מאמר שיטה

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

DOI:

10.3791/61879

⸱

14 במרץ 2021

 ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה קלה לשימוש כדי ליצור מערכי מיקרוטיסו לבביים תלת-ממדיים בהרכבה עצמית המורכבים מקרדיומיוציטים פלואוריפוטנטיים מובחנים מראש המושרים על ידי בני אדם, קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל. תא זה ידידותי למשתמש ונמוך הדורש טכניקה כדי ליצור microtissues לב ניתן ליישם עבור מידול מחלות ושלבים מוקדמים של פיתוח תרופות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דור של קרדיומיוציטים אנושיים (CMs), פיברובלסטים לבביים (CFs) ותאי אנדותל (ECs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (IPSCs) סיפק הזדמנות ייחודית לחקור את יחסי הגומלין המורכבים בין סוגי תאים לב וכלי דם שונים המניעים התפתחות רקמות ומחלות. בתחום המודלים של רקמת לב, מספר גישות תלת-ממדיות מתוחכמות (3D) משתמשות בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים (iPSC-CMs) כדי לחקות רלוונטיות פיזיולוגית וסביבת רקמות מקומית עם שילוב של מטריצות חוץ-תאיות וקישורים צולבים. עם זאת, מערכות אלה מורכבות כדי לפברק ללא מומחיות microfabrication ודורשים מספר שבועות כדי להרכיב את עצמם. והכי חשוב, לרבות ממערכות אלה חסרים תאי כלי דם ופיברובלסטים לבביים המהווים מעל 60% מהלא-מיוציטים בלב האדם. כאן אנו מתארים את ההפקה של כל שלושת סוגי תאי הלב מ- IPSCs כדי לפברק מיקרוטיסות לב. טכניקת דפוס העתקים קלה זו מאפשרת תרבות מיקרוטיסו לבבית בלוחות תרבית תאים רב-תאיים סטנדרטיים במשך מספר שבועות. הפלטפורמה מאפשרת שליטה מוגדרת על ידי המשתמש בגדלים microtissue בהתבסס על צפיפות זריעה ראשונית ודורש פחות מ 3 ימים להרכבה עצמית כדי להשיג התכווצויות microtisue לב נצפה. יתר על כן, microtissues הלב ניתן לעיכול בקלות תוך שמירה על כדאיות גבוהה של תאים לחקירה של תא יחיד עם שימוש ציטומטריית זרימה ורצף RNA חד-תאי (scRNA-seq). אנו חוזים כי מודל הפריה חוץ גופית זה של מיקרוטיסויות לב יסייע להאיץ מחקרי אימות בגילוי תרופות ומודלים של מחלות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גילוי תרופות ומודלים של מחלות בתחום המחקר הקרדיווסקולרי מתמודדים עם מספר אתגרים בשל מחסור בדגימות רלוונטיות קלינית וכלים תרגומיים לקויים1. מודלים פרה-קליניים מורכבים ביותר או מודלים פשטניים יתר על המידה במבחנה של תאים חד-תאיים אינם מציגים תנאים פתופיזיולוגיים באופן ניתן לשחזור. לכן, מספר פלטפורמות ממוזערות מהונדסות רקמות התפתחו כדי לעזור לגשר על הפער, במטרה להשיג איזון בין קלות היישום באופן בעל תפוקה גבוהה לבין תקציר נאמן של תפקוד הרקמה2,3. עם הופעתה של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC), ניתן ליישם כלים להנדסת רקמות על תאים ספציפיים למטופל עם או בלי מחלות לב וכלי דם בסיסיות כדי לענות על שאלות מחקר4,5,6. מודלים מהונדסים רקמות כאלה עם הרכב תאי דומה רקמת הלב יכול להיות מנוצל במאמצי פיתוח תרופות כדי לבדוק cardiotoxicity וחוסר תפקוד הנגרמים על ידי שינויים פתולוגיים בהתנהגות של סוג תא אחד או מרובים.

מיקרוטיסואים או אורגנוידים בהרכבה עצמית שמקורם ב-IPSCs אנושיים הם מבנים תלת-ממדיים (3D) שהם מכלולים זעירים דמויי רקמות המציגים קווי דמיון פונקציונליים למקביליהם ב-vivo . ישנן מספר גישות שונות המאפשרות היווצרות של organoids במקום באמצעות הבחנה מכוונת של iPSCs או באמצעות היווצרות של גופים עובריים4. האורגנוידים המתקבלים הם כלי הכרחי לחקר תהליכים מורפוגנטיים המניעים אורגנוגנזה. עם זאת, נוכחות של מגוון רחב של אוכלוסיות תאים והבדלים בארגון עצמי יכול להוביל לשונות בתוצאות בין organoids שונים5. לחלופין, תאים מובחנים מראש כי הם מורכבים עצמית לתוך microtissues עם סוגי תאים ספציפיים לרקמות כדי ללמוד אינטראקציות תא מקומיות הם מודלים מצוינים, שבו זה אפשרי לבודד את הרכיבים בהרכבה עצמית. במיוחד במחקר לב אנושי, פיתוח של microtissues לב 3D עם רכיבים רב תאיים הוכיח להיות מאתגר כאשר תאים נגזרים מקווי חולים שונים או מקורות מסחריים.

