זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.

Abstract

ההישגים הטכנולוגיים של ספקטרומטריית מסה (MS) מבוססי פרוטאומיקה כמותית פותחים אפיקים רבים שטרם התגלו לניתוח הפרוטאום העולמי של האורגניזם בתנאים משתנים. אסטרטגיה רבת עוצמה זו המיושמת על האינטראקציות של פתוגנים מיקרוביאליים עם המארח הרצוי מאפיינת באופן מקיף את שתי נקודות המבט כלפי זיהום. בזאת, זרימת העבודה מתארת כימות ללא תווית (LFQ) של ההדבקה של Cryptococcus neoformans, פתוגן תאי פטרייתי פטרייתי שהוא הסוכן הסיבתי של המחלה הקטלנית cryptococcosis, בנוכחות תאי מקרופאגים מונצחים. הפרוטוקול מפרט את טכניקות הכנת החלבון המתאימות הן לתאי פתוגן והן לתאי יונקים בניסוי אחד, וכתוצאה מכך הגשת פפטיד מתאימה לניתוח כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-MS/MS. האופי הגנרי בעל התפוקה הגבוהה של LFQ מאפשר מגוון דינמי רחב של זיהוי וכימות חלבונים, כמו גם יכולת העברה לכל הגדרת זיהום מארח-פתוגן, תוך שמירה על רגישות קיצונית. השיטה מותאמת לקטלוג פרופילי שפע חלבון נרחבים ובלתי משוחדים של פתוגן בתנאים של חיקוי זיהום. באופן ספציפי, השיטה המודגמת כאן מספקת מידע חיוני על C. neoformans pathogenesis, כגון ייצור חלבונים הדרושים לארסיות ומזהה חלבונים מארחים קריטיים המגיבים לפלישה מיקרוביאלית.

Introduction

השכיחות של זיהומים פטרייתיים פולשניים גדלה במידה ניכרת והיא מתואמת עם שיעורי תמותה גבוהים באופן בלתי מתקבל על הדעת, המדווחים בדרך כלל אצל אנשים עם נטייה אימונודפטית¹. Cryptococcus neoformans הוא פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי ידוע לשמצה המסוגל לשרוד תאיים בתוך תאי מקרופאג מארחים. התערבות פטרייתית לקויה גורמת להפצה פטרייתית וביטויים מסכני חיים של דלקת קרום המוח cryptococcal ודלקת קרום המוח^2,3. העלייה העולמית במעמד immunocompromised דרשה עלייה מקבילה בשימוש בחומרים נגד פטריות, שבו מינים פטרייתיים רבים, כולל C. neoformans, פיתחו יותר ויותר התנגדות כלפי^4,5,6. לכן, חובה ליישם טכנולוגיות חזקות ויעילות כדי לענות על שאלות ביולוגיות חיוניות לגבי תגובת ההגנה המארחת ופתוגנזה מיקרוביאלית.

העידן החדש של התקדמות טכנולוגית בספקטרומטריית מסה (MS), כולל יצירת צינורות חישוביים וביואינפורמטיים רבי עוצמה, מספק את הבסיס לחזון אינטגרטיבי לניתוח בקנה מידה גדול של מחקר^{מארח-פתוגן 7,8}. ניתוח פרוטאומי קונבנציונלי מונחה פתוגנזה בדרך כלל פרופילים ההשקפה של זיהום מנקודת המבט המארח או פתוגן, כולל מתודולוגיות מקיפות כגון פרופיל מתאם חלבון, כרומטוגרפיה זיקה בשילוב עם פרוטאומיקה, ו אינטראקציה⁹. חקירות על ארסיות של פתוגנים מסוכנים במערכת מארחת הן בעלות חשיבות קלינית עצומה; עם זאת, היישום של ניתוח פרספקטיבה כפולה בניסוי יחיד נחשב בעבר לבלתי ניתן להשגה. לדוגמה, נקודת המבט של הפתוגן כלפי זיהום הוא המום לעתים קרובות על ידי חלבונים מארחים בשפע מאוד וכתוצאה מכך רגישות מופחתת לגילוי של חלבונים פטרייתיים בשפע נמוך⁷. יתר על כן, מורכבות המדגם הגבוהה מזמינה מטרות רבות לחקור במערכת ניסיונית אחת ומוכיחה מאתגרת להבהיר מנגנוני פעולה לחלבון פתוגן ספציפי.

