Method Article

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

DOI:

10.3791/61812

⸱

October 25th, 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפטוציטים ראשוניים נמצאים בשימוש נרחב במחקר במבחנה בכבד , במיוחד במחקרי חילוף חומרים של גלוקוז. טכניקת בסיס הותאמה על בסיס צרכים שונים, כמו זמן, עבודה, עלות ושימוש ראשוני בהפטוציטים, וכתוצאה מכך פרוטוקולי בידוד ראשוניים שונים של הפטוציטים. עם זאת, הצעדים הרבים וההכנות המגיבים הגוזלים זמן רב בבידוד הפטוציטים ראשוני הם חסרונות עיקריים ליעילות. לאחר השוואת פרוטוקולים שונים עבור היתרונות והחסרונות שלהם, היתרונות של כל אחד מהם שולבו, ונוצר פרוטוקול בידוד הפטוציטים ראשוני מהיר ויעיל. תוך כ-35 דקות בלבד, פרוטוקול זה יכול להניב הפטוציטים ראשוניים בריאים באותה מידה, אם לא יותר, כמו פרוטוקולים אחרים. יתר על כן, ניסויים במטבוליזם של גלוקוז שבוצעו באמצעות הפטוציטים ראשוניים מבודדים אימתו את התועלת של פרוטוקול זה במחקרי חילוף חומרים בכבד במבחנה . כמו כן, סקרנו וניתחנו בהרחבה את המשמעות והתכלית של כל שלב במחקר זה, כך שחוקרים עתידיים יוכלו לייעל עוד יותר את הפרוטוקול הזה על סמך הצרכים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכבד משמש כאחד האיברים החשובים ביותר בגוף בעלי החוליות בשל התפקיד החיוני שהוא ממלא בתפקודים תומכי חיים רבים כמו עיכול מזון, זרימת דם וניקוי רעלים. השימוש בתרבית הפטוציטים ראשונית במבחנה של עכבר פופולרי יותר ויותר במחקרים על חילוף חומרים של פחמימות וקרצינומה בכבד. לכן, חשוב לפתח שיטה נוחה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכבר תוך שמירה על תפקודו הפיזיולוגי המולד. בשל תפקודו כמרכז של חילוף חומרים של גלוקוז, הכבד הוא גם מרכזי בייצור גלוקוז ואחסון1. ניסויים עם הפטוציטים ראשוניים במבחנה הם חובה לרוב מחקרי חילוף החומרים של גלוקוז. לכן, במשך שנים, קבוצות מחקר שונות פיתחו פרוטוקולים לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של ג'ונס הופקינס. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים נקבות C57BL/6 (בנות 8 שבועות).

1. הכנה:

  1. ערבבו את ה-E Medium של William 's (תוסף גלוטמקס) עם 10% FBS ו-1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקרוטיקוטית כדי להפוך את התרבית למדיום.
  2. סנן 25 מ"ל של מדיום פיזור קולגן (למשל, Liver Digest Medium) דרך מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת חלקיקים.
  3. חם 50 מ"ל של H2O מזוקק כפול (ddH2O), 35 מ"ל של מדיום פרפוזיה (למשל, מדיום פרפוזיה בכבד) (או 50 מ"ל בפעם הראשונה באמצעות פרוטוקול זה), ו-25 מ"ל של מדיום מסונן של קולגן-דיספוזיה באמבט מים של 45 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת לבחון את היעילות, פרוטוקול הבידוד הראשוני הנוכחי של הפטוציטים בוצע על נקבות עכברי C57BL/6 בנות 8 שבועות. ההתקשרות והטוהר של הפטוציטים ראשוניים מבודדים נבדקו. בידוד ראשוני של הפטוציטים משמש למגוון רחב של ניסויים בפיזיולוגיה של הכבד, כגון השפעות תרופות בכבד ומטבוליזם של גלוקוז, פעילות סמנים ביולוגיים תרופתיים2, רגישות לאינסולין וייצור גלוקוז. לכן, הפעילות של hepatocytes הראשיים שבודדו עם פרוטוקול זה נבדקו בניסויים הבאים.