כדי לשפר את ההבנה המכניסטית שלנו של התנהגויות תאים במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, מותאם אישית, במבחנה, באופן אידיאלי כל סוגי התאים המרכיבים צריכים להיגזר מאותו קו מטופל. בהקשר של לב אנושי, מודל מבחנה לב מייצג באמת יתפוס את השיח הצולב בין סוגי תאים דומיננטיים, כלומר, קרדיומיוציטים (CMs), תאי אנדותל (ECs) ופיברובלסטים לבביים (CFs)6,7. הסיכום הנאמן של שריר הלב לא רק דורש מתיחה ביופיסית וגירוי אלקטרופיזיולוגי, אלא גם איתות תאי-תא הנובעים מסוגי תאים תומכים כגון ECs ו- CFs8. CFs מעורבים בסינתזה של מטריצה חוץ-תאית ושמירה על מבנה הרקמות; ובמצב פתולוגי, CFs יכול לגרום פיברוזיס ולשנות הולכה חשמלית ב- CMs9. באופן דומה, ECs יכול לווסת תכונות התכווצות של CMs באמצעות איתות paracrine ואספקת דרישות מטבוליות חיוניות10. לפיכך, יש צורך במיקרוטיסות לב אנושיות המורכבות מכל שלושת סוגי התאים העיקריים כדי לאפשר ניסויים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לתפוקה גבוהה להתבצע.

כאן, אנו מתארים גישה מלמטה למעלה בייצור של microtissues לב על ידי נגזרת של קרדיומיוציטים שמקורם IPSC אנושי (iPSC-CMs), תאי אנדותל שמקורם IPSC (iPSC-ECs), ופיברובלסטים לב נגזר IPSC (iPSC-CFs) ואת התרבות התלת-ממדית שלהם במערכים מיקרוטיזיים לב אחידים. שיטה קלה זו של יצירת מיקרוטיסו לב פועם באופן ספונטני ניתן להשתמש עבור מודלים מחלות ובדיקה מהירה של תרופות להבנה פונקציונלית ומכאניסטית של פיזיולוגיה של הלב. יתר על כן, פלטפורמות מיקרוטיסו לב רב-תאיות כאלה יכולות להיות מנוצלות בטכניקות עריכת גנום כדי לחקות התקדמות מחלות לב לאורך זמן בתנאי תרבות כרוניים או חריפים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בינוני, ריאגנט, הכנת צלחת תרבות

