Method Article

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

DOI:

10.3791/61812

⸱

October 25th, 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפטוציטים ראשוניים נמצאים בשימוש נרחב במחקר במבחנה בכבד , במיוחד במחקרי חילוף חומרים של גלוקוז. טכניקת בסיס הותאמה על בסיס צרכים שונים, כמו זמן, עבודה, עלות ושימוש ראשוני בהפטוציטים, וכתוצאה מכך פרוטוקולי בידוד ראשוניים שונים של הפטוציטים. עם זאת, הצעדים הרבים וההכנות המגיבים הגוזלים זמן רב בבידוד הפטוציטים ראשוני הם חסרונות עיקריים ליעילות. לאחר השוואת פרוטוקולים שונים עבור היתרונות והחסרונות שלהם, היתרונות של כל אחד מהם שולבו, ונוצר פרוטוקול בידוד הפטוציטים ראשוני מהיר ויעיל. תוך כ-35 דקות בלבד, פרוטוקול זה יכול להניב הפטוציטים ראשוניים בריאים באותה מידה, אם לא יותר, כמו פרוטוקולים אחרים. יתר על כן, ניסויים במטבוליזם של גלוקוז שבוצעו באמצעות הפטוציטים ראשוניים מבודדים אימתו את התועלת של פרוטוקול זה במחקרי חילוף חומרים בכבד במבחנה . כמו כן, סקרנו וניתחנו בהרחבה את המשמעות והתכלית של כל שלב במחקר זה, כך שחוקרים עתידיים יוכלו לייעל עוד יותר את הפרוטוקול הזה על סמך הצרכים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכבד משמש כאחד האיברים החשובים ביותר בגוף בעלי החוליות בשל התפקיד החיוני שהוא ממלא בתפקודים תומכי חיים רבים כמו עיכול מזון, זרימת דם וניקוי רעלים. השימוש בתרבית הפטוציטים ראשונית במבחנה של עכבר פופולרי יותר ויותר במחקרים על חילוף חומרים של פחמימות וקרצינומה בכבד. לכן, חשוב לפתח שיטה נוחה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכבר תוך שמירה על תפקודו הפיזיולוגי המולד. בשל תפקודו כמרכז של חילוף חומרים של גלוקוז, הכבד הוא גם מרכזי בייצור גלוקוז ואחסון1. ניסויים עם הפטוציטים ראשוניים במבחנה הם חובה לרוב מחקרי חילוף החומרים של גלוקוז. לכן, במשך שנים, קבוצות מחקר שונות פיתחו פרוטוקולים לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

ההליך הכללי של בידוד הפטוציטים של עכברים הוא קודם כל לשטוף את הדם בכבד עם נוזל איזוסמוטי כגון מלח בחסימת פוספט (PBS) או תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS) ולאחר מכן להשתמש בתמיסה המכילה קולגן כדי לנתק הפטוציטים. פרוטוקולים אלה חולקים הליך כללי אך נבדלים זה מזה בריאגנטים ובשלבים בהתאם לצרכים שונים. עם זאת, הכנת ריאגנטים נדרשים וביצוע צעדי בידוד לוקחים זמן. בפיתוח הפרוטוקול הנוכחי, היעילות נקבעה כעדיפות, כאשר כל הריאגנטים מוכנים לשימוש וזמינים מהשוק, וכמה שפחות צעדים. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה מהירה ויעילה לעבודה כדי לבודד הפטוציטים ראשוניים מעכבר, מבלי לסכן את טוהר הפטוציטים ראשוני מבודדים ואת הכדאיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של ג'ונס הופקינס. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים נקבות C57BL/6 (בנות 8 שבועות).

1. הכנה:

