מאמר שיטה

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

DOI:

10.3791/61799

⸱

13 באוקטובר 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מכסה ניתוח מפורט של הרכב פפטידוגליקן באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מיצוי תכונות מתקדם ותוכנת ניתוח ביואינפורמטיקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פפטידוגליקן הוא מרכיב חשוב בדפנות תאי החיידקים ומטרה תאית נפוצה לאנטי-מיקרוביאליים. למרות שהיבטים של מבנה פפטידוגליקן נשמרים למדי בכל החיידקים, קיימת גם שונות ניכרת בין גראם-חיוביים/שליליים ובין מינים. בנוסף, ידועים מספר רב של וריאציות, שינויים או התאמות לפפטידוגליקן שיכולים להתרחש בתוך מין חיידקים בתגובה לשלב הגדילה ו / או גירויים סביבתיים. וריאציות אלה מייצרות מבנה דינמי מאוד הידוע כמשתתף בתפקודים תאיים רבים, כולל גדילה/חלוקה, עמידות לאנטיביוטיקה והימנעות מהגנת המאכסן. כדי להבין את השונות בתוך הפפטידוגליקן, יש לפרק את המבנה הכולל לחלקים המרכיבים אותו (המכונים מורופפטידים) ולהעריך את ההרכב התאי הכולל. Peptidoglycomics משתמשת בספקטרומטריית מסות מתקדמת בשילוב עם ניתוח נתונים ביואינפורמטי רב עוצמה כדי לבחון את הרכב הפפטידוגליקן בפירוט רב. הפרוטוקול הבא מתאר את טיהור הפפטידוגליקן מתרביות חיידקים, רכישת נתוני עוצמת מורופפטיד באמצעות כרומטוגרף נוזלי – ספקטרומטר מסות, וניתוח דיפרנציאלי של הרכב הפפטידוגליקן באמצעות ביואינפורמטיקה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פפטידוגליקן (PG) הוא מאפיין מגדיר של חיידקים המשמש לשמירה על המורפולוגיה של התא, תוך מתן תמיכה מבנית לחלבונים ולרכיבים תאיים אחרים 1,2. עמוד השדרה של PG מורכב מחומצה מורמית N-אצטיל מקושרת β-1,4 לסירוגין (MurNAc) ו-N-אצטיל גלוקוזאמין (GlcNAc)1,2. לכל MurNAc יש פפטיד קצר הקשור בשאריות ᴅ-lactyl שניתן להצליב לפפטידים סמוכים המקושרים לדו-סוכר (איור 1A,B). ההצלבה הזו מייצרת מבנה דמוי רשת שמקיף את כל התא, ולעתים קרובות מתייחסים אליו כאל עצם העצה (איור 1C). במהלך סינתזת PG, קודמנים נוצרים בציטופלסמה, ומועברים על פני הממברנה הציטופלזמית על ידי פליפסות. מבשרי משולבים לאחר מכן לתוך PG בוגר על ידי אנזימים transglycosylase ו transpeptidase, אשר מייצרים את הקשרים glycosidic ו peptide, בהתאמה3. עם זאת, לאחר הרכבתם, ישנם אנזימים רבים המיוצרים על ידי החיידקים שמשנים ו/או מפרקים את PG כדי לבצע מספר תהליכים תאיים, כולל גדילה וחלוקה. נוסף על כך, הודגם כי שינויים שונים של PG מעניקים התאמות ספציפיות למתח, לתנאי גדילה וללחץ סביבתי, אשר היו מעורבים באיתות תאי, עמידות אנטי-מיקרוביאלית והתחמקות ממערכת החיסון של המארח4. לדוגמה, שינוי נפוץ הוא הוספת קבוצת אצטיל C6 על MurNAc המקנה עמידות על ידי הגבלת הגישה לקישורי גליקן β-1,4 לאנזימי ליזוזים המיוצרים על ידי המאכסן אשר מפרקים PG 4,5,6. באנטרוקוקסי, החלפה של הטרמינל ᴅ-Ala של שרשרת הצד הפפטידית ב-ᴅ-Lac מעניקה עמידות גדולה יותר לאנטי-מיקרוביאלית, ונקומיצין 7,8.

הנוהל הכללי לבידוד וטיהור PG נותר כמעט ללא שינוי מאז תואר בשנות השישים9. קרומי חיידקים מומסים באמצעות טיפול בחום עם SDS, ולאחר מכן הסרה אנזימטית של חלבונים קשורים, גליקוליפידים ושאריות DNA. לאחר מכן ניתן לעכל את העצה השלמה המטוהרת לרכיבים בודדים על ידי הידרוליזה של קישור β-1,4 בין GlcNAc ו- MurNAc. העיכול הזה מייצר מפרקים של GlcNAc-MurNAc עם כל שינוי מבני ו/או קישורים צולבים שלמים, והם נקראים מורופפטידים (איור 1B).