פרוטאומיקה מלמטה למעלה היא טכניקת MS פופולרית המאפשרת הכנת מדגם לניהול, שבה פפטידים נוצרים על ידי עיכול אנזימטי ספציפי לרצף ואחריו הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית, זיהוי וכימות על ידי MS^10,11. כאן, אנו מציגים שיטה המדגימה אסטרטגיית רכישה תלוית נתונים שמטרתה להשיג כיסוי לא משוחד של פרוטאום מבוסס זיהום או 'זיהום'. באופן ספציפי, כימות ללא תווית (LFQ) שופך את התלות בתוויות כימיות או מטבוליות לזיהוי חזק ומדויק של שינויים ברמת החלבון על פני פרוטאומים מרובים, הפחתת טיפול במדגם ועיבוד שלבים^12,13. יישום אוניברסלי זה חוקר חלבונים המיוצרים ברגע נתון בתוך תא ללא תלות בכל ייצור חלבון צפוי; לכן, תובנות חדשניות עשויות להתגלות כי הם קריטיים לזיהום.

זרימת העבודה המתוארת בזאת מותאמת במיוחד כדי לחקור שינויים ברמת החלבון של C. neoformans במהלך תנאי חיקוי זיהום עם תאים חיסוניים מארחים (איור 1). במקום להסתמך על בידוד והפרדה של סוגי תאים, גישה זו מחלצת את פרוטאום המארח והפתוגן יחד, ומשתמשת בהפרדה ביואינפורמטית באמצעות שני מסדי נתונים ספציפיים לאורגניזם כדי להבחין בין ייצור חלבונים ספציפי למינים. שיטה זו מציעה יתרונות עבור מספר בלתי מוגבל של דגימות להיות מעובד ללא שלבי הכנה יקרים במיוחד הדרושים במחקרי תיוג מבוססי איזוטופ או שבר. יתר על כן, זרימת עבודה זו תומכת בפרוטוקולי מיצוי חלבונים ממוטבים הניתנים להעברה למגוון רחב של פתוגנים פטרייתיים ובקטריאליים המסוגלים למקד ולהדביק תאים חיסוניים מארחים. בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר את השלבים להשלמת מיצוי חלבון לא משוחד ועיבוד מדגם לטרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה, ואחריו נתונים וניתוח סטטיסטי, המסוגלים לספק שפע של ידע בחלבונים פטרייתיים משמעותיים לזיהום בשילוב עם פרופיל מקיף של תגובת ההגנה המארחת.

Protocol

שורה מונצחת של מקרופאגים הנגזרים מעכברי BALB/c שימשו לפרוטוקול הבא שאושר על ידי פרוטוקול ניצול בעלי חיים 4193 של אוניברסיטת גואלף. יש לציין, זנים אחרים של עכברים או מקורות אחרים של תאים מונצחים ניתן להחיל על הפרוטוקול המתואר עם בדיקות מספיקות כדי לייעל את הפרמטרים המפורטים. הפרוטוקול הבא ינווט את השלבים המתחילים בבקבוקון קפוא של תאי מקרופאגים. התאים מאוחסנים ב-10% FBS (סרום שור עוברי), 1% ל-גלוטמין ו-5% תערובת עט/סטרפטומיצין (פניצילין-סטרפטומיצין) ל-DMEM (מדיום הנשר שעבר שינוי של דולבקו) ו-20% DMSO (דימתיל סולפוקסיד).

1. פולחן של ג. ניאופורמנס

1. באמצעות מניית גליצרול, פס wildtype C. neoformans זן (H99) על שמרים תמצית פפטון דקסטרוז (YPD) צלחת אגר לבודד מושבות בודדות.
2. דגירה לילה במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור סטטי.
3. בחר מושבה אחת של זן ותרבות wildtype C. neoformans ב 5 מ"ל של מרק YPD במבחנה 10 מ"ל כתרים רופף. בצע בהכפלה מרובעת.
4. דגירה לילה במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב 200 סל"ד.
5. למחרת תת תרבות כל תרבות לילה בדילול 1:100 לתוך מרק YPD 3 מ"ל.
6. מדידת ערכי צפיפות אופטית (OD_600nm)של תרבות פטרייתית כדי לקבוע את שלב אמצע יומן הרישום. בהתאם ספקטרופוטומטר, C. neoformans זן wildtype מגיע באמצע שלב יומן בדרך כלל בעקבות דגירה 6 עד 8 שעות ב- YPD עם ערכי OD_{כלליים 600nm} הנעים בין 1.0 ל 1.5.
7. ברגע שהתאים מגיעים לשלב אמצע היומן, קח aliquot 10 μL של השעיית תא פטרייתי לתוך צינור נקי 1.5 מ"ל microcentrifuge לדלל 1:100 מלוחים סטריליים 1x פוספט אגירה (PBS). לספור את מספר התאים באמצעות המוציטרומטר.

2. Culturing של תאי מקרופאג

הערה: ודא שסביבת העבודה מעוקרת לפני עבודת תרבות התאים.

