מאמר שיטה

הכנת דגימה בסיר אחד בעזרת נשא לניתוח פרוטאומיקה ממוקד של מספר קטן של תאים אנושיים

DOI:

10.3791/61797

⸱

6 בנובמבר 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2NHC Key Laboratory of Cancer Proteomics, Department of Oncology, Xiangya Hospital, Central South University, 3Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 4Department of Critical Care Medicine, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת דגימה בסיר אחד בסיוע נשא חלבון יחד עם כרומטוגרפיה נוזלית (LC) - ניטור תגובה נבחרת (SRM) המכונה cLC-SRM היא שיטה נוחה לניתוח פרוטאומיקה ממוקדת מרובה של מספר קטן של תאים, כולל תאים בודדים. הוא מנצל את השימוש בחלבון אקסוגני מוגזם כנשא ו-LC-SRM בעל סגוליות גבוהה לכימות ממוקד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח חלבונים של מספר קטן של תאים אנושיים מושג בעיקר על ידי פרוטאומיקה ממוקדת עם בדיקות אימונולוגיות מבוססות נוגדנים, שיש להן מגבלות מובנות (למשל, מולטיפלקס נמוך וחוסר זמינות של נוגדנים לחלבונים חדשים). פרוטאומיקה ממוקדת מבוססת ספקטרומטריית מסה (MS) הופיעה כחלופה מכיוון שהיא נטולת נוגדנים, מולטיפלקס גבוה ובעלת ספציפיות ודיוק כמותי גבוהים. ההתקדמות האחרונה במכשור טרשת נפוצה מאפשרת פרוטאומיקה ממוקדת מבוססת טרשת נפוצה לכימות מרובה של חלבונים בשפע רב בתאים בודדים. עם זאת, קיים אתגר טכני לעיבוד יעיל של תאים בודדים עם אובדן דגימה מינימלי לניתוח טרשת נפוצה. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו לאחרונה הכנת דגימה בסיר אחד בסיוע נשא חלבון יחד עם כרומטוגרפיה נוזלית (LC) - ניטור תגובה נבחרת (SRM) הנקרא cLC-SRM לניתוח פרוטאומיקה ממוקד של מספר קטן של תאים אנושיים. שיטה זו מנצלת את השימוש בחלבון אקסוגני מוגזם משולב כנשא ועיבוד סיר אחד בנפח נמוך כדי להפחית מאוד את הפסדי ספיחת פני השטח כמו גם LC-SRM בעל סגוליות גבוהה כדי לטפל ביעילות בטווח הריכוז הדינמי המוגבר עקב תוספת של חלבון נשא אקסוגני. התועלת שלו הוכחה על ידי כימות מדויק של החלבונים הנפוצים ביותר במספר קטן של תאים (למשל, 10-100 תאים) וחלבונים בשפע רב בתאים בודדים. התכונות הקלות ליישום ואין צורך בהתקנים ספציפיים הופכים שיטה זו לנגישה בקלות לרוב מעבדות הפרוטאומיקה. כאן סיפקנו פרוטוקול מפורט לניתוח cLC-SRM של מספר קטן של תאים אנושיים כולל מיון תאים, ליזה ועיכול תאים, ניתוח LC-SRM וניתוח נתונים. יש צורך בשיפורים נוספים ברגישות הזיהוי ובתפוקת הדגימה לקראת ניתוח פרוטאומיקה ממוקד של תא בודד. אנו צופים כי cLC-SRM ייושם באופן נרחב במחקר ביו-רפואי וביולוגיה מערכתית עם פוטנציאל להקל על רפואה מדויקת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה בגנומיקה (טרנסקריפטומיקה) מאפשרת ניתוח מקיף ומדויק של הגנום (טרנסקריפטום) בתאים בודדים 1,2,3. עם זאת, טכנולוגיות פרוטאומיקה של תא בודד משתרכות הרחק מאחור אך חשובות לא פחות מטכנולוגיות גנומיקה (טרנסקריפטומיקה) 4,5,6,7,8. יתר על כן, לא בהכרח ניתן להסיק שפע חלבון משפע mRNA9, והפרוטאום מורכב ודינמי יותר מהטרנסקריפטום10. בהתחשב באתגרים אלה, מספר רב של אוכלוסיות מעורבות של תאים (כלומר, תאים בתפזורת) משמשים בדרך כלל ליצירת נתוני פרוטאום מקיפים 11,12,13. עם זאת, מדידות בתפזורת כאלה מבצעות ממוצע של וריאציות סטוכסטיות של תאים בודדים, ובכך מטשטשות שונות חשובה בין תא לתא (כלומר, הטרוגניות של תאים)4,14. המגבלות של מדידות בתפזורת כאלה הופכות חמורות עוד יותר כאשר התאים המעניינים מהווים רק חלק קטן מכלל אוכלוסיות התאים (למשל, תאי גזע סרטניים בתוך גידולים בשלב מוקדם של סרטן). לכן, קיים פער ידע עצום בין פרוטאומיקה של תא בודד לבין גנומיקה (טרנסקריפטומיקה).