ניתוח הרכב של PG בוצע בתחילה באמצעות הפרדה כרומטוגרפית נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) כדי לטהר כל מורופפטיד ואחריו זיהוי ידני של מורופפטידים10,11. זה הוחלף מאז על ידי כרומטוגרפיה נוזלית טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-MS), אשר מגביר את רגישות הגילוי ומקטין את עומס העבודה הידנית של טיהור כל muropeptide בודד. עם זאת, האופי הגוזל זמן ומורכב של זיהוי ידני של muropeptides נשאר גורם מגביל, הפחתת מספר המחקרים שנערכו. בשנים האחרונות עם הופעתן של טכנולוגיות "אומיות", מיצוי תכונות LC-MS אוטומטי הפך לכלי רב עוצמה, המאפשר זיהוי וזיהוי מהיר של תרכובות בודדות בדגימות מורכבות ממערכי נתונים גדולים מאוד. לאחר זיהוי התכונות, תוכנה ביואינפורמטית משווה סטטיסטית את השונות בין הדגימות באמצעות ניתוח דיפרנציאלי המבודד אפילו הבדלים מינימליים בין מערך הנתונים המורכב ומציג אותם באופן גרפי למשתמש. היישום של תוכנת חילוץ תכונות לניתוח הרכב PG רק החל להיחקר 12,13,14 ומשולב לניתוח ביואינפורמטי 12. בניגוד לאנליזה פרוטאומית הנהנה ממאגרי החלבונים הזמינים המנבאים פיצול פפטידים המאפשר זיהוי אוטומטי לחלוטין, לא קיימת כיום ספריית פיצול עבור פפטידוגליקומיקס. עם זאת, מיצוי תכונות יכול להיות משולב עם מסדי נתונים מבניים ידועים וחזויים כדי לחזות זיהוי muropeptide12. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשימוש במיצוי תכונות מבוסס LC-MS בשילוב עם ספריית מורופפטיד לזיהוי אוטומטי וניתוח דיפרנציאלי ביואינפורמטי של הרכב PG (איור 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדגם Peptidoglycan

