell, J., Haggard, P. Voluntary inhibitory motor control over involuntary tic movements. Movement Disorders. 33 (6), 937-946 (2018).
  9. Yael, D., Vinner, E., Bar-Gad, I. Pathophysiology of tic disorders. Movement Disorders. 30 (9), 1171-1178 (2015).
  10. Kurvits, L., Martino, D., Ganos, C., Eddy, C. M. Clinical Features That Evoke the Concept of Disinhibition in Tourette Syndrome. Frontiers in Psychiatry. 11, 1-10 (2020).
  11. Mink, J. W. Basal ganglia dysfunction in Tourette's syndrome: a new hypothesis. Pediatric Neurology. 25, 190-198 (2001).
  12. Bronfeld, M., Bar-Gad, I. Tic disorders: what happens in the basal ganglia. The Neuroscientist. 19 (1), 101-108 (2013).
  13. Tarsy, D., Pycock, C. J., Meldrum, B. S., Marsden, C. D. Focal contralateral myoclonus produced by inhibition of GABA action in the caudate nucleus of rats. Brain. 101 (1), 143-162 (1978).
  14. Crossman, A. R., Mitchell, I. J., Sambrook, M. A., Jackson, A. Chorea and Myoclonus in the Monkey Induced By Gamma-Aminobutyric Acid Antagonism in the Lentiform Complex. Brain. 111 (5), 1211-1233 (1988).
  15. McCairn, K. W., Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. The neurophysiological correlates of motor tics following focal striatal disinhibition. Brain. 132 (8), 2125-2138 (2009).
  16. Worbe, Y., et al. Behavioral and movement disorders induced by local inhibitory dysfunction in primate striatum. Cerebral Cortex. 19 (8), 1844-1856 (2009).
  17. Pogorelov, V., Xu, M., Smith, H. R., Buchanan, G. F., Pittenger, C. Corticostriatal interactions in the generation of tic-like behaviors after local striatal disinhibition. Experimental Neurology. 265, 122-128 (2015).
  18. Bronfeld, M., Yael, D., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Motor tics evoked by striatal disinhibition in the rat. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 50(2013).
  19. Vinner, E., Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Prolonged striatal disinhibition as a chronic animal model of tic disorders. Journal of Neuroscience Methods. 292, 20-29 (2017).
  20. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6, (2007).
  21. Flecknell, P. Analgesia and Post-Operative Care. Laboratory Animal Anaesthesia. , (2016).
  22. Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Corticostriatal divergent function in determining the temporal and spatial properties of motor tics. Journal of Neuroscience. 35 (50), 16340-16351 (2015).
  23. Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Spatial and temporal properties of tic-related neuronal activity in the cortico-basal ganglia loop. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8713-8721 (2011).
  24. McCairn, K. W., et al. A Primary Role for Nucleus Accumbens and Related Limbic Network in Vocal Tics. Neuron. 89 (2), 300-307 (2016).
  25. Rizzo, F., et al. Aripiprazole Selectively Reduces Motor Tics in a Young Animal Model for Tourette's Syndrome and Comorbid Attention Deficit and Hyperactivity Disorder. Frontiers in Neurology. 9, 1-11 (2018).
  26. Vinner, E., Matzner, A., Belelovsky, K., Bar-gad, I. Dissociation of tic expression from its neuronal encoding in the striatum during sleep. bioRxiv. , (2020).
  27. Webster, K. E. Cortico-striate interrelations in the albino rat. Journal of Anatomy. 95, Pt 4 532-544 (1961).
  28. Ebrahimi, A., Pochet, R., Roger, M. Topographical organization of the projections from physiologically identified areas of the motor cortex to the striatum in the rat. Neuroscience Research. 14, 39-60 (1992).
  29. Brown, L. L., Sharp, F. R. Metabolic mapping of rat striatum: somatotopic organization of sensorimotor activity. Brain Research. 686, 207-222 (1995).
  30. Brown, L. L., Smith, D. M., Goldbloom, L. M. Organizing principles of cortical integration in the rat neostriatum: Corticostriate map of the body surface is an ordered lattice of curved laminae and radial points. Journal of Comparative Neurology. 392 (4), 468-488 (1998).
  31. Yael, D., Tahary, O., Gurovich, B., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Disinhibition of the nucleus accumbens leads to macro-scale hyperactivity consisting of micro-scale behavioral segments encoded by striatal activity. The Journal of Neuroscience. , 3120(2019).
  32. Obeso, J. A., Rothwell, J. C., Marsden, C. D. The spectrum of cortical myoclonus. From focal reflex jerks to spontaneous motor epilepsy. Brain. 108, 124-193 (1985).
  33. Bronfeld, M., et al. Bicuculline-induced chorea manifests in focal rather than globalized abnormalities in the activation of the external and internal globus pallidus. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3261-3275 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Motor TicsBicuculline MicroinjectionStriatal DisinhibitionChronic Infusion ModelAcute Tic ModelCannula ImplantationMini Osmotic PumpCortico Basal GangliaElectrophysiological RecordingsBehavioral Analysis

מאמרים קשורים