בדיקות אימונולוגיות מבוססות נוגדנים (למשל, זרימה או ציטומטריית מסה) משמשות בעיקר לניתוח פרוטאומי ממוקד של תאים בודדים 6,7,15,16,17,18. עם זאת, הם סובלים ממולטיפלקס נמוך, ספציפיות מוגבלת וחוסר זמינות של נוגדנים לחלבונים חדשים מעניינים. פרוטאומיקה ממוקדת מבוססת ספקטרומטריית מסה (MS) התגלתה כחלופה לכימות מדויק של חלבון בגלל היותה נטולת נוגדנים, מולטיפלקס גבוה (≥150 חלבונים בניתוח יחיד19), דיוק כימות גבוה (כמויות או ריכוזים מוחלטים) וסגוליות ושחזור גבוהים (≤10% CV)20,21,22,23. ההתקדמות המשמעותית האחרונה בהכנת הדגימות אפשרה פרוטאומיקה של תא בודד מבוססת טרשת נפוצה לניתוח כמותי של חלבונים בשפע רב מתאים אנושיים בודדים. עם זאת, פרוטאומיקה חד-תאית מבוססת טרשת נפוצה עדיין נמצאת בשלב הינקות המוקדם. לדוגמה, פלטפורמת MS המתקדמת ביותר בשילוב עם קצבי זרימה RPLC בזרימה נמוכה במיוחד יכולה לאפשר זיהוי וכימות של MS ללא תוויות של ~670-870 חלבונים מתוך סך ≥12,000 חלבונים בתאי HeLa בודדים24,25.