  1. גידול תרביות חיידקים
    הערה: גדילת תרביות החיידקים תשתנה בהתאם לזן החיידקים ולתנאי הגידול הנבדקים. הפרמטרים הניסיוניים שייבדקו יגדירו את תנאי הגידול.
    1. גידול תרביות חיידקים בתנאי גידול הנדרשים לזן החיידק ולתכנון הניסוי. לגדל חיידקים כתרביות משולשות (העתקים ביולוגיים), כלומר שלוש מושבות נפרדות לכל זן או תנאי גידול.
      הערה: תנאי הגידול ושלב הצמיחה ידועים כבעלי השפעות משמעותיות על הרכב PG 1,2,10. יש להקפיד מאוד לשמור על עקביות בין תרבויות ושכפולים כדי להבטיח ששינויי ההרכב נובעים מהפרמטרים הניסיוניים ולא מטעויות ניסוי.
    2. קרר במהירות את התרבית ל -4 ° C, לאסוף על ידי צנטריפוגה (11,000 x גרם, 10 דקות, 4 ° C) ולהקפיא את גלולת התא ב -20 ° C. יש לשטוף את גלולת התא עם 4°C מקורר מראש, 20 mM נתרן פוספט pH 6.5 לפני ההקפאה. ייצור גלולת התא הקפוא צריך להיעשות במהירות ובעקביות ככל האפשר בין הדגימות כדי להגביל את פעילותם של אנזימים שעלולים לשנות ו/או לפרק את PG במהלך תהליך האיסוף. ניתן לעבד דגימות ישירות בתהליך המיצוי (סעיף 1.2) ללא הקפאה; עם זאת, ודא שכל הדגימות מעובדות באופן דומה.
      הערה: כדי להבטיח מוצר מספיק לשלבים מאוחרים יותר, נעשה שימוש בכדורית תא רטוב בגודל משמעותי. זה מייצר גלולת סקולי גדולה מספיק, אשר ניתן לדמיין ולשמור בקלות במהלך שלבי הכביסה החוזרים ונשנים (סעיף 1.2.5 ו 1.2.14) ללא אובדן משמעותי של המוצר. בהתאם לחיידק ולתנאי הגידול, יבול זה צפוי להשתנות. עבור חיידק גראם-שלילי Pseudomonas aeruginosa, PAO1, 4 ליטר של תרבית 0.5 OD600 ייצר גלולת תא 3-4 גרם והיה מספיק כדי לייצר ~ 10 מ"ג של סקולי מטוהר (סעיף 1.2.17)12. זהו עודף גדול של sacculi מאשר נדרש עבור LC-MS (סעיף 2); עם זאת, הוא יסייע בדיוק המדידה (סעיף 1.2.17) ובנורמליזציה (סעיף 1.3).
  2. מיצוי של peptidoglycan sacculi
    הערה: הפרוטוקול לחילוץ PG מותאם מ- ref.9,11,15. פרוטוקול זה יחלץ את PG מתאי חיידקים בודדים כסקולי שלם, ללא רכיבים תאיים אחרים. ניתן להשתמש בפרוטוקול עם חיידקים גראם-שליליים או גראם-חיוביים. עם זאת, עבור תאים גראם-חיוביים, ייתכן שיהיה צורך בהתאמות כדי לבודד את מבנה PG העבה יותר ולהסיר פולימרים הקשורים לדופן התא; כגון, חומצות teichoic.
    1. יש להשהות מחדש כדורי תאים קפואים ביחס של 1:10 בקירוב לנפח התרבית המקורי של 20 mM נתרן פוספט pH 6.5. בצע שלב זה ב 4 ° C (יכול להיות 1-8 מ"ג משקל גלולה תא רטוב לכל מ"ל של חיץ11,12).
      הערה: כדי לשמור על מצב אצטילציה של PG, pH של 6.5 או פחות נדרש15,16.
    2. יש להוסיף את תרחיף התאים לנתרן רותח 8% נתרן דודציל סולפט (SDS) 20 מילימול נתרן פוספט pH 6.5 לקבלת נפח סופי של 1:1 (כלומר, הריכוז הסופי הוא 4% SDS), תוך ערבוב עדין בבקבוק תחתון עגול המצויד במעבה מקורר מים. (איור 2, שלב 2)
    3. שמרו על רתיחה עדינה למשך 30 דקות עד 3 שעות עם ערבוב כדי להבטיח ניתוק מלא של הממברנה. ודא שהתערובת המתקבלת ברורה לחלוטין ללא גושי תאים או צמיגות שנותרו. הרתחה ארוכה יותר עדיפה כדי להבטיח ניתוק מוחלט.
    4. תנו לו להתקרר לטמפרטורת החדר. ניתן להשאיר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
      הערה: כאשר קיים SDS, שמור דגימות בטמפרטורת החדר כדי לשמור SDS בתמיסה.
