פרוטוקול זה מציג שיטה לפיתוח פיגום באמצעות כליות חולדה decellularized. הפרוטוקול כולל תהליכי דקלולריזציה ורסקולריזציה כדי לאשר זמינות ביולוגית. Decellularization מבוצעת באמצעות טריטון X-100 ונתרן דודקיל סולפט.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
הנדסת רקמות היא משמעת חדשנית בביו-רפואה. טכניקות תרבות התא ניתן ליישם עבור התחדשות של רקמות ואיברים תפקודיים להחליף איברים חולים או פגומים. פיגומים נדרשים כדי להקל על הדור של איברים תלת מימדיים או רקמות באמצעות תאי גזע מובחנים vivo. בדו"ח זה, אנו מתארים שיטה חדשנית לפיתוח פיגומים וסקולריים באמצעות כליות חולדה decellularized. במחקר זה נעשה שימוש בחולדות ספראג-דולי בנות שמונה שבועות, והפרין הוזרק ללב כדי להקל על הזרימה לכלי הכליה, מה שאיפשר להפרין לחלחל לכלי הכליה. חלל הבטן נפתח והכליה השמאלית נאספה. הכליות שנאספו היו perfused במשך 9 שעות באמצעות חומרי ניקוי, כגון טריטון X-100 ונתרן דודקיל סולפט, כדי decellularize את הרקמה. פיגומים בכליות Decellularized נשטפו בעדינות עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין והפרין כדי להסיר פסולת הסלולר ושאריות כימיות. השתלת תאי גזע עם פיגומי כלי דם decellularized צפוי להקל על הדור של איברים חדשים. לכן, פיגומים vascularized עשוי לספק בסיס להנדסת רקמות של שתלי איברים בעתיד.
מבוא
טכניקות תרבית תאים מיושמות עבור התחדשות של רקמות ואיברים תפקודיים להחליף איברים חולים או פגומים. השתלת איברים אלוגנית היא כיום הטיפול הנפוץ ביותר לנזק בלתי הפיך לאיברים; עם זאת, גישה זו דורשת שימוש בדיכוי המערכת החיסונית כדי למנוע דחייה של האיבר המושתל. יתר על כן, למרות ההתקדמות באימונולוגיה של ההשתלה, 20% ממקבלי ההשתלה עלולים לחוות דחייה חריפה בתוך 5 שנים, ובתוך 10 שנים לאחר ההשתלה, 40% מהמטופלים עלולים לאבד את השתל המושתל שלהם או למות1.
ההתקדמות בטכנולוגיות להנדסת רקמות הניבה פרדיגמה חדשה להשתלת איברים חדשים ללא דחייה חיסונית באמצעות תאי גזע מובחנים. לאחר בידול תאי גזע, יש צורך בפיגום, הנקרא מטריצה חוץ-תאית סינתטית, כדי להקל על יצירת איברים תלת מימדיים ולאפשר לרקמה החדשה לשגשג בתוך המטופל. פיגומים מאיברים מקומיים decellularized יש יתרונות, כולל סביבה יעילה יותר להקמת תאים ושיפור התפשטות תאי גזע, אם כי מנגנונים אלה לא הובהרו במלואם2. בפרט, הכליה היא איבר מתאים לייצור פיגומים כי יש לה זרימת דם בשפע נישה להקמת תאי גזע. בנוסף, בגלל המבנה המורכב של הכליה, קשה לחדש באופן מלאכותי כליות להשתלת איברים.
בדו"ח זה, אנו מציגים שיטה של פיתוח פיגומים vascularized באמצעות איברים decellularized במודל חולדה כדי להקל על מחקרים עתידיים בבעלי חיים למטרות הנדסת רקמות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה אושר על ידי הנהלת האוניברסיטה הלאומית לרפואה של פוסאן ונערך בהתאם להנחיות אתיות לשימוש ולטיפול בבעלי חיים. (תעודה מס' 2017-119). לפני כל מחקר בבעלי חיים, יש לקבל אישור מוסדי.
הערה: כל המכשירים/ציוד/ציוד/ריאגנטים הכירורגיים וההרדמה המומלצים להצגה כירורגית מוצלחת והדמיה של איברי בטן מפורטים בטבלה 1.