נכון לעכשיו, ישנן שש גישות פרוטאומיקה של תא יחיד מבוססות MS הזמינות לניתוח של תאי יונקים בודדים, כאשר ארבע מיועדות לפרוטאומיקה גלובלית (nanoPOTS: הכנה מבוססת ננו-באר בסיר אחד לדגימות עקבות26; iPAD-1: מכשיר משולב לניתוח פרוטאום לניתוח תא בודד27; ניתוח פרוטאומי של תא יחיד מבוסס שבב OAD (שמן-אוויר-טיפה)28; SCoPE-MS: פרוטאומיקה של תא בודד על ידי ספקטרומטריית מסה29) והשניים האחרים מיועדים לפרוטאומיקה ממוקדת (cLC-SRM: כרומטוגרפיה נוזלית בעזרת נשא (LC) - ניטור תגובה נבחרת (SRM)30; cPRISM-SRM: הפרדות בלחץ גבוה בסיוע נשא ברזולוציה גבוהה עם בחירה חכמה וריבוב יחד עם SRM31). עם זאת, לכל הגישות הללו יש חסרונות טכניים. nanoPOTS, iPAD-1 ו-OAD מקטינים את נפח עיבוד הדגימה ל-2-200 נ"ל ואינם מוכנים ליישומים רחבים 26,27,28. עבור SCoPE-MS, נושא TMT (תג מסה טנדם) מתווסף לאחר עיבוד תא בודד, כך שהוא אינו יכול למנוע ביעילות הפסדי ספיחה פני השטח במהלך עיבוד הדגימה כאשר צינור בודד משמש לעיבוד תא בודד29, וכתוצאה מכך שחזור נמוך עם מקדם מתאם של ~0.2-0.4 בלבד בין שכפולים32. עבור cLC-SRM ו-cPRISM-SRM, שימוש בחלבונים אקסוגניים כנשא מתאים יותר לפרוטאומיקה ממוקדת מכיוון שפפטידים מחלבונים אקסוגניים מוגזמים מרוצפים לעתים קרובות על ידי MS/MS, מה שמפחית מאוד את הסיכוי לריצוף פפטידים אנדוגניים בשפענמוך 30,31. בניגוד לפרוטאומיקה גלובלית לכימות יחסי, שתי גישות הפרוטאומיקה הממוקדות יכולות לספק ניתוח חלבון מדויק או מוחלט של מספר קטן של תאים עם יכולת שחזור גבוהה באמצעות תקנים פנימיים כבדים המסומנים באיזוטופים בריכוזים ידועים. בהשוואה ל-cPRISM-SRM הדורש פיצול PRISM קודם ברזולוציה גבוהה, וכתוצאה מכך דגימות שבר רבות שיש לנתח, ל-cLC-SRM יש יתרון משמעותי בתפוקת הדגימה ללא פיצול ויכול לכמת בו זמנית מאות חלבונים בניתוח יחיד אך עם רגישות זיהוי נמוכה יחסית30. לכן, cLC-SRM נגיש יותר וצריך להיות בעל כלי עזר רחבים יותר לניתוח חלבון מרובה מדויק של מספר קטן של תאים כמו גם דגימות מוגבלות מסה.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לביצוע cLC-SRM לניתוח פרוטאומיקה ממוקד נוח של מספר קטן של תאים אנושיים, כולל תאים בודדים. הפרוטוקול מורכב מהשלבים העיקריים הבאים: מיון תאים על ידי FACS (מיון תאים מופעל פלואורסצנטי), ליזה ועיכול של תאים המעובדים בשפופרות תגובת שרשרת פולימראז בודדת (PCR) בנפח נמוך, איסוף נתוני LC-SRM וניתוח נתוני SRM באמצעות תוכנת Skyline זמינה לציבור (איור 1). התועלת הרחבה שלו הודגמה יחד עם מבחני ה-SRM המבוססים שלנו בעבר על ידי כימות ממוקד מוחלט של חלבוני מסלול EGFR/MAPK בתאי 1-100 MCF7 או MCF10A וקביעת עותקי חלבון מסלול לכל תא בטווח דינמי רחב של ריכוזים30. אנו צופים שעם הפרוטוקול המפורט רוב חוקרי הפרוטאומיקה יוכלו ליישם בקלות cLC-SRM במעבדותיהם לניתוח חלבונים מדויק של דגימות אולטרה-קטנות (למשל, תאי גידול נדירים) כדי לענות על צרכי הפרויקט שלהם.

figure-introduction-1
איור 1: סקירה כללית של כל השלבים ב-cLC-SRM (הכנת דגימה בסיר אחד בסיוע c יחד עם liquid chromatography -sנבחר reaction monitoring). מעכלי ליזאט תאים לא אנושיים (למשל, Shewanella oneidensis) משמשים לטיפול מקדים בצינורות PCR לציפוי פני הצינור. מספר קטן של תאים אנושיים או תאים בודדים הממוינים על ידי FACS נאספים לתוך צינורות PCR שטופלו מראש. נושא חלבון BSA (או פרוטאום ליזאט תאים לא אנושי), תקן פנימי כבד (IS) ו-TFE (או DDM) מתווספים לצינורות הדגימה ברצף כדי להקל על ליזיס התאים ולהפחית את הפסדי ספיחת פני השטח. מבחינה רעיונית, השילוב של DDM ונושא פרוטאום ליזאט תאים לא אנושיים יעבוד היטב עבור cLC-SRM. ליזיס תאים מתבצע על ידי סוניקציה, ודנטורציית חלבון מושגת על ידי חימום בטמפרטורה גבוהה. ריאגנטים DTT ו-IAA משמשים להפחתה ואלקילציה, בהתאמה (שלב זה הוא אופציונלי). טריפסין מתווסף לעיכול עם יחס גבוה בהרבה של טריפסין על פני כמות חלבון מאשר לעיכול טריפסין רגיל. מכסה צינור הדגימה מוסר ולאחר מכן מוחדר צינור PCR לבקבוקון LC לניתוח LC-SRM ישיר. נתוני SRM שנאספו מנותחים באמצעות תוכנת Skyline הזמינה לציבור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ניתוח cLC-SRM שלב אחר שלב מוצג באיור 1.