    5. לאסוף sacculi כמו גלולה דרך ultracentrifugation ב 70,000 x גרם במשך 40 דקות (או את הזמן הדרוש לחלוטין משקעים sacculi) ב 25 ° C.
    6. יש לשטוף סקולי באופן חוזר ונשנה על ידי אולטרה-צנטריפוגה עוקבת (סעיף 1.2.5) ותרחיף ב~50 מ"ל בטמפרטורת החדר 20 מ"מ נתרן פוספט pH 6.5 עד שמאגר השטיפה מגיע לריכוז SDS ~0.001%. בדרך כלל, 5 עד 7 שטיפות מספיקות.
      הערה: כדי לבדוק את ריכוז ה-SDS הנותר במאגר הכביסה, השתמש בצבע הקולורימטרי, Stains-all17.
    7. להשהות סקולי ב 5-10 מ"ל של טמפרטורת החדר 20 mM נתרן פוספט pH 6.5.
    8. סוניק את הדגימה לזמן קצר (~ 40%, 50 W, 20 קילוהרץ, 20 שניות) בטמפרטורת החדר כדי לפזר גושים.
      הערה: סוניקציה מורחבת תגרום באופן מכני לגזירה של מבנה PG18.
    9. יש להשלים את הדגימה עם 50 מיקרוגרם/מ"ל כל עמילאז, DNase ו-RNase, מגנזיום סולפט במינון 10 מ"מ, ולעכל בטמפרטורה של 37°C במשך שעה אחת עם תסיסה או אגוז.
      הערה: עיכול עמילאז מסיר את שאריות הגליקוגן הכלוא בתוך הסקולי11.
    10. יש להוסיף 100 מק"ג/מ"ל פרונאז ולעכל ב-37°C למשך הלילה עם תסיסה או אגוז ו~0.02% נתרן אזיד.
      הערה: עיכול פרונאז מסיר את האנזימים שנוספו (מסעיף 1.2.9) ומסיר ליפופרוטאינים הקשורים באופן קוולנטי ל-PG.
      זהירות: נתרן אזיד רעיל מאוד ודורש שיטות שימוש/סילוק נאותות.
    11. אולטרה-צנטריפוגה ב 70,000 x גרם במשך 40 דקות (או הזמן הדרוש לחלוטין משקעים sacculi) ב 25 ° C כדי להסיר נתרן azide.
    12. להשעות מחדש את הגלולה ב 25 מ"ל של 2% SDS 20 mM נתרן פוספט pH 6.5.
    13. מרתיחים במשך שעה אחת בסיר אידוי או בבקבוק התחתון העגול עם מעבה מקורר מים (סעיף 1.2.2).
      הערה: שלב הרתיחה השני של SDS מסיר את כל החלבונים והמזהמים הנותרים מהסקולי.
    14. חזור על שטיפת הסקולי (סעיף 1.2.6) עם ~ 50 מ"ל מים מזוקקים כפולים בטמפרטורת החדר (ddH2O) עד שריכוז SDS הוא ~ 0.001%.
    15. להשהות את הגלולה בכמות מספקת של ddH2O כדי להשעות sacculi, כמו גם לשטוף את המיכל (למשל, 25 מ"ל) ולהקפיא לילה ב -80 ° C. נפח יכול להשתנות כמו הדגימה יהיה lyophilized בשלב הבא, אם כי, נפחים קטנים דורשים פחות זמן lyophilize.
    16. למחרת, lyophilize את המתלה ולאחסן בטמפרטורת החדר.
    17. למדוד את כמות sacculi lyophilized המתקבל על איזון אנליטי.
    18. לדלל sacculi ב ddH2O עד 10 מ"ג / מ"ל ו sonicate קצר כדי לפרק גושים לפני ניתוח נוסף.
  3. כימות פפטידוגליקן מטוהר
    1. כמת את כמות הסקולי המטוהר מסעיף 1.2.18 כדי להבטיח השוואת נתוני מפרט המסה במהלך ניתוח דיפרנציאלי (סעיף 3.2). עקוב אחר המתודולוגיה המפורטת המתוארת בהפניה15.
      הערה: סקרקולי מטוהרים (סעיף 1.2.18) מפורקים לרכיבי סוכר וחומצות אמינו בודדים על ידי הידרוליזה חומצית. רכיבים בודדים מופרדים ומכומתים על ידי כרומטוגרפיה של חילופי אניונים באמצעות זיהוי פועם-אמפרומטרי. בהינתן המבנה של PG (איור 1), מורופפטידים בודדים מורכבים משאריות MurNAc יחיד ושאריות GlcNAc יחידות. לכן, כימות הריכוז של כל שארית מייצג את כמות המורופפטידים ביחס של 1:1 בתוך המדגם. MurNAc מועדף בשל הפרדת השיא הנקייה מרכיבי PG אחרים במהלך כרומטוגרפיה16.

