Method Article

שימוש בניתוח תמונה מבוסס מחשב כדי לשפר את כימות גרורות הריאות במודל סרטן השד 4T1

DOI:

10.3791/61805

⸱

October 2nd, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, 2Graduate Program in Translational Biology, Medicine and Health, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biomedical Engineering and Mechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Basic Science Education, Virginia Tech Carilion School of Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה עקבית ומזרזת יותר לכמת גרורות ריאות במודל סרטן השד 4T1 באמצעות Fiji-ImageJ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן השד הוא ממאירות הרסנית, המהווה 40,000 מקרי מוות של נשים ו -30% מאבחוני סרטן הנשים החדשים בארצות הברית בשנת 2019 בלבד. הגורם המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן השד הוא הנטל גרורתי. לכן, מודלים פרה-קליניים לסרטן השד צריכים לנתח נטל גרורתי כדי להיות רלוונטיים מבחינה קלינית. מודל סרטן השד 4T1 מספק באופן ספונטני גרורות, מודל העכבר לכימות עבור שלב IV סרטן השד האנושי. עם זאת, רוב פרוטוקולי 4T1 לכמת את הנטל גרורתי על ידי ספירה ידנית מושבות מוכתמות על צלחות תרבות הרקמות. אמנם זה מספיק עבור רקמות עם נטל גרורתי נמוך יותר, טעות אנוש בספירה ידנית גורמת לתוצאות לא עקביות ומשתנות כאשר צלחות הן confluent וקשה לספור. שיטה זו מציעה פתרון מבוסס מחשב לשגיאת ספירה אנושית. כאן, אנו מעריכים את הפרוטוקול באמצעות הריאה, רקמה גרורתית מאוד במודל 4T1. תמונות של לוחות מוכתמים בכחול מתילן נרכשים ומועלים לניתוח בפיג'י-ImageJ. פיג'י-ImageJ קובע את אחוז האזור הנבחר בתמונה הכחול, המייצג את אחוז הלוח בעומס גרורתי. גישה מבוססת מחשב זו מציעה תוצאות עקביות ומזרזות יותר מאשר ספירה ידנית או הערכה היסטופתולוגית לרקמות גרורתיות ביותר. העקביות של תוצאות Fiji-ImageJ תלויה באיכות התמונה. ניתן לבצע שינויים קלים בתוצאות בין תמונות, ולכן מומלץ לנקוט במספר תמונות ולתוצאות ממוצעות. למרות המגבלות המינימליות שלה, שיטה זו היא שיפור לכמת נטל גרורתי בריאה על ידי מתן תוצאות עקביות ומהירות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחת מכל שמונה נשים תאובחנו עם סרטן השד בחייה, ובכל זאת למרות אפשרויות טיפול מרובות סרטן השד הוא הגורם המוביל השני של מקרי מוות הקשורים לסרטן אצל נשיםאמריקאיות 1. הנשים האלה לא מתות מהגידול העיקרי בשד שלהן. במקום זאת, הנטל גרורתי אחראי על התמותה של מחלה זו כפי שהוא מתפשט בדרך כלל לריאות, עצם, מוח, כבד, ובלוטותהלימפה 2. בגלל זה, מודלים סרטן השד צריך להעריך גרורות לתרום לריסון התמותה של מחלה זו. מודל סרטן השד 4T1 מורין הוא פרוטוקול מעולה כדי להשיג זאת. השיטה המתוארת כאן מציעה שיפור לדגם 4T1 באמצעות Fiji-ImageJ לכימות גרורות ריאות, תוך הפקת תוצאות עקביות ומזרזות.

מודל 4T1 מבוסס היטב, כאשר רוב המעב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של וירג'יניה טק ובהתאם למדריך הלאומי של מכוני הבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. ביצוע פרוטוקול זה דורש אישור מהמוסדות המתאימים ודבקות בכל ההנחיות המתאימות.