1. טיפול מקדים בצינורות PCR

  1. הוסף 100 מיקרוליטר של עיכול ליזאט תאים לא אנושיים (למשל, Shewanella oneidensis) ב-0.2 מיקרוגרם/מיקרוליטר לצינורות PCR. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי לצפות את פני צינור ה-PCR.
  2. הסר את עיכול הליזאט של התאים על ידי פיפטינג, שטוף את צינורות ה-PCR במים בדרגת HPLC 3 פעמים, ולאחר מכן יבש את צינורות ה-PCR במכסה אדים.
  3. אחסן צינורות PCR מצופים במקפיא של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

2. מיון FACS

  1. יישר סדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי (FACS) (ראה טבלת חומרים) לתוך צלחת PCR של 96 בארות באמצעות חרוזי פלורסנט עם צבעים שניתן לעורר על ידי מקור הלייזר כדי לספק אותות ייחוס אמינים.
  2. ודא שמכונת ה-FACS מכוונת היטב למיון תאים לתחתית לוחות ה-PCR.
    1. הגדר את זווית זרם המיון למינימום האפשרי כדי למקסם את אחוזי ההצלחה שהתאים ימוינו לתחתית הבארות במקום לפגוע בצדדים.
    2. כדי לכוון את המכונה, השתמש בזרם הבדיקה כדי 'למיין' טיפות של מאגר PBS (למשל, 100 טיפות) על הבאר של צלחת ריקה כדי לוודא שהטיפות שנאספו נמצאות בתחתית. אם הטיפות לא נוחתות במיקום הנכון, כייל מחדש את סדרן התאים וחזור על הפעולה עד שהטיפות בזרם המיון ייאספו כהלכה.
  3. הנח את צינורות ה-PCR המצופים לתוך מתלה צינורות PCR עם 96 בארות.
  4. מיין את המספרים הרצויים של תאי שד אנושיים (MCF7 או MCF10A) לצינורות PCR מצופים מראש.
  5. צנטריפוגה מיידית של תאי השד הממוינים ב-100 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשמור אותם בתחתית הצינור כדי למנוע אובדן תאים פוטנציאלי.
  6. אחסן את התאים הממוינים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.

3. הוספת נשא חלבון, תקנים פנימיים כבדים ו-TFE

  1. הוסף 4 מיקרוליטר של 25 מ"מ NH4HCO3 לצינורות PCR המכילים תאים שנאספו.
  2. הוסף 1 מיקרוליטר של 10 ננוגרם/מיקרוליטר אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-25 מ"מ NH4HCO3 לתוך צינורות הדגימה.
  3. הוסף 0.3 מיקרוליטר של תקני פפטיד כבד גולמי של 100 fmol/μl (סה"כ 30 fmol) לתוך צינורות הדגימה.
    הערה: ציטוטים של תקני פפטידים כבדים גולמיים עבור חלבוני מסלול EGFR/MAPK מיוצרים בריכוז נומינלי של 100 fmol/μL ב-25 מ"מ NH4HCO3. הוצא את הנפח הקטן של תקני פפטיד כבד גולמי ב-100 fmol/μL לאמצע התמיסה וודא שאין שאריות נוזל בקצה הפיפט.
  4. הוסף 9 מיקרוליטר של 100% TFE לצינורות דגימה עם הריכוז הסופי של ~60% TFE.
  5. צנטריפוגה ב 1500 x גרם למשך 5 דקות ולאחר מכן מערבולת בעדינות ב 100 x גרם למשך 3 דקות.

4. ליזיס תאים ודנטורציית חלבונים

  1. תאי שד ממוינים ב-FACS סוניקט על קרח למשך דקה אחת במרווחים של דקה אחת בסך הכל 5 מחזורים במשרעת 70% ו-0.5 הרץ.
  2. דגירה של דגימות בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לדנטורציה של חלבון באמצעות תרמו-סייקלר PCR עם אפשרות מכסה מחומם.
    הערה: TFE הוא ממס נדיף עם נקודת רתיחה של 74 מעלות צלזיוס, וכך נבחרת אפשרות המכסה המחומם כדי למנוע ייבוש מוחלט עם אובדן דגימה משמעותי.
  3. מצננים דגימות לטמפרטורת החדר עם צנטריפוגה ב -1500 x גרם למשך 3 דקות.