2. רכישת נתונים בספקטרומטריית מסות

  1. הכנת מורופפטידים לספקטרומטריית מסות
    1. תוסף 800 מיקרוגרם של סקולי מטוהר עם מוטנוליסין 100 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מ"מ אמוניום אצטט pH 5.5 ומגנזיום כלורי 50 מ"מ בתגובה של 100 מיקרוליטר.
    2. יש לעכל בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
    3. הוסף נפח 1: 1 0.5 M borate buffer pH 9.0 ולהשלים עם ~ 10 מ"ג / מ"ל נתרן בורוהידריד (NaBH4).
      הערה: מוטרוטציה של סוכרים מחזוריים בין α לצורות אנומריות β תגרום להיווצרויות שיא מרובות במהלך הפרדת הכרומטוגרפיה הנוזלית של המורופפטידים. הטיפול עם NaBH4 מבטל את ההמרה ההדדית בין שתי הצורות על ידי הפחתת MurNAc למורמיטול11. הטיפול אינו מפחית 1,6-אנהידרו MurNAc או 1,4-שאריות סוכר מקושרות.
      זהירות: התגובה של NaBH4 מייצרת כמויות קטנות של גז מימן. תגובת NaBH4 תיצור בועות ושפופרות מיקרופוגה צריכות להישאר פתוחות כדי לאפשר לגז לברוח.
    4. יש לדגור על הדגימה בטמפרטורת החדר למשך ~20-30 דקות.
    5. צנטריפוגה לזמן קצר כדי ליישב את הדגימה בצינור המיקרופוגה ולהסיר בועות.
    6. יש לכוונן את רמת החומציות ל-<4.0 באמצעות חומצה זרחתית ביחס של 1:5, בתוספת במרווחים של 5 μL. בדיקת pH באמצעות רצועות בדיקת pH לקמוס.
    7. צנטריפוגה ב~ 17,000 x גרם למשך דקה אחת כדי לשקוע בכל חומר בלתי מסיס שנותר.
    8. סנן באמצעות מסנני מיקרוצנטריפוגות 0.2 מיקרומטר.
    9. הדגימות עוברות צנטריפוגה למשך 10 דקות במהירות של 30,000 x גרם לפני הזרקתן ל-LC-MS כדי להבטיח שהחלקיקים לא יוזרקו לטרשת נפוצה.
  2. התקנה של LC-MS
    1. חבר עמודת חלקיקים נקבוביים שטחי C18 (100 מ"מ x 2.1 מ"מ, גודל נקבוביות <3 מיקרומטר) לספקטרומטר מסות Quadrupole-Time of Flight (QTOF) עם דיוק זיהוי מינימלי של ארבע נקודות עשרוניות m/z .
    2. ביצוע הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית של מורופפטידים
      הערה: כל טריפליקט ביולוגי (סעיף 1.1.1) צריך להיות מופעל דרך LC-MS (סעיף 2.2.2 עד 2.2.3) שלוש פעמים (משולש טכני). לכן, לכל תנאי נבדק יהיו בסך הכל תשעה קבצי נתונים LC-MS. איסוף הנתונים בוצע באמצעות תוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים). עם זאת, יש לבחור תוכנת רכישה על בסיס מכונות MS. להלן מייצג מדריך להגדרת MS עם פרמטרים ספציפיים להפעלת פרוטוקול זה. לקבלת תיאור מפורט, עיין במדריך היצרן.
      1. להפרדה כרומטוגרפית, הכינו את הממסים הבאים 0.1% חומצה פורמית (A) ואצטוניטריל עם 0.1% חומצה פורמית (B).
      2. הגדר שיטה להפרדה כרומטוגרפית באמצעות הפרמטרים הבאים.
      3. הגדר את קצב הזרימה ל- 0.4 מ"ל/דקה.
      4. התנה את העמודה למשך 10 דקות ב- 2% B (~ 24 אמצעי אחסון של עמודות).
      5. באמצעות דוגם אוטומטי, הזריקו 10 μL של דגימה מסעיף 2.1.9.
        הערה: הפעל דגימה ראשונית אחת באמצעות פרוטוקול LC-MS לפני תחילת איסוף הנתונים. ריצה זו אינה משמשת לנתונים, אלא להגדלת יכולת השחזור של זמן השמירה עבור כל הריצות הבאות. יכולת השחזור של זמן השמירה נדרשת במהלך עיבוד ספקטרלי (סעיף 3.1) לצורך זיהוי וקיבוץ מדויקים של פסגות יחס מסה למטען (m/z).
      6. הפרידו את המורופפטידים באמצעות 2% B למשך 5 דקות (~12 נפחי עמודות), לאחר מכן הגדילו אותו ל-15% B במשך 13 דקות (~30 כרכי עמודות), הגדילו אותו ל-50% B במשך 10 דקות (~24 כרכי עמודות), ולבסוף הגדילו אותו ל-98% B במשך 2 דקות (~5 כרכי עמודות).
        הערה: יש להשליך (לשלוח לבזבוז) את 2 הדקות הראשונות ואת 5 הדקות האחרונות של מעבר הצבע.
      7. סיים עם שטיפת עמודות ב- 98% B למשך 6 דקות (~14 אמצעי אחסון של עמודות) ו- 20 דקות (~47 אמצעי אחסון של עמודות).
    3. ביצוע זיהוי ספקטרומטריית מסה של מורופפטידים
      1. כייל את ציר המסה במצב חיובי באמצעות תערובת כוונון באצטוניטריל המכיל תקני מסת ייחוס LC-MS בהתאם להוראות יצרן הטרשת הנפוצה.
        הערה: הטרשת הנפוצה מכוונת לפני תחילת הריצות הכרומטוגרפיות (סעיף 2.2.2.1).
      2. הגדר שיטה לרכישת נתוני MS באמצעות הפרמטרים הבאים.
        הערה: נתוני MS ו- MS/MS נאספים (סעיפים 2.2.3.2 עד 2.2.3.6) במקביל להפרדה הכרומטוגרפית של המורופפטידים (סעיפים 2.2.2.4 ו- 2.2.2.5). הן פרמטרים כרומטוגרפיים והן פרמטרים של MS (סעיפים 2.2.2.2 ו- 2.2.3.2) הם שיטה אחת המתווספת במהלך הגדרת רשימת עבודה להפעלת דגימות מרובות ברצף.
      3. הגדר את מתח הנימים של התרסיס החשמלי על 4.0 kV ואת טמפרטורת גז הייבוש על 350° C עם קצב זרימה של 13 L/min.
        הערה: חנקן (טוהר >99%) צריך לשמש כגז ערפיליזציה, ייבוש והתנגשות במהלך כל איסוף נתוני ספקטרומטריית המסות.
      4. הגדר את לחץ נבולייזר ל 40 psi והגדר את המקטע ל 150 V.
      5. הגדר את מתחי RF של הזרבובית, הרחפן והמתומן ל- 1000 V, 65 V ו- 750 V, בהתאמה.
      6. הגדר את טווח הסריקה ל- 300-2,000 m/z במצב יונים חיוביים של 4 GHz (טווח דינמי מורחב).
      7. הגדר איסוף נתונים באמצעות רכישת MS/MS תלוית נתונים עם קצב סריקה של MS ו- MS/MS של ספקטרה/שנייה אחת. בחר חמש מסות מקדימות בכל מחזור, בסדר של טעון יחיד, כפול ומשולש.
      8. הגדר את אנרגיות ההתנגשות של פיצול MS/MS ל- 15, 20 ו- 30 eV.