1. תרבות התאים

  1. הפוך מדיה תרבותית מלאה (RPMI + 10% סרום חזיר עוברי +1% עט סטרפטוקומפ). להחיות תאים 4T1 על פי פרוטוקול ATCC10 ו דגירה ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 בבקבוק T-25 עד confluent. שנה את המדיה יום לאחר ההחייאה כדי להסיר תאים מתים, ושוב אם המדיה מבוזבזת לפני שהתאים נוחים מספיק למעבר.
  2. לאחר בקבוק T-25 הוא confluent, לעבור תאים לבקבוק T-75 על יד....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו מכילה התאמות פשוטות מפרוטוקול פולסקי ואוסטראן-רוזנברג 4T13 ו ניתן לדמיין אותן איור 1. כאשר 3 חוקרים נפרדים ספרו ידנית מושבות גרורתיות עבור 12 צלחות ריאה (דילול של 1:10), התוצאות היו מאוד לא עקביות בין מונים שונים (איור 2A). כל החוקרים הופנו "לספור את המושבות גרורתיות המופיעות כנקודות כחולות", אך חוסר העקביות מדגים את הבעיה עם ספירה ידנית של לוחות גרורתיים מאוד. לחוקרים היו רמות שונות של ניסיון עם מודל 4T1. פתולוג וטרינרי מוסמך נית.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שהוכח, ספירה ידנית של המושבות גרורתיות על כל לוח ריאות יכולה להיות שיטה לא מדויקת ולא מדויקת לכימות גרורות ריאות, המדגימה את הצורך באמצעי כימות טוב יותר (איור 2). הניתוח ההיסטופתולוגי היה שונה במקצת הן מספירה ידנית והן מניתוח פיג'י-ImageJ (איור 2B ו- 4D), ככל הנראה מכיוון ששקופיות H&E אינן מדגם מייצג של האיבר כולו. הפרוטוקול קוצר ריאה שלמה, ולכן מייצג יותר את גרורות הריאות הכוללות, והוא עקבי יותר מספירה ידנית. מספר גישות שונות לניתוח פיג'י-I.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכללה לרפואה וטרינרית וירג'יניה-מרילנד (IA), המכון הטכנולוגי וירג'יניה לטכנולוגיה קריטית ומרכז מדע יישומי לבריאות מהונדסת (IA), והמונים הלאומיים לבריאות R21EB028429 (IA).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תא הרדמהראה הערותראה הערותהשתמש בחומרים מאושרים במדיניות המוסד שלך
חומר הרדמהראה הערותראה הערותהשתמש בחומרים מאושרים במדיניות המוסד שלך
BALB/c עכברים נקבותמעבדת ג'קסון000651
מספריים קהיםRobozRS-6700
מחשבוןכלכל
מינימום של 8 מגה פיקסל
צנטריפוגהכל אחתצריכה להיות מסוגלת ל-125 x g ו-300 x
g CO2 הגדרת המתת חסדראה הערותראה הערותהשתמש בחומרים מאושרים במדיניות המוסד שלך
חדר קירור, מקרר, אחסון קרכל
מחשב עם Fiji-ImageJכלאחדצריך להיות מסוגל להריץ Fiji-ImageJ
תא ספירהפישר סיינטיפיק02-671-10
מספריים מעוקליםRobozRS-5859
מים מזוקקיםכל
ElastaseMP Biomedicals100617
משקל אלקטרוניכל
סרום בקר עוברי (FBS)R& D SystemsS11150
מלקחייםRobozRS-8100
IceN/AN/A
אינקובטורראה הערותהערותצריך להיות מסוגל ל-5% CO2 ו-37 ° C
מתנולפישר מדעיA412SK-4
מתילן כחולסיגמא-אולדריץ'03978-250 מ"ל
פניצילין סטרפטומיציןATCC30-2300
סיכות או מחטיםכלאחדלהצמדת עכברים במהלך נקרופסיה
קליפרים מפלסטיקVWR25729-670
RMPI-1640 בינוניATCC30-2001
נדנדה או גלגל מסתובבכל
מספריים חדיםRobozRS-6702
מסנן חד פעמי סטרילי עם קרום PESThermoFisher Scientific568-0010
T-150 צלוחיותפישר סיינטיפיק08-772-48
T-25 צלוחיותפישר סיינטיפיק10-126-10
T-75 צלוחיותפישר סיינטיפיק13-680-65
פלסטיק תלת-פיניתפישר סיינטיפיק14-955-111Fמשמש לשקילת עכברים
טריפן כחולVWR97063-702
Trypsin-EDTAATCC30-2101
קולגנאז מסוג IVסיגמא-אולדריץ'C5138
3.5 ס"מ צלחות תרבית רקמותמזרק Nunclon153066
1 מ"לBD309659
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"לVWR87003-294
10 ס"מ צלחות תרבית רקמותפישר סיינטיפיק08-772-22
12 צלחתבאר קורנינג3512
צינור צנטריפוגה 15 מ"לפישר סיינטיפיק14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)Fisher ScientificSH30028FS
1X Hank' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)Thermo ScientificSH3026802
27 גרם 1/2 במחטיםFisher Scientific14-826-48
4T1 (ATCC® CRL וביישן; 2539&סחר;)ATCCCRL-2539
צינור צנטריפוגה 50 מ"לפישר סיינטיפיק14-959-49A
6-תיוגוניןסיגמא-אולדריץ'A4882
70 μ מסננת תאים MFisher Scientific22-363-548
70% אתנולSigma AldrichE7023יש לדלל ל-70% עם מי DI
מצלמה ראה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
  2. Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (201....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lung Metastasis Quantification4T1 Breast Cancer ModelComputer based Image AnalysisFiji ImageJ AnalysisMethylene Blue StainingMetastatic Burden MeasurementTissue Culture Plate AnalysisColony Counting AutomationImage Thresholding MethodMetastasis Detection Protocol

Related Articles