  1. ערבבו את ה-E Medium של William 's (תוסף גלוטמקס) עם 10% FBS ו-1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקרוטיקוטית כדי להפוך את התרבית למדיום.
  2. סנן 25 מ"ל של מדיום פיזור קולגן (למשל, Liver Digest Medium) דרך מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת חלקיקים.
  3. חם 50 מ"ל של H2O מזוקק כפול (ddH2O), 35 מ"ל של מדיום פרפוזיה (למשל, מדיום פרפוזיה בכבד) (או 50 מ"ל בפעם הראשונה באמצעות פרוטוקול זה), ו-25 מ"ל של מדיום מסונן של קולגן-דיספוזיה באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. בתוך מכסה מנוע תרבית רקמה סטרילי, יש לערבב 2 מ"ל של 10x HBSS ו-18 מ"ל של פרקול בצינור של 50 מ"ל כדי ליצור 20 מ"ל 1x Percoll-HBSS ולשמור על קרח או 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן לשמור 1x Percoll-HBSS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים לפחות.
  5. בתוך קפוצ'ון תרבית רקמה סטרילי, יוצקים 30 מ"ל של מדיום שטיפה (למשל, Hepatocyte Wash Medium) לתוך צלחת פטרי נקייה, ושומרים על קרח.
  6. טבלו את צינור השאיבה במים של אמבט מים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס. התוצאות הן האמינות ביותר אם טמפרטורת החדר היא ב 25 °C (76 °F).
  7. הכן 2 מ"ל של 1x הרדמה על ידי ערבוב 225 μL של קטמין HCL, 93.75 μL של Xylazine, ו 1681 μL של 1x PBS.
  8. הרדמה עכבר אחד בשיטה מאושרת. כאן הוזרק לעכבר תוך-צפקית 150 μL של הרדמה של 1x. בצע את הבדיקות לאובדן רפלקסים כגון תגובה לצביטת הבוהן כדי להבטיח הרדמה מלאה.
  9. הצמידו את העכבר שעל גבו אל משטח הנתיחה על ידי ארבע גפיים, על ידי הצמדה או שימוש בנייר דבק חסין מים או בשיטות אחרות שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המוסד (או מקבילות).
  10. הכן מלקחיים ומספריים מעוקרים לניתוח. כדי למנוע זיהום אפשרי, לבצע את כל הצעדים בתוך מכסה המנוע סטרילי.

2. נוהל:

  1. באמצעות משאבה פריסטלטית, התחילו לשאוב ddH2O מחומם במהירות של 4 מ"ל/דקה למשך 5 דקות. משנים את צינור השאיבה ממים למדיום זלעפות מחומם.
  2. יש לחטא את בטנו של העכבר המרדים ב-70% EtOH ולחתוך עם מספריים כדי לחשוף את הכבד, את וריד הפורטל ואת הווריד הנבוב התחתון (IVC).
  3. עצרו את המשאבה הפריסטלטית. הכנס צנתר 24 G (לדוגמה, קטטר IV סגור, 24 G, 0.75 IN) לתוך IVC. התחילו לשאוב וחתכו את וריד הפורטל פתוח.
  4. ממשיכים לשאוב עד שהנוזל השטוף מתבהר (בסביבות 3-5 דקות). לחץ על וריד הפורטל בכל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. היזהרו לא לתת לבועות אוויר להיכנס ל-IVC.
    הערה: שלב זה הוא לשטוף כמה שיותר דם מהכבד.
  5. שנה את צינור השאיבה ממדיום הזלוף למדיום הפיזור של הקולג'נאז. ממשיכים לשאוב עד שכל 25 מ"ל של מדיום הקולגנאז-דיספוזה מתרוקן תוך כדי ביצוע שלב 2.6.
  6. לחץ על וריד הפורטל בכל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד.
    הערה: בשלב זה, אובדן מוחלט של דם הוא קטלני לעכבר. מותו של העכבר יכול להיות מאושר על ידי חוסר פעימות לב לאחר הניסוי. השליכו את הפגר בהתאם למדיניות המתקן.
  7. מבודדים את כל הכבד החוצה ללא כיס המרה למדיום הכביסה של 30 מ"ל בצלחת פטרי על קרח.
  8. קרעו אותו לחתיכות עם מלקחיים כדי לשחרר הפטוציטים ראשוניים לתמיסה. שלב זה יהפוך את מדיום הכביסה לתמיסה עכורה מלאה בהפטוציטים ראשוניים משוחררים וחתיכות כבד קטנות.
  9. סנן את הפתרון המעונן בשלב 2.8 דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך 20 מ"ל 1x Percoll-HBSS בצינור 50 מ"ל על קרח. מערבבים על ידי היפוך הצינור 20 פעמים.
  10. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  11. בתוך מכסה התרבית רקמה, שאפו את הסופרנטנט. לשטוף את הכדור עם 30 מ"ל קר של מדיום לשטוף.
  12. צנטריפוגה ב 50 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  13. הסר את ה-supernatant והחזיר את הכדור ב-25 מ"ל של מדיום התרבית (או נפחים אחרים מתאימים) בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה.
  14. ספרו את מספר התאים וצלחו את התאים על גבי לוחות התרבית הרצויים על פי התכנון הניסיוני.
    הערה: הפטוציטים ראשוניים המבודדים כראוי מעכבר אחד בן 8 שבועות בדרך כלל מספיקים כדי להיות מצופים על ארבע צלחות של 6 בארות או ארבע צלחות של 12 בארות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת לבחון את היעילות, פרוטוקול הבידוד הראשוני הנוכחי של הפטוציטים בוצע על נקבות עכברי C57BL/6 בנות 8 שבועות. ההתקשרות והטוהר של הפטוציטים ראשוניים מבודדים נבדקו. בידוד ראשוני של הפטוציטים משמש למגוון רחב של ניסויים בפיזיולוגיה של הכבד, כגון השפעות תרופות בכבד ומטבוליזם של גלוקוז, פעילות סמנים ביולוגיים תרופתיים2, רגישות לאינסולין וייצור גלוקוז. לכן, הפעילות של hepatocytes הראשיים שבודדו עם פרוטוקול זה נבדקו בניסויים הבאים.