1. הכנת מדיום תרבות התא
   1. מדיום עם תוספי אנטיביוטיקה: הוסיפו 10% FBS (סרום שור עוברי), 1% ל-גלוטמין ו-5% תערובת עט/סטרפטוצין (פניצילין-סטרפטומיצין) לתערובת DMEM (בינוני הנשר שעבר שינוי של Dulbecco). יש לסנן מדיום באמצעות מערכת סינון מלאה של 0.2 מיקרומטר ולאחסן ב-4°C.
   2. מדיום ללא אנטיביוטיקה: בצע פרוטוקול זהה אך להשמיט תערובת עט / סטרפטוקוקוס.
2. זריעת תאי מקרופאג'
   הערה: יש לחמם מדיום עם תוספי אנטיביוטיקה (2.1.1.) ל-37°C לפני עבודת תרבות התאים.
   1. להפשיר בקבוקון של תאי מקרופאג במהירות באמבט חרוזים 37 °C (60 °F).
   2. לשטוף תאים של פתרון הקפאה על ידי resuspending התאים במדיום 1 מ"ל תוספי אנטיביוטיקה.
      הערה: אמצעי זהירות נוספים נדרשים כדי להבטיח שהתאים לא יתפזרו עקב צנרת קשה.
   3. העבר תאים שעברו שימוש חוזר לצינור סטרילי של 15 מ"ל.
   4. כדורי תאים על ידי צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. הסר בזהירות על טבעי עם פיפטה סרולוגית או שאיפה ואקום.
   6. בעדינות resuspend גלולה ב 10 מ"ל של אנטיביוטיקה בתוספת בינונית.
   7. בעדינות פיפטה respended תאים לתוך 60 x 15 מ"מ תאים מטופלים צלחת.
   8. צלחת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ לילה.
3. מעבר ראשוני של תאי מקרופאג'
   הערה: מלאי תאים קפואים יכיל בדרך כלל בין 5 ל-10 מיליון תאים לכל בקבוקון (כ- 1 מ"ל). ביום שלאחר מכן, תאי מקרופאג ששרדו את פרוטוקול הזריעה ידבקו לתחתית צלחת תרבות התא ויהיו מוכנים לתזוזה.
   1. מדיום חם בתוספת אנטיביוטיקה (שלב 2.1.1) עד 37 מעלות צלזיוס לפני עבודת תרבות התא. ודא שסביבת העבודה מעוקרת לפני עבודת תרבות התאים. דמיינו תאים באמצעות מיקרוסקופ אור כדי להבטיח שהתאים דבקים ובריאים.
   2. הסר מדיום תרבות התא מן המנה או עם פיפטה סרולוגית או שאיפה ואקום.
   3. הוסיפו בעדינות 5-7 מ"ל של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר (מלוחים עם אגירת פוספט) לתבשיל 60 x 15 מ"מ.
   4. להטות בעדינות את המנה לשטוף תאים דבקים.
   5. הסר PBS באמצעות פיפטה סרולוגית או שאפתן ואקום.
   6. מוסיפים 1 מ"ל של PBS קר (מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס) לתאים, להטות את המנה כדי להפיץ PBS על כל התאים, ולאפשר לשבת בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות.
   7. שחרר תאים על ידי הקשה עדינה של המנה, pipeting PBS קר נגד התאים, או באמצעות מגרד תאים.
   8. מוסיפים 9 מ"ל של מדיום תוספי אנטיביוטיקה למנה.
   9. בצלחת חדשה של 60 x 15 מ"מ, הוסיפו 9 מ"ל של מדיום טרי בתוספת אנטיביוטיקה ו-1 מ"ל של תאים שעברו שימוש חוזר מהמנה המקורית.
   10. לאחר שמספר לוחות ההעברה הרצויים מולאו, ניתן להשליך תאים שעברו שימוש חוזר מהמנה המקורית.
   11. דגירה את המנה החדשה בהגדרות שהוזכרו לעיל (שלב 2.2.8).
   12. בצע את המעבר הבא כאשר התאים הגיעו 70-80% מפגש (בערך כל 2 ימים בהתאם לקו התא ובינוני בשימוש).
       הערה: יש להעביר תאי מקרופאג' לפחות חמש פעמים לפני ניסויי זיהום. בהתאם לקו התא, ניסויי זיהום צריכים להתבצע על ידי 25 עד 30 מעברים. לאחר 25 עד 30 מעברים, יש להקפיא או להשליך תאים. ניתן לבחור בסעיף 2.4 או 2.5 על סמך תוכניות הניסוי. סעיף 2.4 ישמש עבור הסעיפים הבאים.
4. זריעת תאי מקרופאג' לפני ההדבקה
   1. בצע את שלבי פרוטוקול המעבר 2.3.1 עד 2.3.7.
   2. שימוש בהמוציטרומטר או במונה תאים אוטומטי קובע את צפיפות התא (תאים/מ"ל).
   3. העבר 0.3 x 10⁶ תאי מקרופאג' לבאר אחת של לוח תרבות תאים של 6 בארות.
   4. התאם את הנפח הכולל של היטב ל 1 מ"ל באמצעות מדיום תוספי אנטיביוטיקה (שלב 2.1.1).
   5. חזור על שלבים 2.4.3 ו 2.4.4 עד 8 בארות מולאו (4 בארות מלאות בשתי צלחות נפרדות).
   6. באופן אופציונלי, מלאו את שתי הבארות הנותרות ב-1 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר כדי לשמור על רמות הלחות במהלך הדגירה.
   7. אפשר לתאים לגדול בתנאי דגירה המוזכרים בשלב 2.2.8 עבור 2 d לפני ההדבקה.
5. זריעת תאי מקרופאג' ביום ההדבקה
   1. בצע את שלבי פרוטוקול המעבר 2.3.1 עד 2.3.7.
   2. שימוש בהמוציטרומטר או במונה תאים אוטומטי קובע את צפיפות התא (תאים/מ"ל).
   3. זרע 1.2 x 10⁶ תאי מקרופאג לתוך באר אחת של צלחת תרבית תאים 6-well.
   4. התאם את הנפח הכולל של היטב ל 1 מ"ל באמצעות מדיום תוספי אנטיביוטיקה (2.1.1).
   5. חזור על 2.4.3 ו 2.4.4 עד 8 בארות מולאו (4 בארות מלאות בשתי צלחות נפרדות).
   6. באופן אופציונלי, מלאו את שתי הבארות הנותרות ב-1 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר כדי לשמור על רמות הלחות במהלך הדגירה.
   7. דגירה תאים בתנאים שהוזכרו בשלב 2.2.8 עבור 3 שעות כדי לאפשר לתאים לדבוק בארות.