3. ניתוח דיפרנציאלי של שפע muropeptide

  1. עיבוד ספקטרלי של כרומטוגרמה LC-MS
    הערה: חילוץ תכונות רקורסיבי בוצע באמצעות תוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים). ניתן להשתמש בתוכנת חילוץ תכונות אחרת. עם זאת, תוכנות אחרות עשויות לדרוש עיבוד נתונים ידני נוסף כדי להשיג את החילוץ הרקורסיבי החזק ביותר. תוכנות שונות משתמשות בתכונת המינוח, הישות והתרכובת כמעט לסירוגין. עבור ניתוח PG, כולם מתייחסים לזיהוי של כרומטוגרמה יון LC-MS המייצגת של מורופפטיד בודד (לדוגמה, איור 3). במהלך עיבוד ספקטרלי (סעיף 3.1), תכונה מייצגת את פסגות m/z המרובות המקיפות את מיני היונים האפשריים המרובים של מורופפטיד יחיד המקובצים יחד תחת תווית מורכבת אחת.
    1. תחת קובץ, התחל פרוייקט חדש.
    2. הוסף את קבצי הנתונים LC-MS QTOF והקצה קבצי נתונים בודדים לתנאי / קבוצה ניסיוניים, למשל, שני תנאי גידול שונים.
    3. הפעל את אשף עיבוד הנתונים מיצוי תכונות רקורסיבי אצווה (מולקולות קטנות/פפטידים) והגדר את מסנני עיבוד הנתונים כך שיתאימו לפרמטרים של התנאים והמכשור של LC-MS כדי לזהות, לקבץ ולאמת במדויק פסגות m/z המייצגות מורופפטידים בודדים. מתוך הכרומטוגרמה, בדוק את סחף זמן השמירה ואת השונות של m/z של פסגות דומות ידועות כדי להגדיר פרמטרים ראשוניים של סינון.
      הערה: חילוץ תכונות רקורסיבי משתמש באלגוריתם חילוץ תכונות מולקולרי ראשוני לא ממוקד כדי לזהות וליישר תכונות כרומטוגרמה (פסגות m/z ) בכל קבצי הנתונים. לאחר יצירתן, תכונות אלה משמשות להערכה מחדש של קבצי הנתונים המקוריים (רקורסיביים) באמצעות אלגוריתם חילוץ תכונות מולקולרי ממוקד כדי לשפר את המהימנות והדיוק של התכונות שזוהו. עדיף להגדיר את החילוץ הראשוני הבלתי ממוקד עם חלון זיהוי צר ולהשתמש בפרמטרי זיהוי רחבים יותר עבור החילוץ הרקורסיבי כדי לזהות שיאים בכל קבצי הנתונים שעשויים להיות חסרים בחילוץ הראשוני. הפעלת חילוץ התכונות הרקורסיבי עשויה להימשך שעות בהתאם למספר הדגימות, מורכבות הנתונים וחומרת המחשב הקיימת
    4. סקור את תוצאות חילוץ התכונות. אם מספר משמעותי של תכונות לא הצליח להתיישר בקבוצה, התאם את פרמטרי הסינון הרקורסיבי כדי להרחיב/להגביל את חלון הזיהוי כנדרש. כדי להשיג זאת, בדוק את הכרומטוגרמה ואת הפרופיל האיזוטופי של כל תכונה שחולצה כדי לוודא שזיהוי התכונות בוצע באופן דומה בכל קבצי הנתונים. כמו כן, עבור כל תכונה מזוהה בתוך קובץ נתונים, בדוק את הניקוד, אזהרות כלשהן והאם התכונה עברה את פרמטרי הסינון שנבחרו.
      הערה: יש להקפיד לשמור על חלונות זיהוי צרים מספיק כדי שתכונות נפרדות לא יקובצו יחד בטעות. זה מצוין לעתים קרובות על ידי פרופילים איזוטופיים שונים בין קבצי נתונים, או שינויים משמעותיים m/z / זמן שמירה. לעומת זאת, אם יש מספר תכונות עם m/z וזמני שמירה דומים, ייתכן שהפרמטרים של המסנן היו מחמירים מדי וכתוצאה מכך שיא MS אחד פוצל לשתי תכונות. לכן, הפעל שוב חילוץ תכונות (סעיף 3.1.3) עם פרמטרים מותאמים של מסנן זמן שמירה כדי לאפשר קיבוץ טוב יותר של תכונות אלה. הדמיה של פסגות השפע הנמוכות ביותר תציין אם המסננים שבהם נעשה שימוש (סעיף 3.1.3) זיהו במדויק פסגות מעל רעשי רקע. אם פסגות השפע הנמוכות ביותר נראות דומות לרקע, הפעל מחדש את חילוץ התכונות עם פרמטרים חדשים של מסנן רקע.
    5. יצא נתונים כקובץ חילופי מורכב ( .cef) (תבנית התואמת לתוכנה הסטטיסטית), או כקובץ המופרד בין עמודות (.csv) המכיל את המסה, זמן השמירה והשפע של כל תכונה עבור כל דגימה.
  2. ניתוח דיפרנציאלי של תכונות ספקטרליות
    הערה: ניתוח דיפרנציאלי בוצע באמצעות תוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים). ניתן להשתמש בתוכנות ביואינפורמטיות אחרות.
    1. פתח את התוכנית וכאשר תתבקש להתחיל פרוייקט חדש.
    2. בצע את ההוראות לייבוא נתונים וניתוח נתונים. במהלך ייבוא הנתונים, העלה את הקבצים שחולצו מהתכונה (סעיף 3.1). במהלך ניתוח הנתונים, בחר מובהקות ושינוי קיפול לניתוח דיפרנציאלי ובחר לסמן נתונים בסיסיים לעוצמה החציונית בכל קבצי הנתונים. אל תגדיר מסנני נתונים כלשהם (אם הדבר נעשה בשלב עיבוד הספקטרום הקודם (סעיף 3.1)) מכיוון שהחלת מסננים שוב תשלול את חילוץ התכונות הרקורסיבי החזק. עם זאת, בדומה לחילוץ תכונות, ניתוח דיפרנציאלי חייב להיות מיושר בהתבסס על מסה (m/z) וזמן שמירה עקב סחף באיסוף הנתונים LC-MS. השתמש בפרמטרים שנקבעו בחילוץ תכונות (סעיף 3.1).
      הערה: נרמל בין קבצי נתונים באמצעות כימות muropeptide (סעיף 1.3) כדי להבטיח שהשינויים נובעים מפרמטרים ניסיוניים ולא משינויים בטיהור sacculi (סעיף 1.2). השתמש באפשרות הסקלר החיצוני כדי להתאים כל קובץ נתונים להבדלים בריכוז MurNAc בדגימה.
    3. לאחר השלמת הניתוח, בחנו את הניתוחים הגרפיים והסטטיסטיים המתקבלים כדי לזהות מורופפטידים המדגימים שינוי משמעותי בשפע בין תנאי הניסוי שנבדקו.