  1. פתרון לשטיפת תאים לתרבות התאים: יש להשתמש בתמיסת מלח אחת עם חוצץ פוספט (PBS) או ב-Hanks איזון מלח (HBSS) ללא סידן או מגנזיום.
  2. מדיית בידול קרדיומיוצ'יט
    1. הכן בידול בינוני #1 על ידי הוספת תוספת 10 מ"ל (50x B27 בתוספת אינסולין) ל 500 מ"ל קרדיומיוציטים בזאלי בינוני (RPMI 1640).
    2. הכן בידול בינוני #2 על ידי הוספת תוספת 10 מ"ל (50x B27 פחות אינסולין) ל 500 mL cardiomyocyte בינוני בסיסי (RPMI 1640).
    3. הכן טיהור בינוני #3 על ידי הוספת תוספת (50x B27 בתוספת אינסולין) כדי 500 mL cardiomyocyte בזאלי מדיום (RPMI 1640) מינוס גלוקוז.
  3. מדיית גדילה אנדותל ומיון תאים המופעלים מגנטית (MACS)
    1. הכן מדיום צמיחה אנדותל (EGM) עם ערכת תוספת בינונית לצמיחת תאי אנדותל זמינה מסחרית.
    2. הכן פתרון חיץ מיון הפרדת תאים על ידי דילול פתרון מלאי אלבומין בסרום בקר (BSA) ל- 1:20 עם פתרון שטיפה.
  4. מדיום בידול פיברובלסט לב: הכן מדיום בידול פיברובלסט לבבי עם מדיום בזאלי פיברובלסט (גלוקוז גבוה DMEM) וערכת גורמי חיים פיברובלסט ללא סרום.
  5. מדיום ייצור ותחזוקה של מיקרוטיסו לבבי: הכן מדיום מסונן עם מדיום בזאלי קרדיומיוציטים (RPMI 1640) עם תוספת (50x B27 פלוס אינסולין) ו- EGM ביחס של 70/30 v/v%.
  6. פתרונות מלאי של מולקולות קטנות וגורמי גדילה
    1. לבידול של כל שלושת סוגי התאים, הכינו 200 μL aliquots של מעכב GSK3-beta CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-מתיל-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]אמינו]אתיל]אמינו]-3-פירידיןקרבוניטריל); מעכב Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3aa,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamide; ושינוי גורם גדילה בטא (TGF-β) מעכב SB431542 (4-[4-(1,3-1,3-בנזודיוקסול-5-yl)-5-(2-פירידניל)-1H-imidazol-2-yl]בנזמיד) ב 10 mM ריכוז בדימתיל סולפוקסיד (DMSO).
    2. עבור בידול iPSC-EC אנושי, להכין 100 μL aliquots של גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) (20 מיקרוגרם / מ"ל), גורם גדילה אנדותל כלי דם 165 (VEGF165; 50 מיקרוגרם / מ"ל), וחלבון מורפוגן עצם 4 (BMP4; 20 מיקרוגרם / מ"ל) ב 0.1% (w / v) BSA במים מזוקקים אולטרה-פור. לאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F); עבור אחסון לטווח ארוך, aliquots ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F) עד 1 שנה.
  7. לוחות ציפוי מראש לתחזוקה של iPSC-CMs, iPSC-ECs, ו- iPSC-CFs.
    1. הכן מטריצת ממברנת מרתף מצופה בינוני 6-well לוחות עבור ציפוי מחדש iPSC-CM על ידי דילול גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת קרום מרתף בינוני ב DMEM / F12 ביחס של 1:200. מוסיפים 2 מ"ל של מטריצת ממברנת מרתף מדוללת בינונית לכל באר של צלחת 6-well ולהשאיר אותו להגדיר לפחות 2 עד 4 שעות.
    2. לפני הציפוי צלחת 6 בארות או צלחת 10 ס"מ עם ג'לטין. תמיסת ג'לטין נוזלית של 2% באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומכינה ג'לטין מסונן של 0.2% (v/v) ב-PBS בנפח מתאים לפי הצורך. מצפים את צלחת התרבות ב-10 מ"ל של 0.2% ג'לטין למשך 30 דקות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
      הערה: לוחות ג'לטין יכולים לשמש הן עבור iPSC-CFs והן עבור iPSC-ECs לאחר MACS.
  8. ייצור תבניות microtissue: הכינו 2% פתרון אגרוז נמס נמוך ב-PBS בבקבוק זכוכית יבש של 100 מ"ל. לחטא את האגרוז ב 121 °C (65 °F), 15 פסאיי במשך 20 דקות לפני השימוש. Autoclave את יציקת סיליקון מיקרו תבניות ב 121 °C (65 °F), 15 פסאיי במשך 15 דקות.
  9. פתרונות לעיכול, חיסון וציטומטריית זרימה
    1. לעיכול מיקרוטיסו, הכינו מאגר עיכול אנזימים של Dispase I (1 U/mL) וליבראז (3 U/mL) ב-PBS. שמור את הפתרון הזה על קרח.
    2. עבור קיבעון תאים ומיקרוטיסו, השתמש ריאגנט קיבעון קר כקרח זמין מסחרית המכיל 4.2% paraformaldehyde (PFA).
    3. הכן 0.25% טריטון X-100 ב- PBS עבור permeabilization ו 0.1% Tween-20 עבור שטיפות. ניתן לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.
    4. לניתוחי מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS), הכן את מאגר FACS [PBS או HBSS עם סרום בקר עוברי של 2% (FBS)] ואחסן בטמפרטורה של 4 °C (60 °F).
    5. לחיסון, הכינו 2% סרום עזים/חמור/ארנב רגיל ב-PBS. בחר את מין הסרום בהתבסס על הפונדקאי שבו גדלו הנוגדנים.

2. בידול וטיהור לבבי

הערה: כל IPSCs צריך להישמר ב ~ 75% עד 80% מפגש לפני בידול cardiomyocyte. IPSCs המשמשים עבור פרוטוקול זה נגזרו תאים חד גרעיניים דם היקפי (PBMCs) באמצעות תכנות מחדש של וירוס סנדאי שבוצעו בבית סטנפורד לב וכלי דם המכון (SCVI) ביובנק.