3. זיהום של תאי מקרופאג' עם C. neoformans

הערה: עם ההגעה 70-80% מפגש, יהיו כ. 1.2 x 10⁶ תאי מקרופאג לכל באר. כדי להשיג את הריבוי הרצוי של זיהום (MOI) של 100:1, 1.2 x 10⁸ תאים פטרייתיים נדרשים עבור כל תגובה. תרבויות חייבות להיות מוגדרות בהתאם פי ארבעה ביולוגית.

כתב ויתור: MOI של 100:1 השיג תוצאות רצויות בקבוצת המחקר שלנו והוא נועד כהצעה לקוראים. ייתכן שיידרש MOI נמוך יותר עבור זנים זיהומיות יותר של C. neoformans או עבור קווי תאים מקרופאגים גמישים פחות. אימות של זיהום (סעיף 3.5) יכול לשמש כדי לקבוע את MOI האידיאלי עבור C. neoformans מסוים – שילובי מקרופאגים.

1. הכנת תאים פטרייתיים
   1. בצע את שלב 1 לצמיחה של C. neoformans לשלב אמצע יומן.
   2. לאסוף וצנטריפוגה תאים ב 1,500 x גרם במשך 10 דקות, בעדינות לשטוף גלולה עם PBS טמפרטורת החדר סטרילי, ולחזור על סך של שלוש שטיפות.
   3. Resuspend תאים במדיום תרבית תאים ללא אנטיביוטיקה (שלב 2.1.2) כדי להשיג ריכוז של 1.2 x 10⁸ תאים / מ"ל.
2. הכנת תאי מקרופאג'
   1. דמיינו כל באר בצלחת של 6 בארות כדי להבטיח שהתאים הגיעו ל-70-80% מפגש. לחלופין, ניתן למדוד תאים כדי להשיג כ. 1.2 x 10⁶ תאי מקרופאג ' לבאר.
   2. בצע את שלבים 2.3.1 עד 2.3.4.
3. תרבות משותפת של C. ניאופורמנים ותאי מקרופאג'
   1. הוסף 1 מ"ל של תאי C. neoformans שעברו שימוש חוזר (שלב 3.1.3) ל- 4 בארות המכילות תאי מקרופאג שהוכנו בסעיף 3.2.
      הערה: יהיה צורך לחשב את מספר הלוחיות הנדרש לפני תחילת הניסוי. הוסף 1 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה (שלב 2.1.2) לבארות ריקות.
   2. אפשר לתאים להדגיר בתנאים המפורטים (שלב 2.2.8) למשך 3 שעות.
   3. הסר מדיום תרבות התא מהצלחת או עם פיפטה סרולוגית או שאיפה ואקום.
   4. הוסיפו בעדינות 1 מ"ל של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.
   5. להטות בעדינות את הצלחת לשטוף תאים חוץ תאי C. neoformans שאינם מחוברים או שאינם phagocytosed.
   6. הסר PBS באמצעות פיפטה סרולוגית או שאיפה ואקום, לחזור על עצמו בסך הכל שלוש שטיפות. חזור על 3.3.4 עד 3.3.5 פעמים נוספות.
4. מקרופאגים לא מודבקים
   1. כמו כן, השתמש 4 בארות של צלחת 6 באר לשמש דגימות מקרופאג בלבד. הוסף 1 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה (שלב 2.1.2) לבארות אלה.
   2. חזור על שלבים 3.3.2 עד 3.3.6.
5. אימות זיהום
   הערה: באמצעות בדיקת ציטוקסיות, ניתן למדוד מיומנות זיהום. הפרוטוקול הבא ידגיש את היישום של מוצר cytotoxicity כדי למדוד LDH (לקטט דהידרוגנאז) לשחרר. ניתן להשתמש גם במוצרי ציטוקסיטיות אחרים.
   1. הכנת זיהום C. neoformans של תאי מקרופאג'
      1. חזרה על שלבים 1, 2 ו- 3 (עד 3.5). ניתן לבצע את מבחני LDH המשולשים, אם הם מועדפים.
      2. לאחר שלב 3.3.6, להוסיף 1 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה (2.1.2) לכל באר בצלחת 6-well.
      3. חזור על שלבים 2.4.3 ו- 2.4.4 עד 3 בארות בתוספת בארות 3n מולאו (כאשר n הוא מספר נקודות הזמן שנמדדו).
      4. דגירה תאים בתנאים המפורטים בשלב 2.2.8.
      5. בנקודות זמן נבחרות (לדוגמה, 1, 3, 6, 12 ו- 24 שעות) אוספים סופרנאטנט למדידת שחרור LDH בהתאם להוראות היצרן
      6. במקביל, תאי מקרופאג' לא מושפעים יועברו לערך שנקבע עבור ציטוטוקסיות מרבית.
      7. חשב ציטוקסיות באופן הבא:
         