5. הפחתה ואלקילציה (לא חובה)

  1. הוסף 0.6 מיקרוליטר של 50 מ"מ DTT לריכוז סופי של 2 מ"מ.
    הערה: יש להכין תמיסת DTT בכל פעם. שקלו 77.5 מ"ג DTT ולאחר מכן התמוססו ל-1 מ"ל של 25 מ"מ NH4HCO3 כדי ליצור 500 מ"מ DTT. 10 μL של 500 mM DTT מתווספים לאחר מכן ל-90 μL של 25 mM NH4HCO3 כדי ליצור 50 mM DTT.
  2. צנטריפוגה ב-1500 x גרם למשך 5 דקות ולאחר מכן מערבבים בעדינות ב-850 סל"ד למשך 3 דקות.
  3. יש לדגור בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת עם ניעור עדין בטמפרטורה של 100 x גרם.
  4. מצננים דגימות לטמפרטורת החדר וצנטריפוגה ב -1500 x גרם למשך 3 דקות.
  5. הוסף 0.5 μL של 60 mM IAA לצינור RT-PCR עם הריכוז הסופי של ~2 mM.
    הערה: יש להכין את פתרון IAA בכל פעם. שוקלים 74.3 מ"ג של IAA ולאחר מכן ממיסים ל-1 מ"ל של 25 מ"מ NH4HCO3 כדי ליצור 400 מ"מ IAA. 15 μL של 400 mM IAA מתווספים ל-85 μL של 25 mM NH4HCO3 כדי ליצור 60 mM IAA.
  6. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עם ניעור עדין ב-100 x גרם.
    הערה: שלבי ההפחתה והאלקילציה הם אופציונליים כאשר אין פפטידים המכילים ציסטאין שנבחרו עבור חלבוני המטרה.

6. עיכול טריפסין

  1. הקטן את נפח הדגימה ל-~4 μL באמצעות רכז SpeedVac.
    הערה: TFE הוא ממס נדיף עם נקודת רתיחה ב-74 מעלות צלזיוס. אחוז גבוה של TFE מעכב את עיכול הטריפסין.
  2. הוסף 9 מיקרוליטר של 25 מ"מ NH4HCO3 ו-1-3 מיקרוליטר של 15 ננוגרם/מיקרוליטר טריפסין לעיכול עם ריכוז הטריפסין הסופי של 1-3 ננוגרם/מיקרוליטר.
    הערה: עבור 10 תאי שד אנושיים ממוינים ב-FACS (~1 ננוגרם), היחס בין אנזים טריפסין לחלבון הוא ≥15:1, פי 750 מזה בעיכול טריפסין סטנדרטי (היחס של 1:50).
  3. יש לערבב בעדינות בחום של 100 x גרם למשך 3 דקות ולדגור למשך הלילה (~16 שעות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף 0.5 מיקרוליטר של 5% חומצה פורמית כדי לעצור את התגובה האנזימטית.
  5. צנטריפוגה למשך שעה אחת ב 1500 x גרם.
  6. אחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח LC-SRM נוסף או במקפיא 4 מעלות צלזיוס לניתוח מיידי.

7. הכנה לניתוח LC-SRM ישיר

  1. הסר את מכסה צינור ה-PCR ששימש לאיסוף (שלב 2) ועיבוד (שלב 6) של תאי שד ממוינים ב-FACS.
  2. הכנס את צינור ה-PCR לבקבוקון LC.
  3. סגור את בקבוקון ה-LC לניתוח LC-SRM.
    הערה: עבור מספר קטן של תאים שעובדו בצלחת PCR של 96 בארות, יתווסף כיסוי המחצלת כדי לאטום את הצלחת לניתוח LC-SRM ישיר.