  1. לפני הבידול, תרבות iPSC מושבות עד מעבר (P20).
  2. הסר את מדיום תרבית iPSC מהצלחת 6-well ולשטוף את התאים פעם אחת עם 2 mL PBS.
  3. ביום 0, התחל אינדוקציה mesendoderm על ידי הוספת 2 מ"ל של בידול בינוני #1 עם CHIR (6 μM סופי) בכל באר. הריכוז הסופי עשוי להשתנות בין 6 ל 9 מיקרומטר עבור קווי iPSC שונים. לפיכך, מומלץ לבדוק ריכוזי CHIR שונים על צלחת 6-well כדי לזהות אינדוקציה mesoderm לב אופטימלי.
  4. ביום 2, לשחזר את התאים על ידי החלפה עם טרי 2 מ"ל בינוני #1 בכל באר.
  5. ביום 3, להחליף בינוני בכל באר עם 2 מ"ל בידול בינוני #1 עם מעכב Wnt IWR-1-endo (5 μM) כדי לגרום מפרט שושלת לב.
  6. ביום 5, לשחזר את התאים על ידי החלפת בינוני עם טרי 2 מ"ל בינוני #1 בכל באר.
  7. ביום 7, החלף בינוני עם 2 מ"ל בינוני #2 בכל באר. מכות ספונטניות של קרדיומיוציטים ניתן לראות כבר ביום 8-9. עבור קווים מסוימים, תאים פועמים עשויים להופיע מאוחר כמו ביום 11.
  8. לטיהור תרבות הבידול, החלף עם 2 מ"ל פחות גלוקוז בינוני #3 בכל באר ביום 10.
  9. ביום 13, לשחזר את התאים על ידי שינוי המדיום עם 2 מ"ל בתוספת גלוקוז בינוני #2 בכל באר.
  10. ביום 16, לבצע סיבוב שני של טיהור עם 2 מ"ל של בינוני #3 בכל באר.
  11. לשחזר את התאים ביום 19 עם 2 מ"ל בתוספת גלוקוז בינוני #2.
  12. ביום 20, לשטוף את הבארות פעם אחת עם 1 מ"ל PBS ולנתק את התאים באמצעות 1 מ"ל 10x טריפסין במשך 6 דקות ב 37 °C (57 °F). לאחר הדגירה, התאים מוסרים מפני השטח של הבאר לתאים בודדים במשך פחות מ -15 שניות ומתווספים לצינור חרוטי של 15 מ"ל עם נפח שווה של בינוני #2 כדי לנטרל את האנזים. צנטריפוגה השעיית התא במשך 3 דקות ב 270 x g.
  13. Resuspend גלולה התא ב 3 mL בינוני #3. לספור את התאים ולהוסיף נפח מתאים של בינוני #3 כדי צלחת סך של ~ 3 מיליון תאים בכל באר של מטריצת קרום מרתף חדשה מצופה בינוני 6-well צלחת. ביום השני לאחר ציפוי מחדש, להחליף את המדיום עם טרי 2 מ"ל בינוני #2, ולחדש עם 2 מ"ל בינוני #2 כל יומיים עד טריפסיניזציה של cardiomyocytes עבור הקפאה או ניסויים עתידיים.

3. בידול תאי אנדותל ו- MACS

  1. ב 75% עד 80% iPSC מפגש, לשטוף את הצלחת עם PBS, 2 מ"ל לבאר.
  2. התחל בידול ביום 0 על ידי החלפה עם 2 מ"ל של בידול בינוני #1 עם 6 μM CHIR.
  3. ביום 2, להחליף את המדיום עם 2 מ"ל של בידול בינוני #1 עם 2 מיקרומטר CHIR.
  4. ביום 4, להחליף את המדיום עם 2 מ"ל של EGM בתוספת 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165, ו 20 ng BMP4.
  5. שנה את המדיום עם 2 מ"ל של EGM בתוספת גורמי גדילה כל 2 ימים מיום 6 עד יום 10. תוספת של מעכב TGFβ (SB431542) בריכוז 8 מיקרומטר היא אופציונלית כדי לקדם התרחבות אנדותל ולדכא הבחנה של סוגי תאים אחרים שמקור mesenchymal.
  6. ביום 12, התחל שלבים עבור MACS על ידי שטיפה של כל באר עם 1 מ"ל של PBS ואחריו ניתוק תאים באמצעות 1 מ"ל של 10x טריפסין בכל באר של צלחת 6 באר במשך 8 דקות ב 37 °C (37 °F).
  7. הכן נפח שווה של מדיום EGM בצינור חרוטי 50 מ"ל כדי לנטרל את אנזים הניתוק. מניחים מסננת תאים 40 מיקרומטר על צינור חרוטי 50 מ"ל ולהעביר את ההשעיה התא מנותק דרך המסננת. שנה את המסנן עבור כל 2 עד 3 בארות מנותקות.
  8. ספור את סך התאים המעשיים באמצעות 0.4% כחול טריפאן באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי.
  9. גלולה את ההשעיה התא ב 300 x g במשך 5 דקות בצנטריפוגה מקוררת מראש להגדיר ב 4 °C (60 °F).
  10. להשליך את supernatant ו resuspend גלולה התא בנפח המתאים של מאגר מיון בהתבסס על הספירה הכוללת בשלב 3.8.
    הערה: הוסף 80 μL של מאגר מיון לכל 107 תאים כוללים.
  11. עבור תיוג חרוזים מגנטיים, להוסיף 20 μL של ריאגנט חסימת FcR לכל 107 תאים ודגרו במשך 5 דקות.
  12. הוסיפו 20 μL של CD144 או CD31 Microbeads לכל 107 תאים וערבבו היטב. לדגור על ההשעיה התא בחושך ב 4 °C (4 °F) במשך 15 דקות.
  13. הוסף 20 מ"ל של מאגר מיון כדי לשטוף את התאים המסומנים בתווית ולזרוק את התאים 300 x g במשך 5 דקות בצנטריפוגה מקוררת מראש שנקבעה על 4 °C (60 °F).
  14. resuspened גלולה התא ב 3 מ"ל של חיץ מיון ולהשאיר אותו על קרח.
  15. הכן עמודת הפרדה מגנטית על-ידי הצבת העמודה בחריץ המפריד.
  16. שיווי משקל את העמודה על ידי שטיפה עם 3 מ"ל של מאגר מיון ולאסוף את הזרימה דרך צינור חרוטי פסולת.
  17. לאחר שחיץ השטיפה זורם דרכו, סובב מחדש את מתלי התא ביסודיות כדי לשבור את כל הגושים ולהחיל את מתלי התא על העמודה.
  18. לאחר השעיית התא זרם דרך, לשטוף את העמודה עם 3 מ"ל של מאגר מיון שלוש פעמים כדי להסיר את כל התאים ללא תווית.
  19. הסר את העמודה מהמפריד ומקם אותה בצינור חרוטי בגודל 15 מ"ל עבור הארכת תאים CD144+/CD31+ /CD31+.
  20. הוסף 5 מ"ל של מאגר מיון לעמודה ומיד רוקן את התאים המסומנים באופן מגנטי עם הבוכנה.
  21. קבע את מספר התא הניתן לקיום באמצעות 0.4% כחול טריפאן באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
  22. צנטריפוגה השעיית התא בצנטריפוגה מקוררת מראש ב 300 x g במשך 3 דקות.
  23. Resuspend גלולה התא בנפח המתאים של EGM עם 5-8 מיקרומטר של מעכב TGFβ (SB431542) בהתבסס על הספירה הכוללת בשלב 3.21.
  24. צלחת זה קטע 0 (P0) תאים בצפיפות תאים מתאימה (4 x 104 תאים / cm2) על צלחת מצופה מראש 0.2% ג'לטין.
  25. עבור P0 ו- P1, המשיכו לחדש את המדיום עם EGM טרי כל יומיים עם מעכב TGFβ. מ P2, תאים יכולים להיות בתרבית במדיום צמיחה אנדותל ללא מעכב TGFβ.