4. אוסף לדוגמה

1. תרבות משותפת ואוסף מקרופאג' לא מודבק
   1. מוסיפים 1 מ"ל של PBS קר לתאים (מ 3.3.6 ו 3.4.2) ולאפשר לשבת בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות.
   2. שחרר תאים מהצלחת על ידי הקשה עדינה של הצלחת או צינור עדין PBS קר נגד התאים.
      הערה: מגרד תאים יש להימנע כמו זה יכול לגרום תמוגה של תאים.
   3. פיפטה הכניסה תאים לצינור של 15 מ"ל.
   4. תאי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant.
   5. לעבד תאים (כמפורט בשלב 5) מיד או פלאש קפוא חנקן נוזלי ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר.

5. פרוטאום תאי

הערה: יש למטב תמוגה מספקת עבור סוג התא שנותח (כלומר, כמות המחזורים והמאטורות תלויה בגודל גלולת התא ובאחוז הכוח של דגם סוניקטור בדיקה).

1. תמוגה נגועה של תאי מקרופאג'
   1. Resuspend תאים כדוריים (שלב 4.1.5) ב 300 μL של 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) המורכב טבלית קוקטייל מעכב פרוטאז מומס טרי.
      הערה: טבלית קוקטייל מעכב פרוטאז אחת מתווספת ל-10 מ"ל של קר כקרח 100 מ"מ טריס-HCl (pH 8.5) לפני תחילת הניסוי.
   2. בדיקה sonicate תאים באמבט קרח במשך 15 מחזורים של 30 s על ו 30 s כבוי, כדי lyse התאים.
   3. תאי צנטריפוגה לזמן קצר במשך 30 s ב 400 x גרם, נזהר לא ליצור גלולה, רק כדי להסיר נוזל בצדי צינורות ואחריו העברת מדגם צינור 2 מ"ל Lo-bind microcentrifuge.
   4. הוסף 1:10 נפח של 20% SDS לריכוז הסופי של 2%.
   5. הוסף 1:100 נפח של 1 M dithiothreitol (DTT) לריכוז הסופי של 10 מ"מ ומערבבים את המדגם ביסודיות על ידי pipetting, ואחריו דגירה על בלוק חימום תרמי ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 800 סל"ד נסער. לאחר מכן, קריר לטמפרטורת החדר (קירור יכול להיעשות על קרח).
   6. הוסף 1:10 נפח של 0.55 M iodoacetamide (IAA) כדי לקבל ריכוז סופי של 55 מ"מ ולערבב את המדגם ביסודיות על ידי pipetting. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 20 דקות.
   7. הוסף 100% אצטון כדי לקבל ריכוז סופי של 80% אצטון ולאחסן מדגם לילה ב -20 מעלות צלזיוס כדי לזרז חלבונים.
2. עיכול חלבונים
   1. למחרת, לאסוף את גלולת משקעים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10,000 x g ו 4 מעלות צלזיוס. להשליך supernatant ולשטוף גלולה עם 500 μL של 80% אצטון. חוזרים על הפעולה במשך שתי שטיפות בסך הכל. גלולה יבשה אוויר בטמפרטורת החדר לאחר שטיפות.
   2. Resolubilize גלולת חלבון ב 100 μL של 8 M אוריאה / 40 מ"מ HEPES, כדי להבטיח solubilization מלא, מערבולת או sonicate באמבט מי קרח במשך 15 מחזורים של 30 s על ו 30 s off.
      הערה: התאמת נפח אוריאה / HEPES נקבעת על גודל גלולת תא מזרז, אם שינויים מתרחשים כל אמצעי האחסון במורד הזרם חייב להיות מותאם כראוי.
   3. לכמת את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון (למשל, בדיקת חלבון BCA) בהתאם להוראות היצרן ולהתאים למדידת רקע על ידי נורמליזציה ריקה עם 8 M אוריאה/40 מ"מ HEPES.
   4. הוסף 300 μL של 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט כדי לקבל ריכוז סופי של 2 M אוריאה.