8. ניתוח LC-SRM

  1. נתח דגימות באמצעות UPLC בשילוב עם ספקטרומטר מסה משולש מרובע.
  2. חבר עמודות C18 נימיות (75 מיקרומטר × 20 ס"מ עבור שיפוע סטנדרטי ו-100 מיקרומטר × 10 ס"מ עבור שיפוע קצר) לפולט אלקטרוספריי סיליקה חרוט כימית של 20 מיקרומטר באמצעות איחוד מתכת אל חלד.
  3. השתמש בלולאת דגימה של 20 μL לטעינה ישירה של כל הדגימה (~15 μL בסך הכל) לתוך עמודת ה-LC כדי למקסם את רגישות הזיהוי.
  4. השתמש ב-0.1% חומצה פורמית במים ו-0.1% חומצה פורמית ב-90% אצטוניטריל כשלבים ניידים A ו-B להפרדת RPLC נימית.
  5. השתמש בשיפוע LC בינארי בקצבי זרימה של 300 nL/min עבור שיפוע סטנדרטי כאשר נמדדים מספר גדול של חלבוני מטרה (>10). שיפוע סטנדרטי: 5-20% B ב-26 דקות, 20-25% B ב-10 דקות, 25-40% B ב-8 דקות, 40-95% B בדקה אחת וב-95% B למשך 7 דקות למשך 52 דקות בסך הכל והעמודה האנליטית מאוזנת מחדש ב-99.5% A למשך 8 דקות.
  6. השתמש בשיפוע ה-LC הבינארי בקצבי זרימה של 400 ננוטר/דקה עבור שיפוע קצר כאשר נמדדים מספר קטן של חלבוני מטרה (≤10). שיפוע קצר להפרדה מהירה: 5-95% B ב-5 דקות והעמודה האנליטית מאוזנת מחדש ב-99.5% A למשך 5 דקות עם זמן ריצה כולל של 10 דקות LC.
  7. הפעל את ספקטרומטר המסה QQQ עם מתחי ריסוס יונים של 2,400 ± 100 וולט, מתח קיזוז נימי של 35 וולט, מתח קיזוז רחפן של -5 וולט וטמפרטורת כניסה נימית של 220 מעלות צלזיוס.
  8. השג את הפרמטרים האחרים של QQQ MS מכוונון וכיול אוטומטיים ללא אופטימיזציה נוספת.
  9. להעלות ריכוזים שונים של תקני פפטידים כבדים גולמיים ל-20-50 ננוגרם/מיקרוליטר של מעכלי ליזאט תאים לא אנושיים לפני ניתוח LC-SRM של דגימות כדי לקבוע זמן שימור LC של פפטיד (RT) לבניית שיטת SRM מתוזמנת ומעברי הפרעה פוטנציאליים לכימות מדויק.
  10. השתמש במצב SRM מתוזמן RT לכימות מרובה עם חלון סריקה של ≥6 דקות.
    הערה: חלון הסריקה יותאם בהתאם למספר המעברים בחלון זמן מסוים.
  11. הגדר את זמן המחזור הכולל לשנייה אחת, וזמן ההשתהות עבור כל מעבר מותאם אוטומטית בהתאם למספר המעברים שנסרקו בחלונות זמן שמירה שונים. יש צורך בזמן שהייה מינימלי של 10 אלפיות השנייה עבור כל מעבר SRM. ניתן לנטר את כל חלבוני המטרה בו זמנית בניתוח LC-SRM יחיד