4. בידול פיברובלסט לבבי

  1. אפשר IPSCs להיות 90% עד 95% יחד; לשטוף כל היטב עם 1 מ"ל PBS.
  2. התחל בידול ביום 0 על ידי הוספת 2 מ"ל של בידול בינוני #1 עם 11 μM CHIR. עבור קווי iPSC רגישים, הריכוז עשוי להשתנות בין 9-10 מיקרומטר.
  3. ביום הראשון, שימו לב לצלחת. זה נורמלי לצפות מוות תאי משמעותי עם ~ 30% עד 40% תאים דבוקים לצלחת.
  4. ביום 3, להוסיף 2 מ"ל של בידול בינוני #1 עם 5 μM IWR-1-אנדו כדי לקדם התרחבות של אבות לב.
  5. ביום 4, להחליף את המדיום עם 2 מ"ל של מדיום בידול פיברובלסט לב. יש להחליף במדיום טרי כל יומיים עד ליום ה-16.
  6. ביום 18, לנתק את התאים באמצעות 1 מ"ל של 10x טריפסין בכל באר של צלחת 6-well במשך 10 דקות ב 37 °C (37 °F).
  7. לשבש את שכבת התא ביסודיות ולהעביר את ההשעיה התא באמצעות מסננת תא 70 מיקרומטר בצינור חרוטי 50 מ"ל המכיל נפח שווה של מדיום DMEM / F12 בתוספת 5% FBS.
  8. קבע את מספר התא הניתן לקיום באמצעות 0.4% כחול טריפאן באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
  9. צנטריפוגה השעיית התא ב 300 x g במשך 5 דקות כדי לקבל גלולה.
  10. לציפוי מחדש הראשון, resuspend את גלולה התא בנפח מתאים של מדיום בידול צלחת בצפיפות התא (6 x 104 תאים / cm2) על צלחת מצופה 0.2% ג'לטין עד 90% confluency.
  11. לפצל את הצלחת ולשמור על פיברובלסטים לב ב DMEM / F12 רגיל עם 10% סרום על צלחות מצופות ג'לטין.