      הערה: הזדמנות לנרמל את ריכוז החלבון למדידות במורד הזרם, הציע לעכל 100 מיקרוגרם של חלבון ולאחסן את המדגם הנותר מעוכל על ידי הקפאת פלאש בחנקן נוזלי ואז לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס לטווח קצר, או ב -80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך יותר.
   5. הוסיפו 2:50 (v/w) יחס אנזים לחלבון של תערובת פרוטאז טריפסין/ליס-C על קרח והקש בעדינות על הצינור כדי לערבב, דגירה לילה בטמפרטורת החדר.
   6. לאחר הדגירה, להפסיק את העיכול על ידי הוספת 1:10 נפח עצירת פתרון (20% אצטוניטריל, 6% חומצה trifluoroacetic) ודגימות צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   7. לאסוף supernatant (מורכב פפטידים מתעכלים) ולזרוק כל פסולת כדורית או משקעים.
3. התפלת פפטיד
   1. הפעל C18 עצור וללכת חילוץ (STAGE) עצה (המורכב 3 שכבות שרף C18 ב 200 טיפ פיפטה μL) על ידי הוספת 100 μL של 100% אצטוניטריל וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 2 דקות.
   2. השווה את קצה שלב C18 על ידי הוספת 50 μL של חוצץ B (80% (v / v) אצטוניטריל, 0.5% (v / v) חומצה אצטית) וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 2 דקות.
   3. השווה את קצה שלב C18 על ידי הוספת 200 μL של חוצץ A (2% (v / v) אצטוניטריל, 0.1% (v / v) חומצה trifluoroacetic, 0.5% (v / v) חומצה אצטית) וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 3-5 דקות.
   4. הוסף ~ 50 מיקרוגרם של מדגם מתעכל על קצה שלב C18 וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 3-5 דקות, או עד המדגם עבר דרך עמודת ספין. פלאש להקפיא את המדגם המתעכל הנותר בחנקן נוזלי ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס, עד הצורך.
   5. לשטוף את קצה שלב C18 עם 200 μL של חוצץ A וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 3-5 דקות.
   6. הוסף 50 μL מאגר B לקצה שלב C18 וצנטריפוגה ב 500 x g במשך 2 דקות. לאסוף פפטידים eluted בצינורות PCR 0.2 מ"ל.
   7. יבש את הפפטידים המרופטים בצנטריפוגה ואקום במשך 30-40 דקות במהירות מקסימלית. דגימות מיובשות לחלוטין ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר או ב -20 מעלות צלזיוס עד מעובד.
      הערה: פפטידים מיובשים ומותפלים הם הגשות מדגם מתאימות למתקני ספקטרומטריית מסה לעיבוד וניתן לשלוח אותם בטמפרטורת הסביבה.

6. ספקטרומטריית מסה

1. לשקם פפטידים ב 10 μL מאגר A ולמדוד את הריכוז הדרוש כדי להזריק ~ 1.5 כדי 3 פפטידים מיקרוגרם על עמודה MS. כמות הדגימה תהיה תלויה במכשור.
2. השתמש הדרגתי שנקבע מראש של אצטוניטריל (כ. 5-60%) ב 0.5% חומצה אצטית על פני הזמן הרצוי (למשל, 2 שעות) כדי להפריד פפטידים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, ואחריו יינון electrospray לתוך ספקטרומטר המסה.
3. השג סריקות MS באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה במצב רכישה תלוי נתונים (m/z 300 עד 1650).
   הערה: אחוז ואורך הדרגתי נקבעים על-ידי הניסוי והמשתמש. הגדרות ספקטרומטר מסה מדויקות תלויות במכשור, בניסוי ובהעדפת המשתמש.

7. ניתוח נתונים

הערה: ניתן לעבד נתוני MS עם צינורות ביואינפורמטיקה רבים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים עיבוד באמצעות הפלטפורמות הזמינות לציבור של MaxQuant ו- Perseus, אך ממליצים למשתמשים בודדים להעריך כלים ביואינפורמטיים המתאימים לניתוח, להעדפה ולשימוש.