9. ניתוח נתונים

  1. ייבא קובצי נתונים גולמיים לתוכנת Skyline33 הזמינה לציבור להדמיית נתונים של כל פפטיד יעד כדי לקבוע את יכולת הזיהוי שלהם.
  2. השתמש בשני קריטריונים כדי לקבוע זיהוי ואינטגרציה של שיא SRM: 1) אותו זמן שמירה של LC; 2) בערך אותם יחסי עוצמת שיא SRM יחסיים על פני מעברים מרובים בין פפטידים אנדוגניים (קלים) לבין התקנים הפנימיים המקבילים (כבדים) של פפטידים המסומנים באיזוטופים.
  3. בדוק את כל נתוני ה-SRM באופן ידני כדי להבטיח הקצאת שיא SRM נכונה וגבול שיא SRM לכימות אמין באמצעות שני הקריטריונים לעיל.
  4. השתמש במעבר הטוב ביותר עם אות SRM גבוה אך ללא הפרעות מטריצה לכימות חלבון, והשתמש במעברים האחרים כהפניה.
  5. השתמש בשכפולים מרובים כדי להשיג את סטיית התקן (SD) ומקדם השונות (CV).
  6. חשב את יחס האות לרעש (S/N) על ידי עוצמת השיא של קודקוד על פני רעש הרקע הממוצע באזור זמן שמירה של ±15 שניות עבור שיפוע סטנדרטי ו-±6 שניות עבור שיפוע קצר. גבול הזיהוי (LOD) וגבול הכימות (LOQ) מוגדרים כנקודות הריכוז הנמוכות ביותר שבהן יחס ה-S/N הוא לפחות 3 ו-7, בהתאמה.
  7. החל קריטריון נוסף לקביעה שמרנית של ערכי ה-LOQ מלבד S/N ≥7: תגובת פפטיד חלופית כנגד מספרי תאים שונים חייבת להיות בטווח הדינמי הליניארי.
  8. השתמש בתוכנת Excel כדי להתוות את כל עקומות הכיול. טען את נתוני ה-RAW מ-QQQ MS לתוכנת Skyline הזמינה לציבור כדי להציג גרפים של כרומטוגרמות יונים שחולצו (XICs) של מעברים מרובים של חלבוני מטרה מנוטרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמויות קטנות של ליזטים של תאי MCF7 (0.5-20 ננוגרם שווה ערך ל-5-200 תאים) שימשו לראשונה להערכת הביצועים של cLC-SRM על ידי כימות ממוקד של חלבוני מסלול EGFR/MAPK מכיוון שהם אחידים יותר עם פחות וריאציות בהשוואה למספר קטן של תאים הממוינים על ידי FACS. כפי שמוצג באיור 2A, XICs מראים בבירור זיהוי של מעברי SRM עבור ATADDELSFK שמקורם ב-GRB2 הקיים ב~220,000 עותקים לכל תא MCF734. cLC-SRM איפשר כימות ניתן לשחזור של ATADDELSFK אנדוגני עד ל-5 מקבילו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cLC-SRM היא שיטת פרוטאומיקה ממוקדת נוחה המאפשרת ניתוח מדויק של חלבונים מרובים של מספר קטן של תאים כולל תאים בודדים. שיטה זו מנצלת את הכנת דגימת סיר אחד בעזרת נשא חלבון, שבה כל השלבים כולל איסוף תאים, ליזה ועיכול תאים רב-שלביים, והעברת עיכול פפטידים לעמודת LC נימית לניתוח טרשת נפוצה מבוצעים בסיר אחד (למשל, צינור יחיד או באר יחידה) (איור 1). עיבוד 'הכל באחד' זה בנפח נמוך של סיר אחד ממקסם ביעילות את ההתאוששות של מספר קטן של תאים לניתוח פרוטאומיקה ממוקד על ידי ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIH Grant R21CA223715 (TS) ו-UG3CA256967 (TS ו-HL). העבודה הניסיונית המתוארת כאן בוצעה במעבדה למדעים מולקולריים סביבתיים, המעבדה הלאומית של צפון מערב האוקיינוס השקט, מתקן משתמש מדעי לאומי בחסות משרד האנרגיה של ארצות הברית תחת חוזה DE-AC05-76RL0 1830.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוקון LC זכוכית 2 מ"לMicrosolv 9502S-WCVכלי להחזקת צינור PCR להזרקת דגימה אוטומטית
BSASigma-AldrichP0834-10 ופעמים; חלבון נשא 1 מ"ללהפחתה משמעותית של הפסדי ספיחה פני השטח
DTTThermo ScientificA39255מגיב להפחתה
חומצה פורמיתThermo Scientific28905מגיב לעצירת תגובת אנזים
IAAThermo ScientificA39271מגיב לתקנים
פנימיים של פפטידפפטיד בניו אינגלנדכימות ממוקד של חלבוני מסלול EGFR/MAPK
צינור RT-PCR GeneMate BioexpressT-3035-10.2 מ"ל צינור PCR להכנת דגימה בסיר אחד 
תוכנת סקיילייןאוניברסיטת וושינגטוןזמינה לציבור לניתוח נתוני SRM
SonicatorHielscher טכנולוגיית אולטרסאונדUTR200סוניקציה על קרח לליזה תאים
מהירות רכז VacThermo Scientificהפחתה של אחוז TFE לעיכול טריפסין יעיל
TFESigma-Aldrich18370-10 ופעמים; 1 מ"ל60% TFE עבור ליזיס תאים
Thermocycler עם מכסה מחומםPeltier Thermal Cycler PTC-200חימום לדנטורציה של חלבון
Trypsin GoldPromegaV528Aאנזים לעיכול חלבונים 
עמודת מים BEH C18עמודתC18 להפרדת פפטידים
מים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  2. Miyamoto, D. T., et al. RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  3. Wang, Y., Navin, N. E. Advances and applications of single-cell sequencing technologies. Molecular Cell. 58 (4), 598-609 (2015).
  4. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  5. Gavasso, S., Gullaksen, S. E., Skavland, J., Gjertsen, B. T. Single-cell proteomics: potential implications for cancer diagnostics. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (5), 579-589 (2016).
  6. Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 83-88 (2012).