הציפוי לא היה נדרש להצמדת הפטוציטים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פותחו פרוטוקולים שונים לבידוד הפטוציטים ראשוניים. הם גם נשמרו מותאמים ומותאמים בהתאם לצרכים שונים (טבלה 1). פרוטוקולי בידוד מורכבים בדרך כלל משני חלקים: פרפוזיה (כולל עיכול אנזים) וטיהור.

ניתן לבצע את הזלוף עם כל הכבד in vivo 2,20,21,22,23 או עם אונות כבד מנותחות 24. הזלוף של אונות מ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענק 5R01HD095512-02 ל- S.W.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
12 בארותציפויFALCON353043
FALCON353046צלחת 6 בארותלא נדרש
אנטי-AKTCell Signaling2920S
תמיסה אנטיביוטית אנטי-פטרייתית (100x), מיוצבסיגמא-אולדריץ'A5955
אנטי-FOXO1איתות תאים97635S
אנטי-GAPDHאיתות תאים2118S
אנטי-p-AKT (S473)איתות תאים9271L
אנטי-PEPCKסנטה קרוזSC-166778
אנטי-p-FOXO1 (S256)איתות תאים84192S
מסננת תאים, 70 ומיקרו; mCELLTREAT229483
צנתר IV סגור, 24 מד 0.75 INבקטון דיקינסון383511
DMEM, ללא גלוקוז, ללא גלוטמין, ללא פנול אדוםThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChrom ערכת בדיקת גלוקוזBioAssay SystemsEBGL-100
סרום בקר עוברי (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
גלוקגוןסיגמא-אולדריץ'G2044
עיזים נגד עכבר IgG נוגדן משניLI-COR926-68070
עיזים נגד ארנב IgG נוגדן משניLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareNA
Hepatocyte Wash בינוניGibco17704-024
IBMXאיתות תאים13630S
אינסוליןליליNDC 0002-8215-01
קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/מ"ל)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-גלוטמיןגיבקו25030081
עיכול כבד בינוניGibco17703-034Aliquot בתוך מכסה המנוע של תרבית רקמות ל-25 מ"ל כל אחד בצינור של 50 מ"ל, ושמור ב-20 מעלות; C מקפיא
זלוף כבד בינוניGibco17701-038
Pen StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
משאבה פריסטלטיתGilsonMinipuls 2מסוגל לשאוב במהירות של 4 מ"ל לדקה
צלחת פטריFisherbrand08-757-12
צנטריפוגהמקוררתSorvallLegend RTמסוגל לצנטריפוגה של צינור 50 מ"ל ב-4 מעלות; C
נתרן L-לקטטסיגמא-אולדריץ' L7022
11360070נתרן פירובטGibco
, PVDF 0.45 ומיקרו; מזרק CELLTREAT 229745 בקוטר 30 מ"מ
בקטון דיקינסון0.5 מ"ל
תמיסת טריפן כחולה 60
, צינור 430052
מיכל אמבטיהקורנינגCLS6783או כל מיכל אמבט מים המסוגל להתחמם עד 45 מעלות; סי
ויליאם' s E בינוני (תוסף GlutaMAX)ג'יבקו32551020
קסילוזין (100 מ"ג/מ"ל)VetoneAnased LANDC13985-704-10
לא נדרשציפוי מסנן מזרק , מזרק 329461 , מ"ל בקטון דיקינס 309653 ון, צינור 15250061 0.4% גיבקוקורנינג 15 מ"ל, מים קורנינג 430290 מ"ל

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
  2. Severgnini, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Primary Hepatocyte IsolationPeristaltic Pump PerfusionCollagenase Dispase DigestionCell Strainer FiltrationCentrifugation WashingHepatocyte Marker AnalysisGlucose Metabolism AssaysInsulin Sensitivity TestingTime Efficient ProtocolLabor Friendly Method

Related Articles