1. נהלי הכנה לקצירת כליות חולדה
- כהכנה לניתוח, מניחים חולדות ספראג-דוולי בנות 8 שבועות (במשקל 200-250 גרם) על כרית חימום. מניחים בדיקה מדחום רקטלי בפי הטבעת כדי לפקח על טמפרטורת הליבה.
- יש למרדים את החולדה עם תערובת של 5% של גז isoflurane (אינדוקציה: 5%, תחזוקה: 3%).
- כדי להתחיל את הניתוח, למקם את החולדה בעמדה על-חושית לאחר ניהול הרדמה. הר את ארבעת הגפיים של החולדה על שולחן הניתוחים עם קלטת.
- לגלח ולנקות את הבטן של החולדה התורם עם סבון germicidal. החל 2% betadine לפחות 1-2 דקות, ולנגב עם פתרון 70% אתנול. חזור על רצף זה שלוש פעמים.
- כסה את השדה האופרטיבי עם וילון סטרילי.
- בצע חתך בטן אנכי ולחשוף את הכליה השמאלית, שופך, בטן כאבי העורקים, ו vena קאווה נחות.
- דמיינו ונתחו את הכליה השמאלית, השופכן, אתאבי הבטן ואת הווריד הנחות רגע לפני חיתוך הפדיקל.
2. זלוף טרנסקרדיאלי
- לפני הניתוח, הכינו את פתרון הזלוף.
- הפוך 50 מ"ל של פתרון זלוף לכל חולדה.
- יש לערבב 1x PBS עם הפרין 10 U/mL בקירוב (בקבוקון 1 25 קילוואט-ואט יעשה 2.5 ליטר של PBS+Hep).
- לערבב כמויות שוות של 8% paraformaldehyde עם 1x PBS כדי להפוך את פתרון 4% PFA/1xPBS.
הערה: 8% PFA המיוצר במים יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (70 °F) עד 2 חודשים. עם זאת, 4% PFA מדולל PBS הוא יציב רק במשך שבוע אחד ב 4 מעלות צלזיוס. הפוך את הדילול לרענן.
- מאריכים את החתך הבטן האנכי בגולגולת. הקפד למשוך את המספריים מן האיברים בעת חיתוך, כדי למנוע פגיעה באיברים הפנימיים.
- המשך את החתך דרך כלוב הצלעות, ולאחר מכן לחתוך דרך הסרעפת על ידי הרמת עצם החזה.
- הצמד את דש העור הרופף מהדרך, ושחרר את הלב על ידי קריעת כל רקמת חיבור עם המלקחיים.
התראה: אין להשתמש במספריים כדי לשחרר את הלב והדבר עלול לגרום לדימום לא רצוי. - פתח את קו מלוחים אגירת פוספט (PBS) ולהבטיח כי הקו זורם לפני הנחת המחט לתוך החדר השמאלי. החזק את הלב בעדינות עם מלקחיים קהים, ולהשתמש hemostat כדי לשלוט על המחט. המחט צריכה להיות מוכנסת לא יותר מ 1/4 אינץ '.
הערה: הכנסה הגדולה מ- 1/4 אינץ' עלולה לגרום לניקוב לצד השני של הרקמה. - תוך תמיכה בלב עם המחט והמוסטט, לאתר את האטריום הנכון לצלוח דרכו עם מספריים iridectomy. הניחו את ההמוסטט על גופו של החולדה, וודאו שהמחט עדיין ממוקמת בתוך הלב.
הערה: אם החתך מספיק, צריך להיות דם בחלל הגוף כמו הלחץ של PBS זורם לתוך החולדה הוא הקלה. - בזהירות לבטל את הצמדת הרגליים הקדמיות ואת דש העור.
- המשך perfusing PBS במשך 4 דקות או יותר אם יש עדיין דם גלוי בכליות ובכבד.
3. קצירת כליות ודקלולריזציה
- לקצור את הכליה השמאלית עם כאבי העורקים הבטן ורידים נחותים.
- ליגייט השופרן, פי העורקים החזה, vena קאווה מעולה, וענפים שלאבי העורקים הבטן.
