פרוטוקול זה מציג מערכת תרבות חדשנית, חזקה וניתן לשחזור כדי ליצור ולגדל ספרואידים תלת מימדיים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2. התוצאות מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה זו לחקר ביולוגיה של תאי גזע סרטן, כולל התגובה לכימותרפיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל תלת מימדי של ספרואידים לחקר תאי גזע סרטניים המעי הגס
במאמר זה
סיכום
תקציר
סרטן המעי הגס מאופיין בהטרוגניות ובארגון היררכי הכולל אוכלוסייה של תאי גזע סרטניים (CSCs) האחראים על התפתחות הגידול, תחזוקתו והעמידות לתרופות. הבנה טובה יותר של מאפייני CSC עבור המיקוד הספציפי שלהם היא, אם כן, דרישה מוקדמת לטיפול יעיל. עם זאת, יש מחסור במודלים פרה-קוליניים מתאימים לחקירות מעמיקות. למרות הפריה דו מימדית (2D) קווי תאים סרטניים לספק תובנות חשובות לתוך הביולוגיה הגידול, הם לא לשכפל את ההטרוגניות גידול פנוטיפי וגנטי. לעומת זאת, מודלים תלת מימדיים (תלת מימדיים) מטפלים ומשכפלים מורכבות סרטן כמעט פיזיולוגית והטרוגניות של תאים. מטרת עבודה זו הייתה לעצב מערכת תרבות תלת-ממדית חזקה הניתנת לשחזור לחקר הביולוגיה של CSC. המתודולוגיה הנוכחית מתארת את הפיתוח והאופטימיזציה של תנאים ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים, שהם הומוגניים בגודלם, מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2, מודל שניתן להשתמש בו לתרבות ארוכת טווח. חשוב לציין, בתוך הכדורואידים, התאים שאורגנו סביב מבנים דמויי לומן, התאפיינו בדפוסי התפשטות תאים דיפרנציאליים ובנוכחות CSCs המבטאים פאנל של סמנים. תוצאות אלו מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה תלת-ממדית זו לחקר הטרוגניות התא וביולוגיה של CSC, כולל התגובה לכימותרפיה.
מבוא
סרטן המעי הגס (CRC) נשאר הגורם המוביל השני של מקרי מוות הקשורים לסרטן בעולם1. הפיתוח של CRC הואתוצאהשל רכישה מתקדמת והצטברות של מוטציות גנטיות ו / או שינויים אפיגנטיים 2,3, כולל הפעלה של אונקוגנים והפעלה של גנים מדכאי גידול3,4. יתר על כן, גורמים לא גנטיים (למשל, microenvironment) יכול לתרום ולקדם טרנספורמציה oncogenic ובכך להשתתף באבולוציה של CRCs5. חשוב לציין, CRCs מורכבים מאוכלוסיות תאים שונות, כולל CSCs מובחנים ותאי גידול בתפזורת המציגים כמה תכונות בידול, המהוות מבנה היררכי המזכיר את ארגון האפיתל בקריפ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הפרטים של כל ריאגנטים וחומרים מפורטים בטבלת החומרים.
1. היווצרות ספרואידית
- מדיית תרבות ספרואידית
- הכינו מדיום בזלי המורכב מ-DMEM בינוני הנשר שעבר שינוי של Dulbecco בתוספת 4 מ"מ L-אלניל-ל-גלוטמין דיפטיד.
- הכינו מדיום מלא של DMEM המכיל 10% סרום שור עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטומיצין) במדיום בסיסי משלב 1.1.1.
- הכן מדיום מטריצת קרום DMEM/מרתף המכיל מטריצת קרום מרתף של 2.5%, FBS 10% ו- 1% עט/סטרפטוקוקוס במדיום בסיסי משלב 1.1.1.
- הכנת צלחות להיווצרות ספרואידית
- מטריצה חמה של בזל ו- DMEM / ממברנה במרתף בינונית בטמפרטורת החדר (RT) במשך כ -20 ד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כמו חוסר הומוגניות בגודל של ספרואידים הוא אחד החסרונות העיקריים של מערכות תרבות 3D ספירואיד זמין כיום13, המטרה של עבודה זו הייתה להקים פרוטוקול אמין לשחזור כדי להשיג כדוריות הומוגניות. ראשית, כדי לקבוע תנאי עבודה אידיאליים, נבדקו מספר שונה של תאי Caco2, הנעים בין 50 ל-2,000 תאים למיקרווול/ספרואיד באמצעות לוחות ייעודיים(טבלה 1). למעשה, כל באר בלוחות אלה מכילה 1,200 מיקרו-בתים, מה שמאפשר היווצרות של אותו מספר של ספרואידים לבאר, וחשוב מכך, היווצרות של.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אין ויטרו מודלים 3D להתגבר על החסרונות הניסיוניים העיקריים של תרביות תאים סרטניים 2D, כפי שהם נראים אמינים יותר recapitulating תכונות גידול טיפוסי כולל microenvironment והטרוגניות התא. מודלים תלת-ממדיים נפוצים של ספרואידים הם נטולי פיגומים (בתרבית בתנאים של התקשרות נמוכה) או מבוססי פיגומים (שימוש בביו-חומרים לתאי תרבות). שיטות אלה מציגות חסרונות שונים כפי שהם תלויים באופי הפיגום המשמש או להוליד spheroids כי הם משתנים במבנה ובגודל.