    4. תחת נווט הפרויקט, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הניתוחים השונים ובחר אפשרות ייצוא לשמירת פרטי תכונה כקובץ נתונים המופרד בעמודות (.csv) המכיל את m/z, זמן שמירה, ערכי עוצמה גולמיים ומנורמלים, ערך p, FDR ושינויי קיפול עבור כל תכונה. יש לשמור ניתוחים מרובים כדי לקבל את כל הנתונים הרלוונטיים.
    5. יצא קובץ .csv שני המכיל רק את המורופפטידים שעלו על הניתוחים הסטטיסטיים, כולל ערך p <0.05 ושינוי קיפול >2.
  3. ביאור זהות מורופפטיד לתכונות ספקטרליות
    הערה: לכל תכונה מזוהה יש להקצות מבנה מורופפטיד חזוי בהתבסס על m/z וביאור זה אושר על ידי בחינת פיצול MS/MS. לאחר אישור הביאורים, ייתכן שיהיה צורך לבצע ולחדד את הניתוח הדיפרנציאלי (סעיף 3.2).
    1. בתוך תוכנת ניתוח דיפרנציאלי, תחת פירוש תוצאות, בחר דפדפן מזהה. הוסף ספרייה של מבני muropeptide צפוי ובחר פרמטרים דומים כפי שהיה בשימוש בעבר (סעיף 3.1.3). פעולה זו תפיק ביאור מורופפטיד חזוי עבור כל תכונה מזוהה. ניתן לייצר ספרייה של מבני מורופפטיד באמצעות m/z עבור מבני מורופפטיד חזויים ותוכנת מסד נתונים של טרשת נפוצה (ראה טבלת חומרים). עם זאת, ספרייה של m/z של >6,000 muropeptides אפשריים ניתן למצוא בהפניה12.
    2. בחר את ביאור המורופפטיד החזוי בהתבסס על ציון ההתאמה והרלוונטיות הביולוגית של המורופפטיד החזוי, כלומר, בחר את המורופפטיד הסביר ביותר להימצא בדגימה הביולוגית.
    3. אשרו ידנית את ביאור המורופפטיד החזוי על-ידי השוואת פסגות m/z של כרומטוגרמה MS/MS ל-m/z החזוי של כל הפיצולים האפשריים של מבנה מורופפטיד ידוע (לדוגמה, איור 4).
      1. הצג את נתוני MS ו- MS/MS באמצעות תוכנית צפייה בכרומטוגרמה (ראה טבלת חומרים, איור 4).
      2. ציירו את מבנה המורופפטיד החזוי באמצעות עורך מולקולרי (תוכנית שרטוט מבנה כימי) (ראו טבלת חומרים, איור 4, כניסה אפורה). השתמש בכלי פיצול המסה כדי להציג את m/z של מקטעי MS כאשר כל קשר נשבר בנפרד או בשילוב.
        הערה: בהתאם לאנרגיית הפיצול המשמשת עבור MS/MS, פיצול יכול להתרחש בכל קשר במבנה המורופפטידים. עם זאת, קשרים מסוימים מתפצלים בקלות רבה יותר / לעתים קרובות יותר ברמות אנרגיה נמוכות יותר. לדוגמה, פיצול בשרשרת הצד הפפטידית מתרחש לרוב בקשר אמיד בין חומצות אמינו. בעת הערכת הפיצול, חשוב לציין כי שאריות GlcNAc מתפצלות בקלות רבה מהמורופפטיד. לכן, פיצול של מבנה muropeptide ידוע צריך להיות מוערך עם ובלי GlcNAc. בשל פיצול המקור של GlcNAc, מספר תכונות שחולצו בעיבוד ספקטרלי (סעיף 3.1) עשויות לייצג מבנה מורופפטיד יחיד. אם נמצאו, יש למזג תכונות אלה ולהעריך מחדש את הניתוח הדיפרנציאלי.
      3. השווה את כל הפיצולים האפשריים של מבנה המורופפטיד שנקבע (סעיף 3.3.3.2) לכרומטוגרמה MS/MS (סעיף 3.3.3.1). כדי לאשר את ביאור המורופפטידים, יש למצוא את פסגות m /z של מקטעים מרובים בכרומטוגרמה של MS/MS עם חלון יישור m/z מינימלי מאוד (איור 4).
      4. על מנת להבהיר את זהות המורופפטיד במקרה של פיצול MS/MS מעורפל, חזור על סעיפים 2.2.2 עד 2.2.3 עם דגימות (סעיף 2.1.9) לרכישת נתונים נוספים של MS/MS תוך שילוב רשימה מקדימה מועדפת של m/z וזמן שמירה עם אנרגיות התנגשות נוספות של פיצול MS/MS.
    4. עבור ישויות קו-אלוטינג שסומנו כאותו מורופפטיד, הפעל שוב את הניתוח הדיפרנציאלי (סעיף 3.2.2) ומיזג את התכונות שחולצו.
  4. הערכת שינויים גלובליים בשינויים muropeptide
    1. ערוך את קובץ .csv (סעיף 3.2.4) של המורופפטידים בעלי המובהקות הסטטיסטית של שינוי קיפול גבוה כדי לכלול עמודה אחת עבור כל שינוי muropeptide. אכלס עמודה זו עם ציון עבור כל muropeptide מבואר (סעיף 3.3) (למשל, acetylated לעומת de-N-acetylated GlcNAc או MurNAc).
    2. העלה את קובץ .csv שהשתנה לתוך Perseus22,23. יבא את ערכי העוצמה המנורמלים לתיבה ייבוא ראשי וייבא את ייעוד השינוי לתיבה ייבוא קטגורי.
    3. תחת הוסף הערות לשורות, לחץ על הוסף הערות קטגוריות , והוסף קובצי נתונים לכל פרמטר ניסיוני.
    4. תחת בדיקה, לחץ על שתי בדיקות לדוגמה כדי לבצע מבחן t של תלמיד (ערך p < 0.05, FDR < 0.05, s0 = 1).
    5. לחץ על 1D כדי לבצע ביאור 1D22,23. ביאור 1D FDR < 0.05 מצביע על שינוי משמעותי בשפע עבור שינוי muropeptide בין הפרמטרים הניסיוניים שנבדקו. הגדרת ערך הסף (s0) = 1 תציג את ציוני FDR הביאור 1D עבור כל המורופפטידים.
    6. בתוך תוכנת גרפים (ראו טבלת חומרים), הפיקו מפת חום של שינוי קיפול השפע עבור כל שינוי מורופפטיד והראו את ציון הביאור ה-1D כדי להדגים מובהקות (איור 5B). ניתן לייצר את שינוי הקיפול של כל שינוי muropeptide ב- Microsoft Excel באמצעות העוצמות הגולמיות של כל muropeptides בודדים המכילים את השינוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רגישות זיהוי מוגברת של מכונות טרשת נפוצה בשילוב עם תוכנת זיהוי שיא רבת עוצמה שיפרו את היכולת לבודד, לנטר ולנתח הרכבי חומרים של דגימות מורכבות בפירוט דק מאוד. באמצעות התקדמות טכנולוגית זו, מחקרים אחרונים על הרכב פפטידוגליקן החלו להשתמש בטכניקות מיצוי תכונות LC-MS אוטומטיות 12,13,14,24 על פני מתודולוגיה ישנה יותר מבוססת HPLC 11,25,26,27,28,29,30,31