- שמור על האיבר hydrated PBS של Dulbecco (DPBS) בצלחת פטרי 10 ס"מ.
- ניתן לתמצת אתאבי הבטן ואת הווריד הנבוב הנחות עם קטטר 23 מד. כדי להסיר שאריות דם, לחבר את הצינורית עם משאבה peristaltic, ולשטוף עם DPBS (500 מ"ל) ו 16 U / mL הפרין במשך 90 דקות בקצב של 5 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס.
- כדי decellularize את הכליה, לחלחל הכליה עם 1% טריטון X-100 (1 L) עבור 3 שעות ולאחר מכן עם 0.75% נתרן דודקיל סולפט (SDS) פתרון (2 L) עבור 6 שעות בלחץ מתמיד של 40 מ"מ היג.
הערה: הכליה תהפוך שקופה לאחר 8 שעות. - כדי להסיר SDS שיורית, לעיין במדגם עם 1% פניצילין במים מזוקקים (6 L) במשך 18 שעות (לילה) ולאחר מכן עם DPBS סטרילי (500 מ"ל) ו 16 U / mL הפרין במשך 90 דקות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המורפולוגיה הגולמית של כליות חולדה הייתה אדומה כהה (איור 1A). לאחר דקלולריזציה, הכליה הפכה חיוורת ושקוף (איור 1D). שאריות DNA גנומי הוערך עם ערכה מסחרית על פי הוראות היצרן, בפיגומים כליות decellularized לעומת זה בכליות מקומיות (שליטה). ניתוח כמותי אישר כי DNA גנומי רקמה כמעט בוטל לאחר decellularization. מ-14 מקרים, תכולת הדנ"א הממוצעת הייתה 115.05 ננוגרם/μL לבקרה ו-1.96 ננוגרם/μL לפיגום הנקוב. בסך הכל הוסרו 98.3% מהדנ"א (איור 2),אם ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקולים שונים שימשו decellularization של איברים ורקמות אחרות. פרוטוקול decellularization האופטימלי צריך לשמר את הארכיטקטורה התלת מימדית של המטריצה החוץ תאית (ECM). באופן כללי, פרוטוקולים כאלה מורכבים lysing קרום התא על ידי עיבוד פיזי או פתרונות יוניים, ניתוק הציטופלסמה והגרעין מן ECM על ידי עיבוד אנזימטי או חומרי ניקוי, ולאחר מכן הסרת פסולת הסלולר מן הרקמה3. תהליכים פיזיקליים כוללים גירוד, עצבנות פתרון, שיפוע לחץ, הצמדה הקפאה, electroporation קבוע לאthermal, ונוזלים סופר קריטיים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענק מכון מחקר ביו-רפואי מבית החולים האוניברסיטאי הלאומי פוסאן.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק 1 סמ"ק (הזרקת בדיקות ופתרונות רכב | בקטון דיקינסון | 305217 | |
| 10-0 אתילון לאנסטומוזה של כלי הדם | Ethicon | 9032G | |
| 25 מד אינץ' מחט מדריך (לצנתרים של כלי הדם) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 חולדת סגירת חתך PDS | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 חולדת | סגירת חתך פרולןEthicon | 8832H | |
| 3-0 גישה/קשירה לכלי דם סליל משי בחולדה | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS עכבר סגירת חתך | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 עכבר סגירת חתך פרולן | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 גישה/קשירה לכלי דם סליל משי בעכבר | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| מספריים עדינים לחיתוך פאשיה/רקמת חיבור | Fine Science | Tools 14058-09 | |
| מחזיק מחט Halsey | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat לחולדות: מהדק שריר כדי למזער דימום בעת חיתוך | Fine Science | Tools 13018-14 | |
| צינורות פוליאתלין 50, צינורות קטטר 100 רגל | Braintree Scientific.023 | אינץ' וזמנים; .038 אינץ' | |
| Schwartz microserrefine מהדקי כלי דם | Fine Science | Tools 18052-01 (ישר) | |
| 18052-03 (מעוקל) | |||
| מספריים כירורגיים לחיתוך עור | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen מספריים אביביים לכריתת עורקים | כלי מדע עדינים | 15003-08 |
מקורות
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933(2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