הפרוטוקול הנוכחי מדווח על תנאים ממוטבים לייצור ספרואידים הומוגנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף
תודות
אנו מכירים בפלטפורמות ההדמיה וההיסטולוגיה של אניפת רצ'ה (CRCL, CLB). אנו חייבים לבית המרקחת של בית החולים סנטר לאון ברארד (CLB) עבור המתנה האדיבה של FOLFOX ו FOLFIRI. אנו מודים גם לבריג'יט מנשיפ על הקריאה הביקורתית של כתב היד. העבודה נתמכה על ידי FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) ועל ידי האינקה (PLBIO19-289). MVG ו- LC קיבלו תמיכה מה- FRM ו- CF שקיבלו תמיכה מקרן ARC ומהמרכז לאון ברארד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 37 ומיקרו; m מסננת הפיכה, גדולה | STEMCELL Technologies | 27250 | לשימוש עם 50 מ"ל צינורות חרוטיים |
| 5-פלואורואורציל | מתנה מבית המרקחת של המרכז לאון ברארד (CLB) | - תמיסת מלאי, 5 מ"ג/100 מ"ל; ריכוז סופי, 50 ומיקרו; גרם/מ"ל | |
| אגרוז | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 צלחות 24 בארות | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 מיקרו-בארות לבאר להיווצרות וצמיחה של ספרואידים |
| אנטי קספאז3 - איתות | תאי | 9661 | דילול 1:200 |
| אנטי מוסאשי-1 (14H1) - עכברוש | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | דילול 1:500 |
| תמיסת שטיפה נגד הידבקות x 100 מ"ל | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - דילול עכברוש | Invitrogen | 14-133-82 | :100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | דילול 1:2000 |
| Anti-PCNA - דילול עכבר | Dako | M0879 | 1:1000 |
| Anti-β-catenin - עכבר | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | דילול 1:50 |
| שחור צלחות מולטיוול | תרמו פישר סיינטיפיק | 237108 | |
| חומצת לימון מונוהידראט | סיגמא | C1909 | |
| מנגנון CLARIOstar | BMG Labtech | קורא מיקרו-פלטות | |
| עט | עט דאקו לסימון עיגולים על שקופיות ליצירת מחסומים לנוזלים | ||
| חמור נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | דילול 1:1000 |
| חמור נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | דילול 1:1000 |
| חמור אנטי-ארנב IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | דילול 1:1000 |
| חמור אנטי-ארנב IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | דילול 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| מדיום הרכבה פלואורוג'ל עם DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| נוגדן משני נגד חולדה IgG (H+L) נספג צולב, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | דילול 1:1000 |
| תוכנת | ניתוח תמונה ספרואידית | ||
| Irinotecan& נ.ב.פ; | מתנה מתמיסת מלאי CLB | , 20 מ"ג/מ"ל; ריכוז סופי, 100 ומיקרו; g/mL | |
| iScript טרנסקריפט הפוך טרנסקריפטאז | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | מתנה מבית מרקחת CLB-stock Solution | , 50 מ"ג/מ"ל; ריכוז סופי, 25 ומיקרו; g/mL | |
| מטריג'ל מטריצת ממברנה מרתף | קורנינג | 354234 | מטריצת ממברנת בסיסית |
| RNA XS | Macherey-Nagel | 740902.250 | |
| אוקסליפלטין | מתנה מבית מרקחת CLB-stock | תמיסה, 100 מ"ג/20 מ"ל; ריכוז סופי, 10 & מיקרו; גרם/מ"ל | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Salt (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | כתם חומצת גרעין; דילול 1:5000 |
| טריפסין-EDTA (0.05 %) | גיבקו | ||
| 25300062 Zeiss-Axiovert | מיקרוסקופ הפוך לרכישת תמונות של ספרואידים |
מקורות
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