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיהור פפטידוגליקן מתרביות חיידקים, תהליך לזיהוי LC-MS וניתוח הרכב באמצעות טכניקות ביואינפורמטיקה. כאן, אנו מתמקדים בחיידקים גראם-שליליים ויידרש שינוי קל כדי לאפשר ניתוח של חיידקים גראם-חיוביים.

הכנת muropeptides נשאר כמעט זהה מאז שהוא הופק לראשונה בשנת 1960 9,11,15. לאחר טיהור, sacculi (סעיף 1.2.18) מתעכלים לתוך muropeptides בודדים באמצעות האנזים muramidase mutanolysin מ Str...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לד"ר ג'ניפר גדס-מקאליסטר ולד"ר אנתוני קלארק על תרומתם בשכלול פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי תפעול מ- CIHR שהוענקו ל- C.M.K (PJT 156111) ו- NSERC אלכסנדר גרהם בל CGS D שהוענק ל- E.M.A. הנתונים נוצרו ב- BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד
C18 עמודת פאזה הפוכה - עמודת פפטיד AdvanceBio (100 מ"מ x 2.1 מ"מ 2.7 ומיקרו; m)AgilentLC-MS
בקר מעטפת חימום, OptichemFisher50-401-788עבור 4% מעטפת חימום SDS
, 1000 מ"לCG1000008 פישרעבור 4% SDS רתיחה
אינקובטור, 37° Cלטיהור שקיות והכנת דגימת MS
מעבה לייביג, 300 מ"מ 24/40,פישרCG121805ל-4% SDS רותח
ליופילייזרLabconcoלליופיליזציה של
סקולי מערבל מג'נטיקפישר90-691-18עבור ספקטרומטר מסה של 4% SDS רתיחה
Q-Tof דגם UHD 6530רכישתנתונים LC-MS
מסנני מיקרוצנטריפוגה, Nanosep MF 0.2 ומיקרו; מפישר50-197-9573ניקוי מדגם לפני הזרקת MS
מעמד רטרטפישר12-000-102עבור 4% SDS רתיחה
מהדק רטרטפישרS02629עבור 4% SDS מרתיח
בקבוק תחתון עגול - 1 ליטר פיירקספישר07-250-084עבור 4% SDS רתיחה
סוניקטור דגם 120פישרFB120לטיהור שקיות
סוניקטור - טיפ מיקרופישרFB4422לטיהור שקיות
אולטרה-צנטריפוגהשלבי שטיפתשקיות בקמן
בקבוקי אולטרה-צנטריפוגה, Ti45FisherNC9691797מדרגות שטיפת שקיות
אספקת מיםעירלמעבה
<חזק>תוכנה
ChemdrawCambridgesoftלחיזוי פיצול muropeptide
Excelמיקרוסופטצפייה ברשימות של muropeptides מוערים, שפע, דפוסים איזוטופיים וכו'.
MassHunter AcquisitionAglientהפעלת מכשיר QTOF
MassHunter Mass Profiler מקצועיניתוח דיפרנציאלי ביואינפורמטי
MassHunter Compound Database ומנהל ספרייהAglientmuropeptide m/z MS מסד נתונים
MassHunter ProfinderAglientרקורסיבית חילוץ
תכונות רקורסיביותMassHunter ניתוח איכותניAglientצפייה בכרומטוגרמות MS ו-MS/MS
פריזמהGraphpadתוכנת גרפים
פרסאוסמקס פלאנק המכון לביוכימיה1D הערות
<חזק>חומר
אצטוניטרילפישרA998-4
אמוניום אצטטפישרA637
עמילאזסיגמא-אולדריץ'A6380
חומצה בוריתפישרBP168-1
DNaseפישרEN0521
חומצה פורמיתסיגמא-אולדריץ'27001-500ML-R
LC-MS תערובת כוונון - HP0321AgilentG1969-85000
מגנזיום כלורידSigma-AldrichM8266
מגנזיום גופרתיSigma-AldrichM7506
Mutanolysin מ- Streptomyces globisporus ATCC 21553Sigma-AldrichM9901
גז חנקן (>99% טוהר)PraxairNI 5.0UH-T
חומצה זרחתיתפישרA242
פרונאז E מ Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147
RNaseFisherEN0531
נתרן אזידFisherS0489
נתרן בורוהידרידSigma-Aldrich452890
נתרן דודציל סולפט (SDS)FisherBP166
נתרן הידרוקסידFisherS318
נתרן פוספט (דו-בסיסי)פישרS373
נתרן פוספט (מונובסיסי)פישרS369
כתמים-הכלסיגמא-אולדריץ'E9379
רכישת נתונים חצי כדורי מקורר מים עורך מולקולרי של אישי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
  4. Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064(2018).
  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
  6. Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94(2019).
  7. Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
  8. Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
  9. Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
  10. Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
  11. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
  12. Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
  13. van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290(2018).
  14. Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
  15. Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
  16. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  17. Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
  18. Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
  19. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  20. Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23(2015).
  21. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
  22. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  23. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).
  24. Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278(2017).
  25. Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
  26. Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
  27. Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
  28. Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
  29. Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868(2019).
  30. Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
  31. De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
  32. Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
  33. Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
  34. Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Sacculi

מאמרים קשורים