הציפוי לא היה נדרש להצמדת הפטוציטים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פותחו פרוטוקולים שונים לבידוד הפטוציטים ראשוניים. הם גם נשמרו מותאמים ומותאמים בהתאם לצרכים שונים (טבלה 1). פרוטוקולי בידוד מורכבים בדרך כלל משני חלקים: פרפוזיה (כולל עיכול אנזים) וטיהור.

ניתן לבצע את הזלוף עם כל הכבד in vivo 2,20,21,22,23 או עם אונות כבד מנותחות 24. הזלוף של אונות מ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענק 5R01HD095512-02 ל- S.W.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
12 בארותציפויFALCON353043
FALCON353046צלחת 6 בארותלא נדרש
אנטי-AKTCell Signaling2920S
תמיסה אנטיביוטית אנטי-פטרייתית (100x), מיוצבסיגמא-אולדריץ'A5955
אנטי-FOXO1איתות תאים97635S
אנטי-GAPDHאיתות תאים2118S
אנטי-p-AKT (S473)איתות תאים9271L
אנטי-PEPCKסנטה קרוזSC-166778
אנטי-p-FOXO1 (S256)איתות תאים84192S
מסננת תאים, 70 ומיקרו; mCELLTREAT229483
צנתר IV סגור, 24 מד 0.75 INבקטון דיקינסון383511
DMEM, ללא גלוקוז, ללא גלוטמין, ללא פנול אדוםThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChrom ערכת בדיקת גלוקוזBioAssay SystemsEBGL-100
סרום בקר עוברי (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
גלוקגוןסיגמא-אולדריץ'G2044
עיזים נגד עכבר IgG נוגדן משניLI-COR926-68070
עיזים נגד ארנב IgG נוגדן משניLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareNA
Hepatocyte Wash בינוניGibco17704-024
IBMXאיתות תאים13630S
אינסוליןליליNDC 0002-8215-01
קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/מ"ל)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-גלוטמיןגיבקו25030081
עיכול כבד בינוניGibco17703-034Aliquot בתוך מכסה המנוע של תרבית רקמות ל-25 מ"ל כל אחד בצינור של 50 מ"ל, ושמור ב-20 מעלות; C מקפיא
זלוף כבד בינוניGibco17701-038
Pen StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
משאבה פריסטלטיתGilsonMinipuls 2מסוגל לשאוב במהירות של 4 מ"ל לדקה
צלחת פטריFisherbrand08-757-12
צנטריפוגהמקוררתSorvallLegend RTמסוגל לצנטריפוגה של צינור 50 מ"ל ב-4 מעלות; C
נתרן L-לקטטסיגמא-אולדריץ' L7022
11360070נתרן פירובטGibco
, PVDF 0.45 ומיקרו; מזרק CELLTREAT 229745 בקוטר 30 מ"מ
בקטון דיקינסון0.5 מ"ל
תמיסת טריפן כחולה 60
, צינור 430052
מיכל אמבטיהקורנינגCLS6783או כל מיכל אמבט מים המסוגל להתחמם עד 45 מעלות; סי
ויליאם' s E בינוני (תוסף GlutaMAX)ג'יבקו32551020
קסילוזין (100 מ"ג/מ"ל)VetoneAnased LANDC13985-704-10
לא נדרשציפוי מסנן מזרק , מזרק 329461 , מ"ל בקטון דיקינס 309653 ון, צינור 15250061 0.4% גיבקוקורנינג 15 מ"ל, מים קורנינג 430290 מ"ל

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
  2. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  3. Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  4. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214(2015).
  5. Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).
  6. Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
  7. Crispe, I. N. Hepatocytes as immunological agents. Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).
  8. Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
  9. Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).
  10. Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
  11. Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
  12. Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
  13. Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
  14. Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
  15. Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
  16. Shih, S. C., et al. Molecular profiling of angiogenesis markers. American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).
  17. Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
  18. Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).
  19. Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
  20. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  21. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).
  22. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  23. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).
  24. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169(2007).
  25. Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
  26. Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
  27. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  28. Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48(2017).
  29. Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
  30. Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
  31. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  32. Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
  33. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  34. Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
  35. Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Primary Hepatocyte IsolationPeristaltic Pump PerfusionCollagenase Dispase DigestionCell Strainer FiltrationCentrifugation WashingHepatocyte Marker AnalysisGlucose Metabolism AssaysInsulin Sensitivity TestingTime Efficient ProtocolLabor Friendly Method

Related Articles