1. טען קבצי נתונים לא מעובדים (ישירות ממכשיר MS) באמצעות תוכנת MaxQuant. זהה חלבונים תחת פרמטרי החיפוש של MaxQuant ששונו; מינימום של שני פפטידים ייחודיים הדרושים לזיהוי חלבונים באמצעות גישת פיתיון יעד לשיעור גילוי כוזב של 1%, ליישם כימות ללא תווית עם התאמה בין ריצות, לשלב את האורגניזמים קובץ FASTA המתקבל ממסד הנתונים UniProt (כלומר, Cryptococcus neoformans H99, שרירים) כדי לזהות ולכמת פפטידים הנוכחי עם מנוע החיפוש אנדרומדה. התייעץ עם כלים מקוונים ציבוריים של MaxQuant לקבלת הדרכות מפורטות (ראה טבלת חומרים).
2. העלה את קובץ הפלט MaxQuant ('קבוצות חלבונים.txt') לתוך פרסאוס.
3. סנן שורות המכילות תוצאות חיוביות ומזהמים פוטנציאליים כוזבים, וכן השתנה רק על-ידי פפטידים של אתר באמצעות 'סנן שורות בהתבסס על עמודה קטגורית'.
4. המר ערכי נתונים בסולם יומן_{רישום 2.}
5. צור קבוצות ערכה של נתונים על-ידי מתן ביאור קטגורי לשורות.
6. סנן ערכת נתונים לפי ערכים חוקיים כדי להגדיר ניתוק לגילוי חלבונים.
   הערה: לניתוח מחמיר וחזק מוצע שיעור זיהוי של >50%. לדוגמה, אם עובדו ארבעה שכפולים, ייבחר מספר מינימלי של שלושה ערכים חוקיים.
7. אם הדבר עדיף, הקבץ נתונים על-ידי החלפת ערכים חסרים בהתפלגות הנורמלית.
   הערה: ערכים לא מזוהים ממוטבים על בסיס התפלגות רגילה ומספקים עוצמת LFQ אקראית להחלפת מצייני מיקום 'NaN' כדי לדמות מדידות שפע טיפוסיות. אימפוטציה זו מספקת פלטפורמה לניתוח סטטיסטי במורד הזרם הדורש נתונים הניתנים לכימות.
8. הוסף ביאורים לשורות החלבון (למשל שמות חלבונים, מונחים אונטולוגיים של גנים).
   הערה: זרימת עבודה זו של פרסאוס שנוצרה היא כעת מסגרת איתנה לעיבוד ביואינפורמטי נוסף, ניתוח סטטיסטי ופריטים חזותיים של נתונים, עיין בכלים המקוונים הציבוריים של פרסאוס לקבלת הדרכות מפורטות (ראה טבלת חומרים).

Results

הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר זיהוי וכימות של חלבונים הנגזרים הן מהפתוגן הפטריוני, C. neoformansוהן מהמארח, תאי מקרופאג', בניסוי אחד. בעקבות תרבות משותפת, תאים נאספים ומעובדים יחד ומופרדים ביו-אינפורמטית בהתבסס על פרופילי פפטיד ספציפיים לכל מין. זוהי גישה רבת עוצמה להגדרת יחסי הגומלין של יחסי המארח-פתוגן במהלך ההדבקה. מספר החלבונים שזוהו מהניסוי תלוי בחומר ההתחלתי, בהכנת הדגימה, באורך השיפוע, במכשור טרשת נפוצה ובזרימת עבודה ביואינפורמטית. באמצעות הפרוטוקול המתואר בזאת, אנו מזהים בדרך כלל כ- 8,000 חלבונים מהניסוי ע...

Discussion

השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים הכנת תאי מקרופאג ואיסוף דגימות תרבות משותפת לעיבוד חלבונים עם הפרעה מינימלית לתאים. חשוב לבצע שלבים של כביסה, מחוסן והסרה של תאי מקרופאגים חסידים בעדינות ובזהירות כדי למנוע תמוגה מיותרת של תאים לפני האיסוף. הקמת MOI הנכון עבור הניסוי הוא גם קריטי כמו מחוסן עם MOI גבוה מדי יכול לגרום מוות תאי מקרופאג מהיר וקושי באיסוף ועיבוד דגימות עבור MS. לעומת זאת, מספרי MOI נמוכים יובילו פחות תאים פטרייתיים phagocytosed וזיהוי מוגבל של חלבונים פטרייתיים במערכת הביולוגית. כדי להתגבר על מגבלות כאלה, אנו ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 מ"מ Tris-HCl, pH 8.5	Fisher Scientific	BP152-1	שמור על 4°
C 60 x 15 מ"מ צלחת, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
צלחת תרבית תאים 6 בארות	ThermoFisher Scientific	140675
אצטוניטריל, MS כיתה	פירס	TS-51101
חומצה אצטית	סיגמא אולדריץ'	1099510001
אצטון	סיגמא אולדריץ'	34850-1L
אמוניום ביקרבונט (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	הכן תמיסת ABC מלאי של 50 מ"מ, יציבה בטמפרטורת החדר עד חודש.
בל-ארט אנד טרייד; מערכת איסוף שואב ואקום HiFlow	Fisher Scientific	13-717-300	לא חיוני, ניתן להשתמש בפיפטות סרולוגיות להסרת מדיה.
שרף C18	3M Empore	3M2215
מגרדי תאים	VWR	10062-906	לא חיוני, ניתן להשתמש בשיטות אחרות לשחרור תאי מקרופאגים.
רכז ואקום צנטריפוגלי	Eppendorf	07-748-15
יחידת סינון מלאה	VWR	10040-436
צינורות בז חרוטי (15 מ"ל)	Fisher Scientific	05-539-12
Countess II מונה תאים אוטומטי	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	לא חיוני, המוציטומטר יכול לשמש כחלופה.
CytoTox 96 בדיקת ציטוטוקסיות לא רדיואקטיבית	Promega	G1780
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	הכן תמיסת מלאי בתפזורת של 1 M DTT, הקפאה בזק ומאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד השימוש. יש להשליך לאחר כל שימוש (אין להקפיא-להפשיר שוב ושוב).
DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10566016
סרום בקר עוברי (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	השבתת חום על ידי דגירה ב-60° C למשך 30 דקות. הכן 50 מ"ל אליקוטים והקפאת בזק. הפשרה לפני הכנת מדיה
Haemocytometer	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	הכן 40 מ"מ HEPES/8 M אוריאה בתמיסת מלאי בתפזורת, הקפאת פלאש, אחסון ב-20° C עד השימוש. יש להשליך לאחר כל שימוש (אין להקפיא-להפשיר שוב ושוב).
מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים	ThermoFisher Scientific	LC140	אורך שיפוע מבוסס על מורכבות הדגימה, שיפוע מומלץ של 120 דקות לדגימות זיהום.
ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה	ThermoFisher Scientific	726042
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	הכן תמיסת מלאי בתפזורת 0.55 M, הקפאת בזק, אחסון ב-20° C עד השימוש. יש להשליך לאחר כל שימוש (אין להקפיא-להפשיר שוב ושוב).
L-גלוטמין	ThermoFisher Scientific	25030081	ניתן להקפיא ולהקפיא לאחסון. הפשרה לפני ההכנה לתקשורת.
צינורות מיקרוצנטריפוגה LoBind	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant היא פלטפורמה ציבורית המציעה הדרכות, כגון בית הספר הקיץ של MaxQuant, המתאר את שלבי הניתוח החישובי של מערכי נתונים גדולים של MS
Microcentrifuge	Eppendorf	13864457
פניצילין: Streptomycin 10k/10k	VWR	CA12001-692	ניתן להקפיא ולהקפיא לאחסון. הפשרה לפני ההכנה לתקשורת.
עמודות הפרדת פפטידים	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus Software	http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline	VWR	CA12001-676	Puchase אינו נדרש. ניתן להכין גם PBS אך יש לבצע סינון סטרילי לפני השימוש.
בדיקת חלבון BCA פירס	ThermoFisher Scientific	23225
פיפטה, סרולוגית חד פעמית (10 מ"ל)	פיפטה פישר סיינטיפיק	13-678-11E
, סרולוגית חד פעמית (25 מ"ל) Basix	Fisher Scientific	14955235
Probe sonciator	ThermoFisher Scientific	100-132-894
טבלית קוקטייל מעכב פרוטאז	Roche	4693159001
נתרן דודציל סולפט	ThermoFisher Scientific	28364	20% (w/v)
ספקטרופוטומטר (Nanodrop)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE צנטריפוגה	הטיה Sonation	STC-V2
שייקר תרמי	VWR	NO89232-908
חומצה טריפלואורואצטית	ThermoFisher Scientific	85183
תערובת פרוטאז טריפסין/Lys-C, פירס		A40007	שמור על -20 מעלות צלזיוס.
אמבט אולטרסאונד	Bransonic	A89375-450	מאוחסן בחדר קירור (4C)
אוריאה	סיגמא אולדריץ'	U1250-1KG	הכן 40 מ"מ HEPES/8 M אוריאה בתמיסת מלאי בתפזורת, הקפאת פלאש, אחסון ב-20 מעלות; C עד השימוש. יש להשליך לאחר כל שימוש (אין להקפיא-להפשיר שוב ושוב).
תמצית שמרים פפטון דקסטרוז מרק BD	Difco	BM20