5. יציקה של תבניות microtissue לב וזריעת תאים

  1. ממיסים את האגרוז במיקרוגל בבקבוק זכוכית 100 מ"ל עד לרתיחה. מרססים את בקבוק האגרוז ומניחים אותו בארון הבטיחות הביולוגית. אפשר את האגרוז להתקרר במשך ~ 3 דקות.
  2. פיפטה 700 μL של אגרווז מותך בתבנית מיקרו סיליקון של 9 x 9 מערך. הימנעו מיצירת בועות בזמן ההזרמה.
  3. מניחים בזהירות את התבנית על גוש קרח מקורר מראש כדי להאיץ את ג'לציה agarose.
  4. ודא כי ברגע האגרוז הוא gelled, זה הופך שקוף. בזהירות להתכופף סביב הקצוות של המיקרו-עובש כדי לשחרר את העתק agarose. לאחר מכן, לקלף בעדינות את העותק המשוכפל מכל הצדדים כדי לנתק את העתק agarose מן הסיליקון מיקרו עובש.
  5. מעבירים את מגש המיקרוטיסו האגרוז המכיל 81 שקעים עגולים (קוטר 800 מיקרומטר; עומק 800 מיקרומטר) לצלחת סטרילית של 12 בארות.
  6. הוסף 2 מ"ל של PBS למגש microtissue agarose ולבדוק מתחת למיקרוסקופ עבור כל בועות לכודות או בארות בצורת לא סדירה.
  7. שקועים את מגש האגרוז ב 2 מ"ל 70% אתנול לילה, ואחריו טיפול UV בארון בטיחות ביולוגית במשך 1 שעות.
  8. לפני השימוש, להסיר את 70% אתנול ולשטוף פעמיים עם מים מזוקקים לשטוף סופי עם 2 מ"ל PBS.
  9. בצע טריפסין, נטרל וספור iPSC-CMs, iPSC-ECs ו- iPSC-CFs והנח את מתלי התאים בקרח.
  10. הסר את PBS מן הבאר ואת התא זריעת התא בזהירות מבלי לגעת בשקעים.
  11. בצינור חדש, ערבבו iPSC-CMs, iPSC-ECs ו-iPSC-CFs ביחס של 7:2:1, בהתאמה, כדי להשיג צפיפות תאים סופית של 106 תאים/מ"ל. צפיפות תאים גבוהה יותר תגרום למיקרוטיסות גדולות יותר.
    הערה: אין לחרוג מ- 2 x 106 תאים/מ"ל.
  12. בזהירות להוסיף את 200 μL של השעיית התא טיפהwise בתא הזריעה.
  13. אפשר לתאים להתיישב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO2 למשך 2 שעות.
  14. הוסף מדיום ייצור microtissue המקיף את עובש האגרוז רק כדי לכסות את פני השטח של החדר הפנימי.
  15. לאחר 24 שעות, התאים מרכיבים את עצמם וקומפסים באופן משמעותי בשקעים המעגליים. יש להחליף במדיום טרי כל יומיים לצורך תחזוקה.

6. קיבעון וחדירות של תאים ומיקרוטיסויות לבביות לחיסון

  1. עבור כל סוגי תאים בודדים, תרבית את התאים בנפרד על שקופיות תא מטריצת קרום מרתף בינוני או ג'לטין מצופה (כ 2.5-3 x 105 תאים / מ"ל). מיקרוטיסו לב ניתן לאסוף צינור חרוטי 15 מ"ל על ידי שטיפה בעדינות אותם מתוך השקועים המעגליים.
  2. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים או microtissues עם 1 מ"ל PBS; לאחר מכן, לתקן עם מאגר קיבעון המכיל 4.2% PFA במשך 20 דקות עבור שקופיות התא ו 1 שעה עבור microtissues בטמפרטורת החדר.
  3. שאפו את ה-PFA והוסיפו 1 מ"ל של פתרון חדירות (0.25% טריטון X-100 ב-PBS) למשך 5 עד 7 דקות לשקופיות תא ו-20 דקות למיקרוטיסו בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    הערה: משלב זה ואילך, ניתן לטלטל בעדינות את הדגימות על משטח נדנדה על ספסל.
  4. שאפו את התמיסה המחדירה ושטפו פעם אחת עם 2 עד 3 מ"ל של PBS.
  5. לדגור על התאים עם 500-1,000 μL של פתרון חסימה (2% עד 5% סרום עיזים רגיל או סרום חמור) לפחות 1 שעה עבור שקופיות התא ו 3 עד 4 שעות עבור microtissues.
  6. לדגור על התאים או microtissues לב עם נוגדנים מצומדים מוכנים בתמיסת החסימה מספיק כדי לכסות את המדגם. דגירה עם טרופונין-T אנטי לבבי (cTnT2) (1:50), אנטי CD31 (1:75), ואנטי DDR2 / Vimentin (1:50) עבור 1 שעות עבור שקופיות התא לילה ב 4 °C (4 °F ) עבור microtissues לב.
  7. לשטוף את שקופיות התא שלוש פעמים עם 500 μL 0.1% Tween-20 במשך 5 דקות בין כל לשטוף לשטוף סופי עם PBS.
  8. עבור microtissues הלב, לשטוף עם 2 מ"ל 0.1% Tween-20 חמש פעמים עם משך 20 דקות בין כל לשטוף. בצעו את שלב הכביסה הסופי למשך 20 דקות נוספות.
  9. לדגור על התאים או microtissues עם 4',6-diamidino-2-פנילינדולה (DAPI) (1 מיקרוגרם / מ"ל) לפני מיקרוסקופיה קונפוקלית.
  10. עבור microtissues לב, להעביר בזהירות לצלחת תחתונה זכוכית 35 מ"מ ולהוסיף PBS כדי להטביע microtissues.
  11. להדמיה תלת-ממדית, באמצעות המטרה טבילה בשמן 20x או 40x להשיג את המוקד המרכזי של microtissue ולהתאים פרמטרי חשיפה עבור כל פלואורופור.
  12. לקבלת Z-stack, הגדר קואורדינטות ראשונות ואחרונות במצב Live עם עומק הדמיה כולל של 100-200 מיקרומטר עם מרווח פרוסה של 5-10 מיקרומטר.

7. עיכול מיקרוטיסו לבבי והכנת תאים לציטומטריית זרימה

  1. כדי לעכל מיקרוטיסו, יש לשטוף בעדינות את המיקרוטיסו עם מדיום מס' 1 מהשקעים המעגליים באמצעות קצה פיפטה רחב של 1 מ"ל לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.
  2. אפשר microtissues להתיישב ולשאוף את המדיום בזהירות ולשטוף את התאים או microtissues עם 1 מ"ל PBS ולהוסיף 200-300 μL של חיץ עיכול אנזימים במשך 20 דקות ב 37 °C (37 °F). ב 10 דקות, מערבבים את microtissues בעדינות במשך 1 דקות ודגור שוב ב 37 °C (50 °F) למשך שארית הזמן.
  3. לאחר הדגירה, השתמש בקצה פיפטה רגיל של 1 מ"ל כדי לערבב את המיקרוטיסו במרץ כדי לקבל השעיית תא עכור.
  4. לאחר microtissues מתעכלים מספיק לתוך תאים בודדים, מיד לנטרל את ההשעיה התא עם 5 מ"ל של מדיום המכיל 5% FBS ומתח את ההשעיה התא באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר. ספור את המספר הכולל של תאים וצנטריפוגה השעיית התא הבודד ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F ).
  5. שאפו את supernatant ו resuspend 1 x 105-1 x 106 תאים ב 100 μL נספח מחייב חוצץ עם FITC Annexin V ו 100 מיקרוגרם / מ"ל פרופידיום יודיד (PI) או To-Pro3 צבע אי הכללת תאים מתים במשך 10 דקות על קרח.
  6. לאחר הדגירה, להוסיף 300 μL של מאגר איגוד annexin להשעיית התא ולעבור צינור FACS התחתון עגול לניתוח cytometry זרימה. השתמש בלייזרים ומסנני הפליטה הנכונים עבור הפלואורופורים הנבחרים.
  7. לכימות סמני פני התא באמצעות תאים קבועים, בצע את הקיבעון ואת permeabilization של גלולה התא כמתואר בשלבים 6.2 ו 6.3.
  8. לאחר permeabilization, לשטוף את גלולה התא ולדגור את התאים עם נוגדנים מצומדים בהתאמה במשך 1 שעות. לשטוף את גלולה התא במאגר FACS 4 מ"ל (2% FBS ב PBS) וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות. חזור על שלב הכביסה פעמיים.
  9. הזן מחדש את התאים במאגר FACS של 200-300 μL לניתוח ציטומטריית זרימה.
  10. התאם את תכונות הפיזור קדימה וצד עם מדגם לא מוכתם ושקל להשתמש בבקרת איזוטיפ עבור כל פלואורופור כדי להתאים את מתחי הלייזר. אסוף לפחות 20,000 אירועים לניתוח נתונים.

8. ביצוע ניתוחי התכווצות של מיקרוטיסים לבביים פועמים באופן ספונטני

  1. להקליט קטעי וידאו של microtissues לב כדי ללכוד לפחות שלוש פעימות. הגדר את רזולוציית ההקלטה ל- 1280 x 720 פיקסלים לפחות בקצב פריימים >30 פריימים לשניה ושמור את הווידאו ב- . פורמט AVI.
  2. הפעל את קובץ ה- Script של MotionGUI11 בסביבת MATLAB כדי להפעיל את ממשק המשתמש.
  3. מצא את . מיקום קובץ AVI בתיקיה שלך כדי לטעון את הווידאו. לאחר מכן, הזינו את קצב הפריימים שבו נלכד הווידאו בחלונית 'קלט'.
  4. בחלונית הקלט המתקדמת, ניתן לציין גודל פיקסל בהתבסס על הרזולוציה והגדלת הלכידה.
  5. ניתן לציין גודל פיקסל מקרובלוק מתאים (ברירת מחדל 16) ותנועת פיקסלים הניתנת לזיהוי בהתאם לעוצמת התכווצות המיקרו-טיס.
  6. לאחר התאמת הפרמטרים, לחץ על קבל וקטורים תנועה כדי להתחיל את הניתוח.
  7. בחר אזור מעניין באמצעות לחצן האפשרויות Choose AOI כדי לא לכלול אזורים המקיפים את המיקרו-טיס הבודד בשקע המעגלי.
  8. השתמש בפונקציה Map Time Ave כדי ליצור מפת חום התכווצות ממוצעת המבוססת על תנועה שזוהתה בצירי X ו- Y.
  9. לקבלת נתוני מעקב שיא, השתמש בפונקציה קבל נתוני התכווצות כדי למדוד באופן אוטומטי את פסגות ההתכווצות וההרפיה.
  10. במקרה של יחס אות לרעש נמוך, החל גובה שיא וסף מרחק כדי לפרט כראוי את מהירות ההתכווצות המרבית (נקודה כחולה) ואת מהירות ההרפיה המרבית (משולש אדום).
  11. לאחר הגדרת הסף הנכון, בחר נתח פסגות כדי להשיג את ערכי ההתכווצות וההרפיה עם קצב פעימה ומרווח פעימה.
  12. השג מדידות ממינימום של 25 מיקרוטיסות בודדות לניתוחים סטטיסטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון ציטומטריה חיסונית וזרימה של CMs, קרנות אלקטרוניות ומסמכי PDF שמקורם ב- IPSC
כדי ליצור מיקרוטיסויות לב המורכבות מ- iPSC-CMs, iPSC-ECs ו- iPSC-CFs, כל שלושת סוגי התאים מובחנים ומאופיינים בנפרד. בידול במבחנה של IPSCs ל- iPSC-CMs השתפר במהלך השנים האחרונות. עם זאת, התשואה והטוהר של iPSC-CMs שונים משורה לשורה. הפרוטוקול הנוכחי מניב מעל 75% iPSC-CMs טהורים שמתחילים באופן ספונטני להכות סביב היום 9 (איור 1A). צעדי טיהור נוספים מהיום 9 עד היום 14 יכולים לשפר את טוהר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי ליצור microtissues לב מ iPSC-CMs מובחנים מראש, iPSC-ECs, ו- iPSC-CFs, זה חיוני כדי להשיג תרבות טהורה מאוד לשליטה טובה יותר של מספרי תאים לאחר דחיסת תאים מעוכבים במגע בתוך microtissues הלב. לאחרונה, ג'אקומלי ואח'. al.18 הדגימו את הייצור של מיקרוטיסויות לב באמצעות iPSC-CMs, iPSC-ECs, ו- iPSC-CFs. מיקרוטיזות לב שנוצרו בשיטה המתוארת מורכבות מ- ~ 5,000 תאים (70% iPSC-CMs, 15% iPSC-ECs ו- 15% iPSC-CFs). בשיטה זו, הן קרדיומיוציטים והן תאי אנדותל היו מובחנים במשותף ואחריו הפרדה של אבות אנדותל באמצעות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. הוא מייסד שותף של Khloris Biosciences אבל אין לו אינטרסים מתחרים, כמו העבודה המוצגת כאן היא עצמאית לחלוטין. המחברים האחרים לא מדווחים על התנגשויות.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר אמנדה צ'ייס על המשוב המועיל שלה על כתב היד. תמיכה במימון ניתנה על ידי התוכנית לחקר מחלות הקשורות לטבק (TRDRP) של אוניברסיטת קליפורניה, T29FT0380 (D.T. ) ו 27IR-0012 (J.C.W.); איגוד הלב האמריקאי 20POST35210896 (H.K.) ו 17MERIT33610009 (J.C.W.); ומכוני הבריאות הלאומיים (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 ו- NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות 12 בארותפישר סיינטיפיק08-772-29
מיקרו-תבניות תלת מימדמיקרו-רקמות12-81 פורמט
6 בארות צלחותפישר סיינטיפיק08-772-1B
תמיסת שטיפה AutoMACSתרמו פישר סיינטיפיקNC9104697
תוסף B27 מינוס אינסוליןטכנולוגיות חייםA1895601
תוסף B27 בתוספת אינסוליןLife Technologies17504-044
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Matrigel, מטריצה מוסמכת hESCBD Biosciences354277
נוגדן Cardio T Troponin TMiltenyi130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeadsMiltenyi130-097-857
CD31 נוגדןMiltenyi130-110-670
CD31 מיקרו-חרוזיםMiltenyi130-091-935
CHIR-99021SelleckchemS2924
DDR2Santa Cruz Biotechnologysc-81707
ערכת אפופטוזיס של תאים מתים עם Annexin V FITC ו-PIThermo Fisher ScientificV13242
Dispase IMillipore Sigma4942086001
DMEM, גלוקוז גבוה (4.5 גרם/ליטר) ללא גלוטמין בינוני11960044
DMEM/F-12 בינוני בסיסיGibco11320033
תמיסת מלח פוספט בופר (DPBS) של Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיוםLife Technologies14190-136
EGM2 BulletKitLonzaCC-3124
בקר עוברי סרוםLife Technologies10437
ערכת פיברובלסטים ללא סרוםLifeLIne Cell TechnologyLS-1010
גלוקוז RPMI בינוניLife Technologies11879-020
סרום עיזיםLife Technologies16210-064
Human FGF-basicThermo Fisher Scientific13256029
אנושי VEGF-165PeproTech100-20
IWR-1-endoSelleckchemS7086
Liberase TLMillipore Sigma5401020001
LS מיון עמודותMiltenyi130-042-401
MACS BSA פתרון מלאיMiltenyi130-091-376
MACS מאגר שטיפהMiltenyi130-091-222
מפריד MidiMACSMiltenyi130-042-302
RPMIבינוני חיים טכנולוגיות11835055
SelleckchemS1067
TO-PRO 3תרמו פישר מדעיR37170
טריטון X-100Millipore סיגמאX100-100 מ"ל
TrypLE Select 10Xתרמו פישר וימנטין מדעיאדום
Alexa Fluor® 488-נוגדנים מצומדיםR& D מערכותIC2105G
ללא SB431542

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166(2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  5. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  6. Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
  7. Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
  8. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
  9. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  10. Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
  11. Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
  14. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  15. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
  18. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  19. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
  20. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  21. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  22. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  23. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  24. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  25. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
  26. Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64(2018).
  27. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
  28. Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
  29. Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
  30. McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
  31. Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948(2018).
  32. Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39(2021).
  33. Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886(2020).
  34. Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
  35. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108(2018).
  36. Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
  37. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
  38. Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA

מאמרים קשורים