  7. Hughes, A. J., et al. Single-cell western blotting. Nature Methods. 11 (7), 749-755 (2014).
  8. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  9. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
  10. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (6), 427-439 (2010).
  11. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  12. Zhang, H., et al. Integrated Proteogenomic Characterization of Human High-Grade Serous Ovarian Cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
  13. Zhang, B., et al. Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 513 (7518), 382-387 (2014).
  14. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining Signaling Pathways with an Expanding Single-Cell Toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  15. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  16. Di Palma, S., Bodenmiller, B. Unraveling cell populations in tumors by single-cell mass cytometry. Current Opinion in Biotechnology. 31, 122-129 (2015).
  17. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 8 Unit 8 11-20 (2012).
  18. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Current Opinion in Biotechnology. 24 (4), 745-751 (2013).
  19. Lee, J. Y., et al. Detection of Head and Neck Cancer Based on Longitudinal Changes in Serum Protein Abundance. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 29 (8), 1665-1672 (2020).
  20. Shi, T., et al. Advancing the sensitivity of selected reaction monitoring-based targeted quantitative proteomics. Proteomics. 12 (8), 1074-1092 (2012).
  21. Shi, T., et al. Advances in targeted proteomics and applications to biomedical research. Proteomics. 16 (15-16), 2160-2182 (2016).
  22. Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Molecular Systems Biology. 4, 222(2008).
  23. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. 9 (6), 555-566 (2012).
  24. Zhu, Y., et al. Proteomic Analysis of Single Mammalian Cells Enabled by Microfluidic Nanodroplet Sample Preparation and Ultrasensitive NanoLC-MS. Angewandte Chemie International Edition. 57 (38), 12370-12374 (2018).
  25. Cong, Y., et al. Improved Single-Cell Proteome Coverage Using Narrow-Bore Packed NanoLC Columns and Ultrasensitive Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (3), 2665-2671 (2020).
  26. Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9 (1), 882(2018).
  27. Shao, X., et al. Integrated Proteome Analysis Device for Fast Single-Cell Protein Profiling. Analytical Chemistry. 90 (23), 14003-14010 (2018).
  28. Li, Z. Y., et al. Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis. Analytical Chemistry. 90 (8), 5430-5438 (2018).
  29. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161(2018).
  30. Zhang, P., et al. Carrier-Assisted Single-Tube Processing Approach for Targeted Proteomics Analysis of Low Numbers of Mammalian Cells. Analytical Chemistry. 91 (2), 1441-1451 (2019).
  31. Shi, T., et al. Facile carrier-assisted targeted mass spectrometric approach for proteomic analysis of low numbers of mammalian cells. Communications Biology. 1, 103(2018).
  32. Vitrinel, B., Iannitelli, D. E., Mazzoni, E. O., Christiaen, L., Vogel, C. Simple Method to Quantify Protein Abundances from 1000 Cells. ACS Omega. 5 (25), 15537-15546 (2020).
  33. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  34. Shi, T., et al. Conservation of protein abundance patterns reveals the regulatory architecture of the EGFR-MAPK pathway. Science Signaling. 9 (436), 6(2016).
  35. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  36. He, J., et al. Analytical platform evaluation for quantification of ERG in prostate cancer using protein and mRNA detection methods. Journal of Translational Medicine. 13, 54(2015).
  37. Shi, T., et al. Antibody-free, targeted mass-spectrometric approach for quantification of proteins at low picogram per milliliter levels in human plasma/serum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15395-15400 (2012).
  38. Shi, T., et al. Targeted quantification of low ng/mL level proteins in human serum without immunoaffinity depletion. Journal of Proteome Research. 12 (7), 3353-3361 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

One potLC SRM
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים