נויטרונים קריסטלוגרפיה איסוף ועיבוד נתונים למידול אטומי מימן במבני חלבון

Summary

קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים היא טכניקה מבנית המאפשרת לוקליזציה של אטומי מימן, ובכך מספקת פרטים מכניים חשובים של תפקוד החלבון. אנו מציגים כאן את זרימת העבודה להרכבה של גבישי חלבון, איסוף נתוני עקיפה של נויטרונים, עידון מבנה וניתוח של מפות צפיפות אורך הפיזור של הנויטרונים.

Abstract

קריסטלוגרפיה של נויטרונים היא טכניקה מבנית המאפשרת קביעת עמדות אטום מימן בתוך מקרומולקולות ביולוגיות, מניבה מידע חשוב מבחינה מכנית על מצבי פרוטוניציה והידרציה מבלי לגרום לנזק לקרינה. עקיפה של קרני רנטגן, לעומת זאת, מספקת מידע מוגבל בלבד על מיקום אטומי האור וקרן הרנטגן גורמת במהירות לנזקי קרינה של קופקטורים רגישים לאור ומרכזי מתכת. מוצג כאן הוא זרימת העבודה המועסקת עבור קורות IMAGINE ו MaNDi במעבדה הלאומית Oak Ridge (ORNL) כדי לקבל מבנה עקיפה נויטרונים לאחר גבישי חלבון בגודל מתאים (> 0.1 מ"^מ3) גדל. אנו מדגימים הרכבה של גבישי חלבון מוקשים בני נימי קוורץ לאיסוף נתוני עקיפה של נויטרונים. כמו כן מוצג תהליך החלפת האדים של גבישים רכובים עם חיץ המכיל _D2O כדי להבטיח החלפה של אטומי מימן באתרים הניתנים להחלפה עם דיטריום. שילוב של דיטריום מפחית את הרקע הנובע מפיזור לא ברור של אטומי מימן ומונע ביטול צפיפות שנגרם על ידי אורך הפיזור השלילי שלהם קוהרנטי. יישור מדגם ואסטרטגיות איסוף נתוני טמפרטורת החדר מודגמים באמצעות איסוף נתונים מעין-לאואה ב- IMAGINE בכור האיזוטופים בשטף הגבוה (HFIR). יתר על כן, הרכבה גבישית ומקפיא מהיר בחנקן נוזלי לאיסוף נתוני קריו כדי ללכוד מתווכים תגובת מעבדה מודגמת במכשיר זמן הטיסה של MaNDi במקור הנויטרונים של Spallation (SNS). הכנת קבצי נתוני קואורדינטות עקיפה ודיקור המודל והדמיה של מפות צפיפות אורך פיזור הנויטרונים (SLD) יטופלו גם הם. עידון מבנה נגד נתוני נויטרונים בלבד או נגד נתוני רנטגן/נויטרונים משותפים כדי להשיג מבנה אטום של חלבון העניין יידונו סוף סוף. תהליך קביעת מבנה נויטרונים יודגם באמצעות גבישים של lytic פוליסכריד monooxygenase Neurospora crassa LPMO9D, מטאלופרוטאין המכיל נחושת המעורב בהשפלה של פוליסכרידים סרבנים באמצעות מחשוף חמצוני של הקשר הגליקוזידי.

Introduction

קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית של נויטרונים היא טכניקה המספקת חלון ייחודי למבנה ולכימיה הבסיסית של חלבונים. בדומה מבחינה רעיונית עקיפה של קרני רנטגן, עקיפה נויטרונית מספקת פרטים אטומיים של מבנה מקרומולקולרי, עם זאת, האינטראקציה של נייטרונים עם גרעינים מאפשרת לוקליזציה של אטומי אור, לעתים קרובות קשה לזהות עם עקיפה קרני ^רנטגן1. במהלך עקיפה של קרני רנטגן, קרני רנטגן מתפזרות מענן האלקטרונים, מה שהופך אטומי אור כגון מימן (H) לעין בצורה גרועה במפות צפיפות אלקטרונים שאין להן רזולוציה של תת-אנגסטרום2. לעומת זאת, עוצמת הפיזור של נייטרונים תלויה באינטראקציות מורכבות עם הגרעין, כאשר איזוטופים של אותו אלמנט מציגים אורכי פיזור שונים. לכן, אטומי אור ואיזוטופים שלהם, כגון מימן (^1H) ודיוטריום (^2H או D), יש ראות דומה פחמן עמוד השדרה, חנקן ואטומי חמצן במפות צפיפות אורך פיזור נויטרונים (SLD). יתר על כן, מאז סדר הגודל של פיזור נויטרונים אינו תלוי במספר האלקטרונים, פיזור מיסודות אור אינו מוסתר על ידי אלמנטים כבדים כאשר הם נמצאים קרוב זה לזה, כפי שנצפו בפיזור קרני רנטגן. הנראות המשופרת של H והאיזוטופ D שלה בעת שימוש עקיפה נויטרונית מספקת מידע רב ערך על מצב הפרוטוניציה של שאריות, קופקטורים וליגנדים חשובים מבחינה קטליטית ומסייעת לכיוון של מולקולות מים, וחושף מידע חשוב על מנגנונים קטליטיים וכימיה של ^{חלבונים3}. עקיפה של נויטרונים מציעה גם את היתרון בלהיות טכניקה לא הרסנית, המתאימה במיוחד לדגימות ביולוגיות רגישות ליינון כגון חלבונים עם מרכזי מתכת או קופקטורים אדומים רגישים ^לאור2. המוקד העיקרי של מאמר זה הוא לספק סקירה כללית של זרימת העבודה כדי להשיג מבנה גביש חלבון נויטרונים באיכות גבוהה. אנו מפנים את הקורא המעוניין לפודג'ארני ואח '⁴, ^{בלייקלי5}, בלייקלי ואח ' ⁶ ו- O'Dell et ^{al.3 לקבלת} סקירה מצוינת של עקיפה של חלבון נויטרונים ואשקר ואח '⁷ ליישומים נוספים של פיזור נויטרונים.

נייטרונים נוצרים בעיקר במהלך תגובות גרעיניות תוך שימוש באחד משני תהליכים: ביקוע גרעיני במקורות הכור או התכתשות במקורות מבוססי ^מאיץ8. מקורות הכור מספקים קרן נויטרונים רציפה על ידי שימוש ביקוע גרעיני של איזוטופ ^235U בעוד מקורות נויטרונים spallation לייצר קרן נויטרונים פעמו על ידי הפצצת מטרה, למשל מתכת נוזלית כגון כספית, עם ^{פרוטונים9}. המעבדה הלאומית אוק רידג' (ORNL) באוק רידג', טנסי, מארחת הן מקור נויטרונים במצב יציב בכור האיזוטופ בשטף הגבוה (HFIR) והן מקור פעמו של 60 הרץ במקור הנויטרונים של ספאליציה (SNS). קו הקרן IMAGINE, הממוקם ב- HFIR, הוא דיפרקטומטר נויטרונים המותאם למקרומולקולים ביולוגיים (איור 1)¹⁰. IMAGINE משתמשת בגלאי לוחיות תמונה נויטרונים כדי למדוד נתוני מעין-לאואה באמצעות פס צר בטווח של 2.8 – 4.5 Å מגבישים בודדים עם קצוות תא יחידה <150 Å. דיפרקטומטר נויטרונים (MaNDi) הוא דיפרקטומטר נויטרונים (באנגלית: Macromolecular) הוא דיפרקטומטר נויטרונים של לאואה (TOF) המצויד במסגרת מערך גלאי כדורי (DAF) (איור 2)¹¹. MaNDi מודד נתונים מגבישים בודדים עם קצוות תא יחידה בטווח של 10 - 300 Å על ידי שימוש 2 Å-אורך גל רוחב פס בין 2.0 - 6.0 ^Å12.

תהליך יצירת הנויטרונים הוא עתיר אנרגיה, וכתוצאה מכך שטפי קרן נויטרונים חלשים יחסית כאשר הם מנוגדים לשטף קרן הרנטגן במקורות ^{סינכרוטרון13}. כדי להבטיח יחסי אות לרעש מספיקים במהלך איסוף נתונים, יש צורך לגדל גבישים בגודל ובאיכות ^{מתאימים14}. בדרך כלל, גבישים עם נפחים > 0.1 ^mm3 נדרשים כדי לאסוף נתונים עם סטטיסטיקה ^נאותה15. בנוסף לשטף נמוך יותר, יש לקחת בחשבון תכונות אינהרנטיות של האינטראקציה בין נייטרונים לבין גרעיני ^המדגם16. אורך הפיזור של נייטרונים שונה עבור איזוטופים של אותו אלמנט, מאפיין אשר ניתן לנצל ביתרון בפיזור נייטרונים בזווית קטנה (SANS) כדי להסוות או להדגיש אזורים של מדגם - תהליך המכונה התאמת ^{ניגודיות17}. בניסויי עקיפה, אורך פיזור הנויטרונים השלילי קוהרנטי של H (-3.741 fm עבור ^1H) יכול להוביל לביטול תכונות מפת פיזור הנויטרונים מאז אורך פיזור הנויטרונים קוהרנטי של אטומים רלוונטיים ביולוגית אחרים, כולל פחמן (6.6511 fm עבור ^12C), חנקן (9.37 fm עבור ^14N), חמצן (5.803 fm עבור ^16O), זרחן (5.13 fm עבור ^31P) וגופרית (2.804 fm עבור ^32S), הם חיוביים (טבלה 1)^12,14. יתר על כן, אורך הפיזור הגדול והמבולבל של H (25.274 fm), מגביר את הרקע במהלך איסוף הנתונים, פוגע באיכות ערכת הנתונים ומפגע ברזולוציית ^{הנתונים7}. כדי לעקוף את המגבלות הללו שהוכנסו על ידי H יש צורך, עבור עקיפה נייטרונית, להחליף H עבור דיוטריום איזוטופ שלה, ^2H(D), אשר יש אורך פיזור נויטרונים קוהרנטי חיובי (6.671 fm) ואורך פיזור מבולבל נמוך משמעותית (4.04 fm)¹⁹. זה יכול להיות מושגת על ידי perdeuteration, תהליך שבו החלבון בא לידי ביטוי על ידי אורגניזמים גדלים במדיה deuterated לחלוטין להבטיח שילוב מלא של D באתרי ^H20. ניתן גם תיופח חלקית חלבון על ידי החלפת H עם D אך ורק באתרים הניתנים להחלפה (קבוצות titratable) בעוד האתרים שאינם ניתנים להחלפה פחמן מחויבים להישאר ^מוקשה21. זה יכול להיות מושגת על ידי צמיחה של גבישי חלבון מוקשה ליקר אמא ^deuterated22. עם זאת, בדרך כלל, חילופי H/D של חלבונים מוקשים מבוצעים על ידי חילופי אדים בעקבות צמיחה של גבישים גדולים כראוי ב- _{buffer23 מבוסס H2O}. במקרים כאלה, גבישים מותקנים נימי קוורץ אדים-equilibed עם ליקר אם מבוסס _D20.

שטפי הנויטרונים המוגבלים במקורות נויטרונים גורמים לזמנים ארוכים יותר של איסוף נתונים, החל מימים ועד מספר ^{שבועות24}. ב- ORNL, IMAGINE ו- MaNDi משתמשים במעבר פסים צר אורך גל בטווח 2-6 Å כדי לייעל את איסוף ^{הנתונים25}. ניתן לאסוף נתונים בטמפרטורת החדר או בטמפרטורת ההקפאה. איסוף נתוני Cryo יכול לשפר את איכות הנתונים ולפתוח את האפשרות ללכידת זרזים להקפאה. לאחר איסוף נתוני עקיפה של נויטרונים, ערכת נתונים של קרני רנטגן נאספה בדרך כלל על אותה גביש באותה טמפרטורה או על גבישי שגדל בתנאים ^זהים26. איסוף נתונים באותה טמפרטורה מאפשר לבצע עידון מבנה הן מול נתוני רנטגן והן מול נתוני נויטרונים, ומונע חפצים פוטנציאליים הנגרמים על ידי טמפרטורה כגון שינויים בנראות ובמיקום המים או תפוסת שאריות עם קונפורמציות ^{חלופיות27}. עידון נתוני נויטרונים של קרני רנטגן משותפות מגדיל את יחס הנתונים לפרמטר ומספק את היתרון של מתן אפשרות לעידון קואורדינטות עמוד השדרה של החלבון מול נתוני הרנטגן, בעוד נתוני עקיפה של הנויטרונים משמשים כדי לחדד את המיקום של אטומי H/^D28. זה שימושי במיוחד בעת שימוש בדגימות מפורקות חלקית, שבו ביטול צפיפות עקב אטומי H באתרים שאינם ניתנים להחלפה על החלבון קיים. למרות שמספר מבני הרנטגן עולה בהרבה על מספר מבני הנויטרונים שהופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB), חבילות תוכנה שתוכננו בתחילה לעידון נתוני רנטגן הורחבו כך שיכלול נתוני נויטרונים וכן ^3,29,30. לאחר איסוף נתונים, ניתן למקד דגמים באמצעות חבילות עידון כגון phenix.refine, CNSsolve (nCNS) או SHELXL28,31,32,33. במהלך תהליך הזיכוך, ניתן לדמיין מפות צפיפות פיזור נויטרונים להתאמה ידנית באמצעות ^COOT34. פתרון המבנה הבא, ניתן להגיש ל- PDB את הקואורדינטות ואת קבצי נתוני עקיפה של נויטרונים ו/או רנטגן, אשר יאמת ויפקיד את הדגם, מה שהופך אותו לזמין לגישה ציבורית18,29,30.

ניתוח מבני של חלבונים הוא גישה רבת פנים שבה טכניקות רבות משמשות לבדיקת תפקודם ומנגנון ³⁵. קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים מספקת תובנות כימיות חשובות כדי להרחיב ולהשלים ממצאים ממחקרים נוספים כגון עקיפה של קרני רנטגן, ספקטרוסקופיה, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) או עקיפה של אלקטרונים מיקרו קריסטליים (microED)³⁶. עקיפה של חלבון נויטרונים ממוקמת באופן ייחודי כדי לספק תובנות על מנגנונים אנזימטיים, שכן אטומי H הם מרכזיים בכימיה שלהם. היעדר נזקי קרינה הנגרמים על ידי נייטרונים להפוך אותם בדיקה מתאימה במיוחד לחקר metalloproteins37. אנו מציגים כאן דוגמה מייצגת לתהליך עקיפה של חלבון נויטרונים מהכנת מדגם ועד איסוף נתונים, עידון וניתוח נתונים (איור 1). גבישים בגודל מספיק לניסויי עקיפה של נויטרונים גדלו של מטאלופרוטאין נוירוספורה גסה LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D הוא מטאלופרוטאין המכיל נחושת המעורב בהשפלת תאית סרבן על ידי החדרת אטום חמצן בקשר הגליקוזידי38,39. האתר הפעיל NcLPMO9D מכיל מרכז נחושת מונונוקלארי בתוך "סד היסטידין" אופייני המורכב מהיסטידין N-terminal והיסטידין שמור שני (איור משלים 3)⁴⁰. N-מסוף של LPMOs פטרייתי הוא מתיל אבל השינוי שלאחר המעבר אינו מתרחש במהלך ביטוי רקומביננטי בשמרים. במצב המנוחה NcLPMO9D, מרכז הנחושת נמצא במצב חמצון ^Cu2+ ומופעל על ידי הפחתת אלקטרון יחיד ל- ^Cu1+, ומאפשר לחמצן מולקולרי להיקשר ולהיות מופעל על ידי הפחתתו במהירות למין סופראוקסיד41,42. התגובה הכוללת NcLPMO9D דורש תוספת נוספת של אלקטרון אחד ושני פרוטונים כדי ליצור את המוצר פוליסכריד הידרוקסילאט43. זהותם של מיני החמצן הפעיל האחראים להפשטת אטום המימן (HAA) ממצע הפוליסכריד לא זוהתה ומחקרים מבניים וחישוביים אינטנסיביים נמשכים כיום ^44,45. בהתחשב בכימיה redox באתר הפעיל NcLPMO9D, הקלה של נזק קרינה היא רלוונטית במיוחד. אנו ממחישים כאן טמפרטורת החדר ואיסוף נתונים בטמפרטורת הקפאה על גבישי NcLPMO9D כדי לקבוע את מבנה NcLPMO9D במצב המנוחה ובצורה המופחתת המופעלת, בהתאמה ⁴⁶. יינתן דגש על הרכבה על גבישי חלבון, התקנת מכשיר קו קרן לאיסוף נתונים, הכנת הנתונים ותיאורת קבצים ושלבי העידון הדרושים למידול מבנה נויטרונים אטום.

Protocol

1. הערכת גודל קריסטל

1. מדוד את גודל הגבישים באמצעות מיקרוסקופ המצויד באור רגיל ומקוטב. בחר גבישים בנפח מינימלי של ~0.1 ^mm3 (איור משלים 4).
2. סמן בארות עם גבישים גדולים מספיק ושים לב לתנאי ההתגבשות המשמשים ליצירת גבישים אלה.

2. הכנת מאגר התגבשות מפורז

1. להמיס רכיבי חיץ התגבשות ב- _D2O כדי ליצור חיץ התגבשות מפורק.
2. התאם את ה- pH של המאגר על-ידי חישוב ה- pD של הפתרון באמצעות המשוואה הבאה:
   (1)
   שבו _pHmeas הוא pH נמדד עם אלקטרודה זכוכית סטנדרטית. ה- pH המקורי של מאגר התגבשות NcLPMO9D היה 6.0, ולכן נשתמש ב- _pHmeas של 5.6 עבור חיץ התגבשות נטוש ב- pD 6.0.
3. יש לטבול את האלקטרודה של מד ה-pH _ב-D2O למשך עשר דקות לפני השימוש (איור 5 משלים).
4. התאימו את _ה-pHmeas ל-5.6 באמצעות בסיס NaOD או חומצה DCl.

3. קצירת קריסטל

1. מניחים מגלשות זכוכית עגולות מסיליקון 22 מ"מ ליד מגש ההתגבשות שממנו ייקצרו גבישים. השתמשו במגלשת זכוכית נקייה לכל גביש (איור 2A).
2. פתחו את קופסת הכריכים האטומה המכילה את גבישי החלבון בצלחת זכוכית מסיליקון בעלת נפח 9.
3. הסר 10-20 μL מפתרון מאגר התגבשות עם מיקרופיט והנח את הפתרון על שקופית הזכוכית (איור 2B).
4. קציר את הגביש באמצעות מיקרולופ בגודל מתאים והנח את הגביש בירידה בתמיסת מאגר המים על שקופית הזכוכית כדי להסיר פסולת שנקטפת לעתים קרובות יחד עם הגביש (איור 2C ואיור 2D).
   הערה: יהיה צורך לעבוד במהירות מאז טיפות נפח קטן עשוי להתאדות. גבישים שנקטפו נמצאים גם הם בסיכון להתייבש כאשר הם נחשפים לאטמוספירה. ייתכן שיהיה צורך להוסיף פתרון מאגר כלשהו לירידה בחלבון כדי למנוע גבישים להתייבש בנפחי טיפת התגבשות קטנים.

4. הרכבה על קריסטל

הערה: פרוטוקולי הרכבה נימיים משתנים בהתאם להעדפות ניסיוניות. כדי למנוע נזק גבישים, נימים שיש לקצר צריך להיות ציון עם אבן חיתוך או נייר זכוכית כדי להבטיח הפסקה חלקה.

1. מלא קצה אחד של נימי קוורץ באורך 2 מ"מ באורך 50 מ"מ עם מאגר מאגר על ידי פעולה נימית או על ידי צנרת ישירה ~ 10 μL של מאגר לתוך נימי (איור 3A).
   הערה: משתמשים מוזמנים לעשות שימוש צינורות נימים קוורץ כי, בנוסף לחוזק המכני שלה, זה חיוני כדי להגביל את ספיגת קרן נויטרונים ותרומות רקע נמוכות יותר מן נימי. נימי זכוכית מציגים רקע גבוה וסופגים נייטרונים, ומתפשרים על איכות הנתונים.
2. הניחו בעדינות את הגביש במאגר נימי הקוורץ באמצעות לולאת ההרכבה (איור 3B ואיור 3C).
3. הקש בעדינות על הצינור כדי להזיז את מאגר המאגר ואת הגביש השקוע בו במורד הנימי (איור 3D).
4. מניחים את הגביש לא קרוב יותר מ 13.5 מ"מ ולא עוד 27.5 מ"מ מקצה אחד של נימי; זה יהיה הקצה הרכבה (איור 6 משלים).
5. שאפו את תמסת החיץ סביב הגביש בעזרת קצה פיפטה דק וארוך, והותירו את הגביש מעט רטוב. אין לגעת בגביש (איור 7A משלים).
6. יבשו את הקירות הנימיים עם פתיל נייר דק (איור משלים 7B).
7. Pipette 20-50 μL של פתרון חיץ מפורק לסוף הנימי מול קצה ההרכבה (איור 4A).
8. ממיסים שעוות דבורים עם "שרביט" חום ומכניסים בעדינות את הנימיים לשעוות דבורים מומסות אלה. חוזרים על הפעולה עד שנוצר אטם אטום (איור 4B ואיור 4C).
9. Pipette כמות קטנה מאוד של חוצץ deuterated, כ 5 μL בקצה הרכבה של נימי לשמש "כיור חום" עבור שעוות דבורים חם. טובלים את הקצה הזה בשעוות דבורים מומסות כדי ליצור אטם אטום כפי שתואר קודם לכן כדי ליצור נימי אטום בשני הקצוות (איור 4D).
10. בדקו את הגביש הרכוב באמצעות מיקרוסקופ לאחר ההרכבה כדי להבטיח אטום (איור 4E).
11. אבטחו בקפידה את הגבישים המותקנים עם מגבוני קים במיכל כמו שפופרת פלקון בנפח 15 מ"ל או צלחת פטרי, ואחסנו אופקית בטמפרטורה שבה גדלו הגבישים (איור 4F).

5. חילופי אדים

1. החלף את המאגר המנוטרלים במאגר טרי יומיים לאחר הרכבת הגביש.
2. ממיסים את חותם השעווה הכי רחוק מהגביסטל עם לולאת חימום, והשתמשו בצינור ופתילות נייר כדי להסיר את החיץ.
3. למלא את נימי עם 20-50 μL של פתרון חוצץ deuterated ולאטום עם שעווה.
4. חזור על החלפת המאגר המנוטרלים פעמיים נוספות במרווחי זמן של ארבעה ימים כדי להבטיח שהחלפת אדי מאגר מפורקת תושלם ולאפשר החלפת אדים למשך שבועיים לפחות.

6. עקיפה של חלבון נויטרונים

הערה: קוראים המעוניינים בפרטי קו הקרן IMAGINE מוזמנים להתייעץ עם מאיר ואח ' 2013, מאיר ואח '^201810,47.

1. איסוף נתוני טמפרטורת החדר בקו הקרן IMAGINE ב- HFIR
   1. טעינה לדוגמה
      1. אבטחו את הגביש הרכוב על נימי על גוניומטר עם מרק.
      2. הר את גוניומטר על מקל המדגם ומרכז את הגביש בקורה באמצעות תחנת היישור החוץ-קו.
      3. אבטחו את מקל המדגם בשלב דגימת המכשיר (איור 1B משלים).
      4. ודא שהכלוב הניסיוני פונה ופתח את תריס קו הקרן לאיסוף נתוני נויטרונים.
   2. איסוף נתונים
      1. פתח את תוכנית רכישת הנתונים במחשב בקרת קו הקרן ולחץ על הכרטיסיה התקנה כדי להגדיר את אסטרטגיית איסוף הנתונים. תחת פרמטרי ניסוי הקלד את שם המדגם לצד שם לדוגמה והזן את מספר ההצעה לצד הצעה. תחת מתן שמות לתמונות בחר תבנית תיקיה והגדר את היעד עבור הנתונים שנרכשו יישמרו ובחר קידומת תמונה והקלד שם מסגרת רלוונטי (איור 8 משלים).
      2. פתח את ה- GUI של אופטיקה ולחץ על 2.78 עבור _λmin ו - 4.78 עבור _λmax כדי להגדיר את טווח מעין-לאואה לאיסוף נתונים (איור 9 משלים).
      3. עבור לכרטיסיה איסוף ותחת פרמטרי הסריקה הבאה הוסף את זמן החשיפה בשניות תחת חשיפה, את מספר המסגרות תחת N Frames ואת הזוויות לאיסוף נתונים תחת Δ φ/Frame. תן שם למסגרת לאיסוף תחת קידומת תמונה וייזום איסוף הנתונים על-ידי לחיצה על לחצן התחל סריקה (איור 10 משלים).
      4. הנויטרונים המפוזרים יזוהו ע"י גלאי לוחית התמונה. בסוף כל חשיפה, לוחית התמונה תיקרא והתבנית המוצגת ב- GUI של רכישת הנתונים (איור 11 משלים).
      5. המסגרות כלולות באינדקס, משולבות, מנורמלות את אורך הגל ומורחבות באמצעות Lauegen, ^Lscale50 וסקאלה על ידי מדען קו הקורה האחראי, שיספק למשתמש את קובץ ההשתקפות הממוזג לאחר איסוף הנתונים (איור 12 משלים).
         הערה: איסוף נתונים הן ב- IMAGINE והן ב- MaNDi יבוצע במצב מעין-לאואה, תוך שימוש במתודולוגיה ובתוכנה שפותחו עבור איסוף נתוני עקיפה של לאואה כפי שפותחו על ידי הליוול ואח ' ⁴⁸ ו- Nieh et ^al.49.
      6. אסוף ערכת נתונים תואמת של קרני רנטגן על אותו גביש באותה טמפרטורה בעקבות איסוף נתוני עקיפה של נויטרונים (איור 13 משלים).
         הערה: גביש שגדל מאותה טיפה או תחת אותם תנאי התגבשות יכול לשמש גם לאיסוף נתוני עקיפה של קרני רנטגן לעידון נויטרונים/קרני רנטגן משותפים.
2. איסוף נתוני קריו בקו הקרן של MaNDi ב- SNS
   הערה: קוראים המעוניינים בפרטי קו הקרן מוזמנים להתייעץ עם קוטס ואח ' (2015), Meilleur ואח '^201810,11.
   1. טעינה לדוגמה
      1. הכן את פתרון השריית אסקורבאט מפורק להפחתת הגבישים ואת cryoprotectant deuterated. מניחים 20 טיפות μL של כל אחד מהפתרונות האלה לתוך בארות טיפה יושבות בצלחת התגבשות.
         הערה: הפתרון cryoprotectant הוא בדרך כלל cryoprotectant שהוכח כיעיל עבור איסוף נתוני עקיפה של קרני רנטגן בטמפרטורת קריו שהוכן ב- _D2O. זה cryoprotectant יכול להיות ממוטב עוד יותר (למשל ריכוז) עבור איסוף נתונים נויטרונים במידת הצורך.
      2. בחר לולאות להרכבה לדוגמה וצרף אותן לבסיס קריו מגנטי בהתאם להנחיות MaNDi (איור 14 משלים).
      3. מלאו קריו-דיואר מוקצף בחנקן נוזלי. מניחים שרוול מתכת להגנה מפני הקפאה בתוך החנקן הנוזלי להתקרר (איור משלים 15A).
      4. הסר את תקעי השעווה משני קצות נימי והקש על נימי כדי להזיז את תקע המאגר כך הגביש רכוב שקוע במאגר. לשטוף את הגביש לתוך 20 μL פתרון פתרון טיפה טיפה בישיבה היטב (איור משלים 15B ו איור משלים 15C).
         הערה: שלב זה אינו נדרש אם חילופי H/D בוצעו על ידי שפל של טיפות התגבשות נגד חוצץ deuterated או על ידי השריה ישירה של הגביש במאגר deuterated.
      5. טובלים את הגביש בתמיסת ההשריה של אסקורבאט במשך שעתיים. הר את הגביש במיקרולופ המחובר לבסיס קריו מגנטי. טובלים את הגביש הרכוב בקריו-הגנה למשך 10 שניות ומכניסים את הגביש וההרכבה להקפאה (איור 15D משלים).
      6. לאחר הקריסטל קפוא, להשתמש מלקחיים סיכת קריו מקורר מראש ולהרכיב את הגביש על שלב מדגם MaNDi מצויד זרם הקפאה. פתחו בעדינות את מלקח סיכת ההקפאה וודאו שהקריסטל נשאר בזרם ההקפאה (איור משלים 2C).
   2. איסוף נתונים
      1. פתח את תוכנת איסוף הנתונים שבה מידע הניסוי יאוכלס באופן אוטומטי.
      2. לחץ על מרכז הגביש כדי למרכז אותו עם גוניומטר הנשלט על ידי המחשב (איור 16 משלים).
      3. תחת טבלה, הגדר את אסטרטגיית איסוף הנתונים על-ידי הזנת הזוויות לאיסוף נתונים תחת "phi" וכן את החשיפה הכוללת של קרן הנויטרונים למסגרת תחת Value (איור 17 משלים).
      4. לחץ על שלח כדי להתחיל באיסוף נתונים.
      5. ככל שהנתונים יאספו, הנויטרונים המפוזרים יהיו גלויים (איור 17 משלים). כתמי עקיפה יתבהרו ככל שזמן החשיפה יגדל, ויעלה את יחס האות לרעש (איור 5).
      6. מסגרות יהיו באינדקס, משולבות, אורך גל מנורמלות ומורחבות באמצעות Mantid ו- Lauenorm על ידי מדען קו הקורה האחראי, שיספק למשתמש את קובץ האינטנסיביות הממוזגת לאחר איסוף ^{הנתונים51}.

7. עידון מבנה

1. עידון נתוני רנטגן וניוטרונים משותף
   1. הכנת מבנה
      1. לחדד את נתוני הרנטגן כדי לקבל מבנה חלבון באמצעות חבילת התוכנה phenix.refine ו Coot לבנייה ידנית כדי להשיג מבנה הושלם.
      2. פתח את המק"ס4 ובחר את תוכנית הממיר/שנה/הרחבת MTZ כדי להתאים את דגלי הנתונים נטולי ה-R של נתוני הנויטרונים לאלה של נתוני הרנטגן. בחר כדי לייבא את קובץ ההשתקפות בתבנית MTZ . תחת ב - להעלות את קובץ MTZ נויטרונים המתקבל ולהעלות את קובץ mtz רנטגן תחת ייבוא FreeR MTZ (איור 18 משלים). תן שם לקובץ ה- MTZ החדש תחת החוצה ולחץ על הפעל.
      3. פתח את חבילת התוכנה Phenix ולחץ על ReadySet תחת כלי עידון. לצד קובץ PDB להעלות את קובץ קואורדינטות PDB מעודן נגד נתוני רנטגן. בחר כדי להוסיף מימנים לדגם אם הם נעדרים ובחרו H/D באתרים הניתנים להחלפה, H במקום אחר מהתפריט הנפתח. בחרו ' הוסף דיטריום למולקולות ממסים ' והותיר את האפשרויות הנותרות בערכי ברירת המחדל שלהם (איור משלים 19A).
         הערה: אם נעשה שימוש בחלבון שבוצע, בחר באפשרות הוסף מימנים לדגם אם הוא נעדר ובחר H/D באתרים הניתנים להחלפה, D במקום אחר.
   2. עידון מבנה
      1. פתח את תוכנית phenix.refine תחת הכרטיסייה עידון כדי להגדיר את הזיכוך באמצעות נתוני רנטגן וניוטרונים. בכרטיסיה קביעת תצורה בקבצי קלט הזן את קובץ ה- PDB ממבנה הרנטגן שעובד עם ReadySet וקובץ הריסון של CIF הדרוש עבור כל ליגנד רלוונטי. העלה את קובץ ה- MTZ מנתוני הנויטרונים עם דגלי Rfree שהוקצו באמצעות CCP4 והקצה אותו כ"נתוני נויטרונים " ו- "Neutron R-free" תחת הכותרת סוג נתונים. העלה את קובץ ה- MTZ מנתוני הרנטגן והקצה אותו כ-"נתוני רנטגן" ו-"רנטגן R-free" תחת הכותרת סוג נתונים. הקבוצה 'חלל' ותוויות נתונים יאוכלסו אוטומטית לאחר העלאת הנתונים (איור 19B משלים).
         הערה: בעת ביצוע השיפור והקלטת מידע הקריסטל, השתמש בתא היחידה שנקבע מנתוני הרנטגן.
      2. תחת הכרטיסיה קביעת תצורה בהגדרות השיפור שמור על אסטרטגיית השיפור הסטנדרטית. הגדל את מספר המחזורים לחמישה (איור 20 משלים)
      3. בחר את כל הפרמטרים, לחץ על מתקדם ובחר מימנים.... שנה את מודל עידון המימן ליחיד וכבה את ה-Force ride adp (איור 20 משלים).
      4. בחר את כל הפרמטרים ופתח את האפשרות פרמטרי חיפוש . חפשו את המילה גרעיני ובחרו להשתמש במרחקים הגרעיניים עבור X-H/D (איור 20 משלים).
      5. בחר הפעל כדי לאתחל את השיפור.
   3. בניית מודל
      1. לאחר הזיכוך ב- Phenix, לחץ על פתח בכוס בכרטיסיה תוצאות כדי לדמיין את צפיפות האלקטרונים של קרני הרנטגן ומפות SLD נויטרונים. לחץ על הכרטיסיה מנהל תצוגה ותחת מפות לחץ על מחק מפה לצד מפות _neutron כדי להסיר את מפות הנויטרונים (איור 21 משלים). לחץ על קובץ > פתוח MTZ, mmCIF fcf או phs.... בחר את קבצי השיפור הנוכחיים ופתח את קובץ ה- .mtz הן באפשרות משרעת והן עבור שלבים, בחרו בנתונים WT_no_fill_neutron 2FOFC מהתפריט הנפתח. חזור על פעולה זו ופתח את נתוני WT_neutron _FOFC. פתח את מנהל התצוגה ועבור לגלול הן עבור מפות הנויטרונים והן עבור מפות רנטגן 2FOFCWT ולאחר מכן גלול כדי להקטין את rmsd של מפות 2FOFCWT ל- 1.00 (איור משלים 21). עבור/י לגלול הן עבור מפות הנויטרונים והן עבור מפות הרנטגן _FOFCWT וגלול כדי להקטין את ה- rmsd של מפות _FOFCWT ל- 3.00.
      2. בצע בדיקה חזותית של השאריות כדי לקבוע אם המודל מתאים לנתונים. קבע את הכיוון הנכון ואת תפוסת ה- H/D של כל האתרים הניתנים להחלפה על-ידי ניתוח פסגות מפת צפיפות ההבדלים. זה כולל את קבוצות הידרוקסיל של סרינים, threonines ו טירוצינים; החנקן של היסטידין, גלוטמין, אספרגין וליסין; סולפיהידיל של ציסטאין; קבוצות קרבוקסיל של אספרטט וגלוטמט; קבוצות עמוד השדרה; ליגנדים; קופקטורים ושאריות פונקציונליות פוטנציאליות (איור 6).
      3. כוון מחדש מולקולות מים בהתאם לצפיפות הנויטרונים ולאינטראקציות קשר מימן על-ידי סיבובן באמצעות התכונה 'אזור תרגום סיבוב/שרשרת/מולקולה ' (איור משלים 22A ודמות משלימה 22B). התאם מיקומים של שאריות חלבון שאתרים הניתנים להחלפה באמצעות הכלי עריכת זוויות צ'י והתכונה 'סובב אזור תרגום/שרשרת/מולקולה ' (איור משלים 22C ואיור משלים 22D).
2. עידון מבנה – עידון נתוני נויטרונים בלבד
   1. הכנת מבנה
      1. פתח את פניקס ובחר "תחליף מולקולרי" ובחר "Phaser-MR (בהשתתפות מלאה)" כדי להפיק את השלב של עוצמות קנה המידה המסופקות על ידי מדען המכשיר על ידי החלפה מולקולרית כדי ליצור קובץ קואורדינטות מתחיל בפורמט pdb. הזן את מבנה ה- pdb ההתחלתי בכרטיסיה "קלט ואפשרויות כלליות והשלם את האפשרויות הרכבים, תוכן ASU ושגרת חיפוש .
      2. פתחו כלי מודל ובחרו 'כלי PDB'. הוסף את קובץ ה- pdb כקובץ הקלט. נווט לכרטיסיה אפשרויות ותחת הסר בחירת אטום בחר את שמות הממס, ה- ligands, קופקטורים ומתכות. זה מסיר את כל מולקולות המים, קופקטורים, ליגנדים ויוני מתכת כדי ליצור מודל מינימלי. בנוסף, בחר כדי להסיר קונפורמרים חלופיים מהמודל (איור 23 משלים).
      3. בחר עידון ב- Phenix ופתח את ReadySet. הזן את קובץ הקואורדינטות pdb הערוך לצד קובץ PDB. בחר כדי להוסיף מימנים לדגם אם הם נעדרים ובחרו H/D באתרים הניתנים להחלפה, H במקום אחר מהתפריט הנפתח של אפשרויות עידון נויטרונים (איור 23 משלים).
   2. עידון מבנה
      1. פתח את תוכנית phenix.refine תחת הכרטיסייה עידון ב פניקס. בכרטיסיה קביעת תצורה הזן את קובץ PDB אשר עובד עם ReadySet תחת התיבה קבצי קלט . בתיבה קבצי קלט להעלות את קובץ MTZ מנתוני הנויטרונים ולהקצות זה כנתוני רנטגן ורנטגן R-חינם תחת העמודה סוג נתונים למרות שזה נתוני נויטרונים. תצורת השיפור שהוגדרה בשלב הבא תשמש לטיפול בקובץ ההשתקפות כאל נתוני נויטרונים. הקבוצה 'חלל' ותוויות הנתונים יאוכלסו באופן אוטומטי לאחר העלאת הנתונים (איור 24A משלים).
      2. תחת הכרטיסיה קביעת תצורה בהגדרות השיפור שמור על אסטרטגיית השיפור הסטנדרטית. הגדל את מספר המחזורים לחמישה. תחת אפשרויות אחרות בחר נייטרונים מהתפריט הנפתח של טבלת הפיזור . בטלו את הבחירה באפשרות לעדכון מים (איור 24B משלים).
      3. בחר את כל הפרמטרים>הידרוגנים>הידרוגנים. בחלון החדש בחרו ' פרט' מהתפריט הנפתח 'דגם מימן עידון ' וכבו את ה-Adp לרכיבה על 'כוח' (איור 20 משלים).
      4. בחירת כל הפרמטרים > פרמטרי חיפוש... אפשרות. חפשו את המילה גרעיני ובחרו להשתמש במרחקים הגרעיניים עבור X-H/D (איור 20 משלים).
      5. בחר כדי להפעיל כדי לאתחל את השיפור.
         הערה: לאחר הזיכוך הראשוני, יהיה צורך לבדוק חזותית את מפות הנויטרונים SLD ולבצע בניית מודל ידני בכוס. ייתכן שיהיה צורך להכניס ליגנדים/קופקטורים הנמצאים במודל. שיפורים הבאים ידרשו את קובץ הריסון CIF הדרוש עבור כל ליגנדים רלוונטיים ואלה יש להעלות בכרטיסיה קביעת תצורה של phenix.refine.
   3. בניית מודל
      1. לאחר עידון פניקס, לחץ על פתח בכוס בלשונית תוצאות כדי לדמיין את מפות SLD נויטרונים ומבנה. לחץ על הכרטיסייה מנהל תצוגה ותחת מפות לחץ על מחק מפה כדי למחוק הן את מפות 2FOFCWT והן את מפות _FOFCWT (איור משלים 25). לחץ על קובץ > פתוח MTZ, mmCIF fcf או phs .... בחר את תיקיית השיפור הנוכחית ובחר את קובץ ה- .mtz הן באפשרות משרעת והן עבור שלבים, בחרו בנתונים WT_no_fill 2FOFC מהתפריט הנפתח. חזור על הפעולה על-ידי לחיצה על קובץ > פתוח MTZ, mmCIF fcf או phs... ובחר את נתוני FOFCWT מהתפריט הנפתח הן עבור משרעת והן עבור שלבים. פתח את מנהל התצוגה ועבור לגלול עבור המפה WT_no_fill 2FOFC ולאחר מכן גלול כדי להקטין את rmsd של הנתונים WT_no_fill _2FOFC ל- 1.00 (איור משלים 25). עבור למצב גלול עבור מפת _FOFCWT וגלול כדי להקטין את rmsd של נתוני _FOFCWT ל- 3.00.
      2. בצע בדיקה חזותית של מבנה החלבון כדי לקבוע אם המודל מתאים למפת הנויטרונים SLD.
      3. כמתואר ב - 7.1.3.2, לקבוע את הכיוון הנכון ואת התפוסה H / D של שאריות וקבוצות עם אתרי H / D להחלפה. התאם מיקומי שאריות בעזרת הכלי סובב תרגום וערוך זוויות צ'י (איור 6). במידת הצורך, ניתן להשתמש באזור זיקוק החלל האמיתי . תקן אטומי D המתפוצצים מהשאריות באופן ידני באמצעות עורך הטקסט כדי להוסיף את קואורדינטות האטום הנכונות
         הערה: אזור זיקוק החלל האמיתי אינו ממוטב למפות נויטרונים SLD בכוס ועלול לגרום לאורכים לא סדירים של קשר עבור אטומים הקשורים ל- D, המכונים שאריות מתפוצצות (איור 26 משלים). עדיף לערוך באופן ידני את הקואורדינטות האטומיות הדרושות ולהימנע משימוש באזור זיקוק החלל האמיתי.
      4. הכנס וכוון מחדש מולקולות מים בהתאם לצפיפות הנויטרונים. להוספת מים ב-Coot בחרו בסמל 'מקם אטום במצביע ' ובחרו להכניס מולקולת מים (איור 27A משלים). קוט יוסיף אטום O במיקום זה כברירת מחדל.
      5. כדי להוסיף אטומי D אטומי O של מים מוכנס כיתנים להשתמש Phenix. פתח את תפריט עידון ולחץ על ReadySet. לצד אפשרויות עידון נויטרונים בחר רק את האפשרות להוסיף דיטריום למולקולות ממס. בטלו את הבחירה בהוספת מימנים לדגם אם הם נעדרים (איור משלים 27B ודמות משלימה 27C).
         הערה: בניית מודל באמצעות נתונים נויטרונים בלבד שונה מבניית מודל של מבנה רנטגן / נויטרונים משותף מכיוון שאין נתוני רנטגן לתרום לעידון הקואורדינטות של עמוד השדרה ואטומים כבדים יותר. בעידון משותף, מפת צפיפות האלקטרונים משמשת בתחילה לקביעת קואורדינטות עמוד השדרה של החלבון וציר הצד. מודל זה משמש לאחר מכן בשיפור נתוני רנטגן/נויטרונים משותפים שבהם הכיוון והתפוסה של אטומי H/D נגזרים ממפת הנייטרונים SLD. בשיפור נויטרונים בלבד, המבנה כולו נגזר מניתוח מפות הנייטרונים SLD, הדורשות בניית מולקולות מים, עמוד שדרה, שרשראות צד וליגנדים בנוסף לאטומים H/D (איור 6). יחס הנתונים לפרמטר נמוך בשיפורים מול נתוני נויטרונים בלבד ויש לנקוט זהירות שלא להתאים את הנתונים יתר על המידה.

Results

נתוני עקיפה של נויטרונים על גבישים של מונואוקסיגנאז פוליסכריד ליטיקי מ- Neurospora crassa (NcLPMO9D) נאספו ב- IMAGINE ב- HFIR בטמפרטורת החדר וב- MaNDi ב- SNS בתנאי קריו בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. גבישים של חלבון מוקשה הגדלים במאגר מבוסס _H2O עם נפח גדול מ-0.1 מ"^מ3 (דוגמה להמחשה של גבישים גדולים מוצגת באיור 4 המשלים ובמספרים לאחר מכן). גבישים הוצבו בני נימי קוורץ וחילופי אדים עם המאגר מבוסס _D2O בוצעו במשך שלושה שבועות לפני איסוף הנתונים (איור 4).

איסוף נתוני טמפרטורת החדר בוצע בקו הקרן IMAGINE (איור 1). בדיקת קרן לבנה בת ארבע שעות הובילה לעקיפה ברזולוציה גבוהה המצביעה על כך שהקריסטל היה בגודל ובאיכות מתאימים לאיסוף ערכת נתונים מלאה. בנוסף למתן מידע ראשוני על איכות עקיפה של הגביש, החשיפה הרחבה הראשונית bandpass יכול לשמש כדי לאינדקס את דפוס עקיפה ולקבוע את מטריצת כיוון הגביש. בהתחשב בקבוצת החלל _P21 של הגביש, אסטרטגיית איסוף נתונים של 18 מסגרות עם זמן איסוף של 20 שעות לכל מסגרת יושמה. ב כמו באיסוף נתוני עקיפה של קרני רנטגן, קבוצות חלל סימטריה גבוהות יותר דורשות פחות מסגרות (כלומר פחות כיסוי זוויתי) כדי לאסוף ערכת נתונים מלאה. הנתונים נאספו במצב מעין-לאואה באמצעות טווח אורך גל של 2.8 – 4.0 Å. לאחר איסוף הנתונים, הנתונים היו באינדקס, ששולבו בקנה מידה ומוזגו כדי לתת קובץ SLD נייטרוני בפורמט MTZ ברזולוציה של 2.14 Å. הנתונים הוערכו כאיכות מספקת בעקבות הנחיות דומות לניתוח נתוני רנטגן, אם כי שלמות של 80% ו- _CC1/2 של לפחות 0.3 נחשבו מקובלים מכיוון שעקיפת חלבון נויטרונים היא טכניקה מוגבלת בשטף.

לאחר איסוף נתוני עקיפה של נויטרונים בטמפרטורת החדר, אותו גביש שימש לאיסוף ערכת נתונים של עקיפה של קרני רנטגן בטמפרטורת החדר ברזולוציה של 1.90 Å (איור 13 משלים). נתוני הרנטגן שימשו לקביעת מיקומם של האטומים "הכבדים" כולל C, N, O ו- S. המבנה ששוכלל כנגד נתוני הרנטגן בלבד שימש אז כמודל ההתחלתי לביצוע עידון משותף כנגד נתוני הרנטגן והנויטרונים. Phenix ReadySet שימש להוספת אטומי H באתרים שאינם ניתנים להחלפה, אטומי H ו- D באתרים הניתנים להחלפה ואטומים D למולקולות מים של מודל הרנטגן ההתחלתי. לאחר הכנת מודל זה, בוצעו שיפורים איטרטיביים כנגד שתי ערכות הנתונים (איור 19 משלים ו-20 איור משלים). בניית מודל אינטראקטיבי בוצעה ב-Coot על ידי בדיקה חזותית של מפות הצפיפות כדי לכוון שרשראות צד ומולקולות מים בהתאם (איור 22 משלים). נתוני הנויטרונים שימשו בעיקר לקביעת מצבי פרוטוניציה וכיווני מולקולות מים. השוואה בין מפת צפיפות האלקטרונים של שאריות כמו סרין וטריפטופן ומפת הנויטרונים SLD המתאימה ממחישים את המידע שניתן להשיג על מצבי פרוטוניציה באתרי H/D הניתנים להחלפה מעקיפה של חלבון נויטרונים (איור 7). שכבת-על של מפות אלקטרונים וניוטרונים SLD עבור מולקולות מים מצביעה גם על כך שבעוד שניתן להסיק אינטראקציות של קשר מימן מנתוני רנטגן, נייטרונים מספקים מידע ברור לגבי הכיוון של קשרי מימן אלה (איור 8). נויטרונים SLD _FO-FC להשמיט מפות נוצרו כדי לקבוע מצבי פרוטוניציה וכיוון H / D של שרשראות צד. מאוירים מפות הנייטרונים SLD שהושגו עבור שאריות טירוצין ותרונין, שבהן מפות הנויטרונים _Fo-FC מצביעות בבירור על פסגות חיוביות המסמלות את נוכחותו של H/D (איור 9). נתוני עקיפה של הנויטרונים שנאספו סיפקו גם מידע רב ערך על מצבי פרוטוניציה מרובים, כגון קבוצת Lys +_ND3⁺ (איור 10). סטטיסטיקת עידון (_Rwork ו- _Rfree) הייתה במעקב צמוד במהלך מיטוב המודל כדי למנוע התאמת יתר. הסטטיסטיקה הסופית נתנה _Rwork רנטגן של 12.77 % ו _Rfree של 18.21%, ו _Rwork נויטרונים של 14.48% ו _Rfree של 21.41% עם 389 מולקולות מים נוכחים (איור משלים 28).

נתוני טמפרטורת ההקפאה נאספו ב- NcLPMO9D בעקבות השריית אסקורבאט כדי להפחית את האתר הפעיל של הנחושת מ- ^CuII ל- ^CuI בקו הקרן של MaNDi (איור 2 משלים ודמות משלימה 15)⁴⁵. הנתונים נאספו באמצעות מצב TOF Laue לאחר בדיקת עקיפה של נויטרונים באמצעות חשיפה של 4 שעות כדי לאמת את איכות עקיפה. בהתחשב בקבוצת החלל של הגביש, אסטרטגיית איסוף נתונים של 18 פריימים עם מינון איסוף של 80 קולון לכל מסגרת הומצאה. הנתונים נאספו במצב TOF-Laue בטווח גל של 2.0 – 4.0 Å. לאחר איסוף הנתונים, הנתונים היו אינדקס, משולב, קנה מידה ומוזג כדי לתת קובץ השתקפות בפורמט MTZ ברזולוציה של 2.40 ^Å51,52.

לאחר איסוף נתונים, ערכת הנתונים של עקיפה של NcLPMO9D 2.40 Å cryo-temperature שימשה לעידון נתונים נויטרונים בלבד. נתוני הנויטרונים הועברו בשלבים על ידי החלפה מולקולרית באמצעות PDB 5TKH כמודל ההתחלתי. Phenix ReadySet שימש להוספת אטומי H באתרים שאינם ניתנים להחלפה ואטומים H/D עם תפוסה חלקית באתרים הניתנים להחלפה. מולקולות מים הוסרו מהמודל ההתחלתי בעזרת כלי PDB (איור 23 משלים). הכנת הדגם לוותה בעידון עם phenix.refine באמצעות טבלת הפיזור של הנויטרונים (איור 24 משלים). בניית מודל אינטראקטיבי בוצעה ב-Coot, כאשר מולקולות מים נוספו באמצעות הפסגות החיוביות של מפת ה-FO-Fc וממוקמות בהתאם לאינטראקציות פוטנציאליות של קשר מימן (איור 11A ואיור 11B). בעת ניתוח מפות נויטרונים SLD, מולקולות מים נראות בבירור אם הן מסודרות מאוד, אולם הצפיפות שלהן עשויה להיות כדורית או אליפסואידית אם הן אינן מסודרות היטב (איור 11C-E). מפות נויטרונים SLD שימשו כדי לספק מידע רב ערך על הכיוון של שאריות כגון אספרגין, שבו הבחנה בין קבוצות קרבוניל ואמינות יכולה להיות מאתגרת בעת שימוש בנתוני עקיפה של קרני רנטגן בלבד (איור 12A ואיור 12B). פסגות במפות השמטטות של SLD של נויטרונים _FO-FC היו גם מאוד אינפורמטיביות בקביעת מצבי הפרוטוניציה של שאריות היסטידין במיקום N _δ או N _ε (איור 12C ואיור 12D). מצב הפרוטוניציה של שאריות עם אתרים רבים הניתנים להחלפה H/D ניתן גם באמצעות מפות SLD נויטרונים. זה הומחש בבירור עם מפת SLD נייטרונית _FO-FC להשמיט של ארגינין, אשר ידוע שיש מטען חיובי (איור 12E ואיור 12F). כפי בעבר, התאמת יתר נמנעה על ידי ניטור _Rwork ו _Rfree. הסטטיסטיקה הסופית נתנה _Rwork של 22.58% ו _Rfree של 30.84% (איור משלים 29). בהתחשב בכך שעקיפת חלבון נויטרונים היא טכניקה מוגבלת בשטף, שבה יש לקחת בחשבון את אורך הפיזור השלילי ואת גורם הפיזור הלא ברור הגדול של H, ניתן לצפות כי עידון נתוני נויטרונים בלבד יהיה בעל סטטיסטיקה גרועה יותר מאשר עידון נתונים משותפים של קרני רנטגן/נויטרונים עם פחות מולקולות מים גלויות (איור 28 משלים ואיור משלים 29).

בעת ניתוח מפות SLD נויטרונים, יתברר כי ביטול צפיפות עקב אורך פיזור הנויטרונים השלילי של H יתרחש עבור חלבונים מוקשים שהיו נתונים להחלפת אדים עם חיץ התגבשות המכיל _D2O. מסיבה זו, מפות נויטרונים SLD שבהן אטומי H שאינם ניתנים להחלפה מחוברים לפחמן נראים לא שלמים בהשוואה למקבילם במפת צפיפות האלקטרונים (איור 13A). ההשפעה של ביטול ניכרת לעתים קרובות יותר בהחלטות גרועות יותר, מה שהופך את זה הכרחי כדי לקבל גבישי חלבון באיכות גבוהה. לכן עדיף לבצע עידון משותף של מדגם עם נתוני רנטגן וניוטרונים שבהם ניתן להשתמש בנתוני הרנטגן כדי לקבוע את מיקום עמוד השדרה של החלבון (איור 13B). יתר על כן, אטומי גופרית בציסטאין ובמתיונין עשויים להיות גלויים בצורה גרועה, מה שדורש נתוני רנטגן למיקום אטום מדויק (איור 13C ואיור 13D). מתכות עם אורכי פיזור נויטרונים חלשים עשויות גם להיות מאתגרות לדגמן במפות נויטרונים SLD, כפי שניתן לראות במפות LPMO9D שלנו. איסוף של ערכת נתונים של רנטגן במינון נמוך (ללא נזקי קרינה) על אותו גביש הוא אפוא שימושי, שכן הוא מאפשר מיקום אטום מתכת באמצעות מפות צפיפות אלקטרונים (איור 13E ואיור 13F).

איור 1: תרשים זרימה של זרימת עבודה של קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים. ייצור חלבונים. על מנת להשיג מבנה נויטרונים, חלבון מתבטא לראשונה. ביטוי חיידקי במדיה מבוססת _H2O או _D2O משמש בדרך כלל כדי לייצר תשואה גבוהה של חלבון רקומביננטי מוקשה או מתוסה, בהתאמה. החלבון מטוהר במאגר מבוסס _H2O ולאחר מכן מתגבש במאגר התגבשות מבוסס _H2O או _D2O כדי לגדל גבישים לגודל מינימלי של 0.1 מ"^מ3. הכנה לדוגמה: לפני איסוף נתוני עקיפה של נויטרונים, גבישים הגדלים ב- _H2O עוברים חילופי H/D כדי להחליף את אטומי H titratable חלבון עם חילופי D. H / D יכול להיעשות על ידי השריה ישירה של הגבישים במאגר התגבשות deuterated, שיווי משקל של טיפת התגבשות עם מאגר מבוסס _D2O, או על ידי הרכבה גבישים נימי קוורץ להחלפת אדים עם חיץ התגבשות deuterated. איסוף נתוני נויטרונים: לאחר חילופי H/D, גבישים פוטנציאליים נבדקים כדי לקבוע את איכות עקיפה. קריסטלים ברזולוציה מינימלית של 2.5 Å נחשבים מתאימים לאסוף ערכת נתונים מלאה. גבישים מותקנים נימים קוורץ לאיסוף נתונים בטמפרטורת החדר או פלאש קפוא בהקפאה לולאה לאיסוף נתונים בטמפרטורה קריוגנית. ערכת נתונים של קרני רנטגן נאספה על אותה גביש (או זהה) באותה טמפרטורה. בניית מודל: עידון מתבצע באמצעות phenix.refine נגד נתוני נויטרונים ורנטגן או נגד נתוני הנויטרונים בלבד. בניית מודל ידני של מבנה החלבון מתבצעת ב- Coot באמצעות מפות הנויטרונים SLD. מבנה מלא: לאחר השלמת מבנה החלבון, מודל הקואורדינטות מאומת ומופקד בבנק נתוני החלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: קצירת גבישי חלבון. (A) גבישים מטופלים תחת מיקרוסקופ. (B) קופסת הכריכים האטומה המכילה את צלחת הזכוכית המסיליקון נפתחת. מאגר המאגר מועבר על שקופיות זכוכית מסיליקון. (C) גביש נקצר עם מיקרולופ. (D) הגביש ממוקם בטיפת ליקר אם כדי לשטוף את כל הפסולת שנקטפת לעתים קרובות יחד עם הגביש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: העברת גביש לנוני קוורץ. (א) סופו של נימי קוורץ מלא במאגר. (B) הגביש מועבר לתוך נימי הקוורץ ו-(C) שקועים במאגר. (D) הגביש נישא למטה נימי באמצעות מאגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: איטום נימי הקוורץ. (א) מאגר מפורק נוסף בסוף הנימי כדי ליצור "תקע". (ב) שעווה נמסה עם "שרביט". (ג) הנימי ממוקם בשעווה המומסת כדי לאטום. (D) פקקי שעווה נוצרים בשני הקצוות כדי לאטום את הנימי. (ה) הגביש לאחר הרכבה. (ו) הנימי האטום ממוקם בצלחת פטרי ומוחזק במקום עם מרק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הגברת עוצמת עוצמת הנויטרונים. ככל שאיסוף הנתונים מתקדם, כתמים מפוזרים הופכים לאינטנסיביים יותר. (הערה: תמונות עקיפה חיות המוצגות כאן הן להמחשה ונלקחו מגבישים שונים.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: בניית מודל אינטראקטיבית באמצעות נתוני נויטרונים ב-Coot. (A) שיא צפיפות SLD חיובי של _FO-FC (ירוק) המציין שיש לכוון מחדש את הסרין על-ידי עריכת זוויות צ'י. מפת הנויטרונים _2FO-FC מוצגת במפת צפיפות אלקטרונים סגולה של 2FO-FC מוצגת בכחול. (ב) סרין ממוקם כראוי. (C) פסגות צפיפות SLD חיוביות ושליליות של _FO-FC (ירוק ואדום, בהתאמה) המציינות כי יש לסובב/לתרגם טריפטופן כדי להתאים לשיא צפיפות ההבדלים. (ד) טריפטופן מכוון כראוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: מידע נוסף ממפות נויטרונים SLD. (A) מפת צפיפות האלקטרונים _2FO-FC (כחול) מציגה את מיקומם של האטומים "הכבדים" יותר בסרין. (B) מפת נויטרונים _2FO-FC SLD (סגול) מציגה בבירור את המיקום של אטום D "קל יותר" בסרין. (C) מפת צפיפות האלקטרונים _2FO-FC (כחול) מציגה את מיקומם של האטומים "הכבדים" יותר בטריפטופן. (D) מפת נויטרונים _2FO-FC SLD (סגול) מציגה בבירור את המיקום של אטום D "קל יותר" טריפטופן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: מיקום מולקולות מים. (A) הצורה הכדורית של מפת צפיפות אלקטרונים _2FO-FC (כחול) תכונה למים. (B) מפת הנויטרונים _2FO-FC SLD (סגול) מספקת מידע על כיוון המים ואינטראקציה של קשר מימן. (C) מפה שכבת-על של מפות אלקטרונים וניוטרונים SLD של מים. מפת הנויטרונים _2FO-FC מוצגת במפת צפיפות אלקטרונים סגולה של 2FO-FC מוצגת בכחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: מפות FO-FComit של נויטרונים SLD. (A) מפת הנויטרונים SLD (ירוק) של _FO-FC מספקת מידע ברור על כיוון ה-H/D של שאריות טירוזין. מפת הנויטרונים _2FO-FC מוצגת במפת צפיפות אלקטרונים סגולה של 2FO-FC מוצגת בכחול. (B) שאריות טירוסין עם כיוון H/D נכון. (C) מפת הנויטרונים _FO-FC SLD (ירוק) מספקת מידע ברור על כיוון H/D של שאריות threonine. (D) שאריות Threonine עם כיוון H/D נכון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: מצבי פרוטוניציה מרובים המוצגים עם מפות נויטרונים SLD. (A) מפת צפיפות האלקטרונים _2FO-FC (כחול) מספקת רק את המיקום של אטום N של קבוצת ליסין ε-אמוניום. (B-E) מפת הנויטרונים SLD של _FO-FC (ירוק) מדגימה בבירור את קבוצת ה- _NH3 הטעונה לחיוב. מפת הנויטרונים _2FO-FC מוצגת במפת צפיפות אלקטרונים סגולה של 2FO-FC מוצגת בכחול. (ו) שכבת-על של צפיפות אלקטרונים ומפות נויטרונים SLD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11: הופעת מולקולות מים במפות נויטרונים SLD. (A) מולקולות מים ממוקמות על פי _{מפות נויטרונים} SLD _(ירוק) וקשרי מימן פוטנציאליים. מפת הנויטרונים _2FO-FC מוצגת בסגול. (B) מולקולת מים ממוקמת כראוי. (C-E) הצורות השונות של מפות SLD נויטרונים עבור מולקולות מים בהתאם B-factors ואינטראקציות קשר מימן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 12: מידע על אוריינטציה של חומצות אמינו ופרוטונציה המסופקת על-ידי מפות נויטרונים SLD. (A) פסגות מפת הנויטרונים SLD _FO-FC (ירוק) מצביעות על כיוון שגוי של שאריות אספרגין. מפת הנויטרונים _2FO-FC מוצגת במפת צפיפות אלקטרונים סגולה של 2FO-FC מוצגת בכחול. (B) מפת נויטרונים _2FO-FC SLD (סגול) של כיוון אספרגין הנכון. (C) פסגת מפת הנייטרונים SLD _FO-FC (ירוקה) מציינת פרוטוניקציה יחידה של ההיסטידין ב- N _ε. (ד) 2FO-FC מפת SLD נויטרונים (סגול) של היסטידין N _ε - פרוטוניציה. (ה) נויטרונים SLD _FO-FC להשמיט פסגות מפה (ירוק) לאשר את המטען החיובי של ארגינין. (ו) מפת נויטרונים _2FO-FC SLD (סגול) של ארגינין טעון חיובית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 13: מפות SLD נויטרונים לא רציפות. (A) מפת SLD נויטרונית _2FO-FC (סגולה) של חלבון מוקשה, אדים H/D שהוחלף. חומצה גלוטמית מציגה ביטול מפת SLD נויטרונים בשל אורך הפיזור השלילי של אטומי H שאינם ניתנים להחלפה. (B) מפת צפיפות אלקטרונים 2FO-FC (כחול) מכוסה בבירור בצפיפות החומצה הגלוטמית. (C) אטום הגופרית במתיונין נראה בצורה גרועה במפות נויטרונים 2FO-FC SLD (סגול). (D) מפת צפיפות אלקטרונים עם כיסוי מציגה בבירור את הצפיפות של המת'ונין. (ה) אטומי מתכת, כאן נחושת, נראים בצורה גרועה במפות נויטרונים _2FO-FC SLD (סגול). (ו) מפת צפיפות אלקטרונים 2FO-FC (כחול) מצופה בבירור את הצפיפות של אטום הנחושת המתואם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איזוטופ	אורך פיזור קוהרנטי (fm)	אורך פיזור לא ברור (fm)
1H	-3.741	25.274
2H	6.671	4.04
12C	6.6511	0
14N	9.37	2
16O	5.803	0
23נא	3.63	3.59
24 מ"ג	5.66	0
31P	5.13	0.2
32S	2.804	0
35Cl	11.65	6.1
39K	3.74	1.4
40Ca	4.8	0
55Mn	-3.73	1.79
56Fe	9.94	0
63Cu	6.43	0.22
64Zn	5.22	0

טבלה 1: אורכי פיזור נויטרונים וערכי פיזור לא ברורים. עיבוד מסירס, 199216.

איור משלים 1: מכשיר IMAGINE בכור האיזוטופ בשטף גבוה. (א) מכשיר IMAGINE באולם המדריכים של הנויטרונים הקרים. (B) דגימה רכובה בני נימי קוורץ המחוברים עם מרק לגוניומטר. טבלת המדגם והגלאי נסגרת כדי למקם את הקריסטל ואת לוחית התמונה הגלילית בקרן הנויטרונים. שונה באישור האיגוד הבינלאומי של ^{קריסטלוגרפיה53}. תמונות שסופקו באישור ז'נבייב מרטין, המעבדה הלאומית אוק רידג'. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 2: מכשיר MaNDi במקור הנויטרונים של ספאליציה. (א) מערך גלאי מצלמות הכעס של MaNDi. שוחזר באישור האיגוד הבינלאומי של ^{קריסטלוגרפיה11}. (ב) שלב מדגם ניתן להזזה של MaNDi. (C) דגימה המותקנת בני נימי קוורץ המותקנת על גוניומטר ב- MaNDi לאיסוף נתוני טמפרטורת החדר. תמונות שסופקו באישור ז'נבייב מרטין, המעבדה הלאומית אוק רידג'. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 3: מבנה הפוליסכריד המונואוקסיגניאז NcLPMO9D. האתר הפעיל בנחושת NcLPMO9D ממוקם על משטח כריכה שטוח של פוליסכריד. הנחושת מתואמת על ידי שתי שאריות היסטידין ב"סד היסטידין " קלאסי, כמו גם שאריות טירוסין ציריות. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 4: קריסטל עם נפח מספיק במגש התגבשות טיפת ישיבה. (A) גבישים גדולים גדלים בטיפות ישיבה שנקבעו בצלחות זכוכית מסיליקון 9 היטב. (B ו - C) גבישים נמדדים כדי לזהות את אלה עם נפח > 0.1 ^mm3. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 5: מד pH מוגדר לקריאות מאגר מפורקות. אלקטרודה pH ספוג _D2O לפני השימוש. NaOD ו- DCl משמשים להתאמת ה- pH של מאגרים מפורזים. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 6: הנחיות הרכבה לדוגמה של MaNDi. הממדים המרביים של מיקום נימי קוורץ ודגימה לאיסוף נתוני טמפרטורת החדר.
שוחזר מ: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזאת.

איור משלים 7: הסרת מאגר עודף. (A) חוצץ עודף שאפתני מן נימי קוורץ עם טיפים מיקרו-קפילריים. (B) המאגר הנותר מוסר עם פתיל נייר דק כדי לייבש לחלוטין את הנימי. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 8 משלים: GUI רכישת נתונים. חלון הקלט של "פרמטרי הניסוי" עבור איסוף נתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 9 משלים: ה-GUI של אופטיקה. בחירת טווח מעין-לאואה לאיסוף נתונים וניטור של קצב ספירת הנויטרונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 10 משלים: איסוף נתונים ב- GUI של רכישת נתונים. זמן החשיפה, מספר המסגרות והזוויות לאיסוף נתונים מצוינים בכרטיסיה "איסוף". לאחר מכן מתבצע איסוף נתונים באמצעות "התחל סריקה". אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 11 משלים: נייטרונים מפוזרים זוהו ומוצגים. בסוף זמן החשיפה, גלאי לוחית התמונה הרגיש לנויטרונים מוקרא ותבנית ההפרה מוצגת ב- GUI של רכישת נתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 12 משלים: עיבוד נתונים בעקבות עקיפה של נויטרונים. מסגרות הן אינדקס, משולב, אורך גל מנורמל וקנה מידה באמצעות Lauegen, Lscale ו Scala כדי ליצור קובץ השתקפות ממוזג בעקבות איסוף נתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 13 משלים: איסוף נתוני רנטגן. מקור ביתי גנרטור רנטגן להגדיר עם גביש נימי קוורץ רכוב לאיסוף נתוני טמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 14 משלים: הנחיות הרכבה לאיסוף נתוני קריו של MaNDi. מידות של כיפות קריסטל וגובה סיכה לאיסוף נתוני קריו ב- MaNDi.
שוחזר מ: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזאת.

איור משלים 15: הקפאת הבזק לאיסוף נתוני עקיפה של קריו נויטרונים. (A) התקנה להשריית קריסטל, קציר עם מיקרולופ והקפאה בחנקן נוזלי באמצעות מיכל תואם קריו כגון דיואר קצף. הגביש הרכוב מועבר ישירות על גוניומטר ההקפאה של קו הקורה באמצעות מלקחיים של סיכת קריו מכווצת מראש. (B) חותם השעווה נמס להסרת גביש. (ג) הקריסטל נשטף עד סוף נימי הקוורץ לקציר. (D) הקריסטל ספוג ברצף במאגר השריית אסקורבאט ולאחר מכן cryoprotectant ואחריו הקפאת הבזק בחנקן נוזלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 16 משלים: ממשק יישור לדוגמה. יישור הגביש בקרן הנויטרונים, המיוצג על ידי הצלב הכחול, נעשה על ידי נקודה ולחץ על מרכוז. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 17 משלים: ה- CSS GUI לאיסוף נתונים. אסטרטגיית איסוף הנתונים, כולל מינוני חשיפה וזוויות, מועלים ב- CSS GUI. ככל שאיסוף הנתונים יתקדם, הנויטרונים המפוזרים שזוהו בגלאי בזמן אמת יוצגו בלוח העליון. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 18 משלים: התאמת דגלי R-free במק"ס4. הדגלים נטולי ה-R של נתוני הנויטרונים תואמים לדגלים נטולי R של נתוני רנטגן שנאספו על אותו או גבישי זהה לעידון המפרקים. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 19: הכנה לבנה ועידון. (א) הכלי פניקס ReadySet משמש להוספת תפוסה כפולה של H/D באתרים הניתנים להחלפה. (B) הן נתוני הנויטרונים והן נתוני הרנטגן משמשים לעידון משותף, בעוד שמודל הקלט הראשוני מעודן כנגד ערכת הנתונים של קרני הרנטגן שנאספו על אותו גביש או גבישי זהה. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 20 משלים: קביעת תצורה של הגדרות עידון. מודל הזיכוך, כמו גם המרחקים הגרעיניים מוגדרים לעידון נתונים משותף של קרני רנטגן/נויטרונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 21 משלים: בחירת נתונים לבניית דגם קוט. פלט קובץ פניקס MTZ המכיל רנטגן ונתוני נויטרונים לא ממולאים נפתח ב- Coot כדי ליצור מפות אלקטרונים וניוטרונים SLD לבניית מודל אינטראקטיבי. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 22 משלים: בניית מודל אינטראקטיבית בקוט במהלך עידון משותף. (A) שיא צפיפות SLD חיובי ושלילי של _FO-FC (ירוק ואדום, בהתאמה) המציין כי יש לכוון מחדש את המים על ידי סיבוב / תרגום. מפת הנויטרונים _2FO-FC מוצגת במפת צפיפות אלקטרונים סגולה של 2FO-FC מוצגת בכחול. (ב) מים ממוקמים כראוי. (C) פסגת מפת SLD חיובית של נויטרונים _FO-FC (ירוק) מציינת שיש לסובב את threonine כדי להתאים לשיא צפיפות ההבדלים על-ידי עריכת זוויות צ'י. (ד) ת'רון מכוון כראוי. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 23 משלים: הכנה מבנה לעידון נתונים נויטרונים בלבד. קובץ הקואורדינטות ההתחלתי מוכן לעידון על ידי הסרת אטומי מים ב- PDBTools ועל ידי תוספת של תפוסה כפולה H / D באתרים הניתנים להחלפה. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 24 משלים: עידון נתונים של נויטרונים בלבד. (א) נתוני נויטרונים מועלים כמו גם את מודל ההתחלה המוכן. (ב) ההגדרות לעידון נתוני נויטרונים משתמשות בטבלת הפיזור של הנויטרונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד איור זה.

איור משלים 25: בחירת נתונים לבניית דגם קוט. נתוני הנויטרונים שלא מולאו נפתחים ב-Coot לבניית מודל אינטראקטיבי. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 26: עידון שטח אמיתי בכוס עבור שאריות מפורקות. (A) חיובי ושלילי _FO-FC נויטרונים SLD צפיפות פסגות (ירוק ואדום, בהתאמה) המציין כי שאריות ארגינין חייב להיות מועבר כדי להתאים לשיא צפיפות _FO-FC. מפת הנויטרונים _2FO-FC מוצגת במפת צפיפות אלקטרונים סגולה של 2FO-FC מוצגת בכחול. (ב) ניצול חידוד החלל האמיתי גורם לאטומי D "מתפוצצים" עקב ספריות חסרות של ריסון גיאומטריית קוט. (C) האטומים D אינם זזים עם שאר האטומים שאריות. (D) ניתן לתקן באופן ידני את מיקומי האטום D באמצעות עורך טקסט. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 27: תוספת של מולקולות מים. (A) ניתן להוסיף באופן ידני מולקולות מים לפסגות צפיפות מפת הנויטרונים החיוביות של _FO-FC SLD (ירוק). מולקולות המים המוחדרות יוצגו בתחילה על ידי אטום O בכוס. (B) Phenix ReadySet משמש להוספת אטומי D לאטומי O עבור מולקולות מים. (C) מולקולת המים המנוטרל מתווספת בהצלחה. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 28: סטטיסטיקת עידון. סטטיסטיקת עידון נתונים סופית לאחר עידון רנטגן/נויטרונים משותפים. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 29: סטטיסטיקת עידון. סטטיסטיקת עידון נתונים סופית לאחר עידון נתוני נויטרונים בלבד. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

Discussion

קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים היא טכניקה רגישה ביותר לבדיקת מצבי פרוטוניציה וכיוון מולקולות מים בחלבונים. מידע זה שופך אור על מנגנונים קטליטיים של חלבונים מכיוון ששינויים באינטראקציות פרוטוניציה ומימן הם לעתים קרובות מרכזיים בכימיה של ^{אנזימים10}. קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים, אם כי טכניקה אינפורמטיבית, יש מספר גורמים שיש לקחת בחשבון לפני תכנון לערוך ניסוי עקיפה נויטרונים, כלומר:

1. הדרישה לגבישי חלבון גדולים לאיסוף נתונים.
2. תכונות הפיזור של מימן ואלמנטים אחרים, כגון יונים מתכת.
3. התיישנות בתוכנה לעידון מבנה ובניית מודלים בעת עבודה עם דוגמאות מפורקות.

קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים היא טכניקה מוגבלת בשטף. בניגוד ערכות נתונים עקיפה רנטגן, R-factors גבוה יותר ושלמות נמוכה יותר, יתירות ויחסי אות לרעש צפויים עבור ערכות נתונים נויטרונים בשל המגבלות הטבועות בטכניקה (שטף מוגבל, מעין לאואה, אורכי גל ארוכים יותר). איסוף נתונים של מסגרת אחת הוא בדרך כלל 12 - 18 שעות. הצלחה של ניסוי תלויה מאוד בגודל מדגם ואיכות עם גבישים של 0.1 ^mm3 לעתים קרובות להיות הדרישה ^{המינימלית3}. עקיפה של נויטרונים דורשת ייצור של כמויות גדולות של חלבון כדי להגדיר טיפות התגבשות הנעות בין 10 ל 800 μL. ניתן להעריך את הנפח המינימלי לגידול גבישים גדולים מספיק באמצעות מחשבון נפח בהתחשב בפרמטרים של הגביש והדגימה (https://neutrons.ornl.gov/imagine). צמיחה של גבישים גדולים הושגה באופן הנפוץ ביותר על ידי דיפוזיה ^אדים3. התגבשות טיפה תלויה מאפשרת צמיחה של גבישים בטיפות גדולות הנעות בין 10-25 μL, בעוד טיפות גדולות יותר הנעות עד ~ 50 μL ניתן להגדיר באמצעות ציוד טיפת ישיבה זמין ^{מסחרית14,54}. צלחות זכוכית סיליקון תשע היטב ניתן להשתמש כדי להגדיר טיפות גדולות מאוד, עם נפחים עד 800 μL. צלחות זכוכית אלה ממוקמות ב"קופסאות כריך "הזמינות מסחרית מ-Hampton Research. טכניקות התגבשות נוספות כוללות התגבשות אצווה, שבה הגבול של גודל טיפה מוכתב על ידי הכלי. ניסוי התגבשות אצווה שהוקם יכול לנוע בין מיקרוליטרים למיליליטרים55. התגבשות יכולה להתבצע גם באמצעות טכניקת הדיאליזה שבה החלבון משוויב עם המשקעים באמצעות קרום דיאליזה או על ידי דיפוזיה נגד לאורך שיפוע ריכוז משקעים או באמצעות תקע נקבובי כגון agarose56,57. זריעה מציעה חלופה נוספת להשגת גבישים של הנפח הרצוי. מיקרו ומקרו-שיתוף הועסקו בהצלחה לצמיחת גבישים גדולה, כולל גביש גדול של NcLPMO9D45. ידע מסוים בדיאגרמת שלב החלבון, כולל השפעת הטמפרטורה על המסיסות, מסייע בצמיחת גבישים גדולה.

בעת תכנון ניסוי עקיפה של נויטרונים, אופטימיזציה של הכנת החלבון כדי למקסם את יחס האות לרעש במהלך איסוף נתוני עקיפה היא ^{חיונית7}. כדי לעקוף את ביטול הצפיפות ופיזור לא ברור גבוה שנגרם על ידי אטומי H, ניתן לשפר את מפות ה- SLD של הנויטרונים על ידי החלפת אטומי H עבור האיזוטופ D שלה, בעל אורך פיזור קוהרנטי חיובי ואורך פיזור לא ברור נמוך. כדי להשיג זאת, מתבצע חילופי אדים של גביש חלבון מוקשה נגד חיץ התגבשות מפורק. זה מבטיח חילופי H/D של מולקולות ממס ואת מעבדה, חלבון ניתר H ^{אטומים23}. החלפת אדים מתבצעת על ידי הרכבת הגביש המימן נימי קוורץ עם חיץ התגבשות מבוסס _D2O, deuteated "תקעים" והוא מייצג טכניקה יעילה ועדינה כי הוא מיושם לרוב14,23,35. ההחלפה יכולה להימשך מספר שבועות ועדיף לדרוש את המאגר deuterated להיות שונה לעתים קרובות כדי להבטיח חילופי H / D מרבי. החלפת H/D יכולה להתבצע גם על ידי השריה ישירה של הגביש במאגר טבול. כדי למנוע הצבת הגביש תחת לחץ עקב חשיפה _D2O, תהליך השרייה צריך להתבצע בהדרגה על ידי הגדלת בהדרגה יחס _D2O:_H2O58. בנוסף לכך, התגבשות של חלבון מוקשה יכולה להתבצע גם במאגר deuteated עבור חילופי H /D באתרי H ^labile22,59. יש לציין, עם זאת, כי חוצץ מבוסס _D2O יש השפעה על מסיסות חלבון הדורש התאמה נוספת של התנאים הידועים מבוססי H2O3,59. מאגרים מבוססי _D2O נצפו גם להוביל גבישים קטנים יותר במקרים ^{מסוימים59}. החלפה מלאה של אטומי H חדירים ופחמן ל- D ניתן להשיג על ידי הבעת חלבונים במדיה deuterated כדי ליצור מדגם ^{perdeuterated20}. מפות הנויטרונים SLD המתקבלות של המדגם המתכלה ישתפרו באופן משמעותי, ולא יציגו עוד את ביטול הצפיפות של המקבילה המדגם מוקשה. זה מועיל בעת אפיון H/D מחויב באתרים שאינם ניתנים להחלפה בחלבון או קופקטור. עם זאת, ביטוי של חלבון perdeuterated הוא גם גבוה בעלות נמוך ^{בתשואה60}. המרכז הלאומי לביולוגיה מולקולרית מבנית (CSMB) מציע מתקן תיוג למשתמשים המבקשים ליצור דגימה מתכלית (https://www.ornl.gov/facility/csmb). ביטוי מתכלה מבוצע בדרך כלל ביו-ריאקטור בסולם של 1 ליטר המניב ~ 50 מ"ג של חלבון ^מטוהר61.

לאחר איסוף נתוני עקיפה של נויטרונים, שיפור ובניית מודל אינטראקטיבי מבוצע. עידון ניתן להפעיל באמצעות חבילות תוכנה מרובות כולל phenix.refine, nCNS או SHELXL28,31,32,33. חבילת פניקס היא התוכנה הנפוצה ביותר לחידוד נתוני עקיפה של נויטרונים בשילוב עם Coot אשר משמש לבנות באופן ידני את המודל מן מפות SLD ^{נויטרונים34}. למרות שני Phenix ו Coot לאפשר עיבוד של נתוני עקיפה נויטרונים, הם עשויים להיות חסרים תכונות מסוימות הדרושות כדי לעבד את idiosyncrasies הקשורים נתונים נויטרונים ודגימות deuterated. לדוגמה, קוט אינו מכיל אופטימיזציה גיאומטרית עבור שאריות deuterated, אשר יכול להוביל לסיבוכים במהלך בניית מודל מאז התכונה "נדל"ן שטח עידן" תוצאות "מתפוצץ" שאריות (איור משלים 26)⁶². ניתן לפתור זאת על-ידי יצירת קבצי ריסון עבור כל השאריות המנוטרלים. עם זאת, זהו תהליך אינטנסיבי וספריות כאלה אינן זמינות כעת לציבור. בעת ביצוע עידונים ב פניקס, אתרי H/D הניתנים להחלפה ייקבעו בתחילה כתפוסה של 0.50 עבור H ו- D. כאשר מתבצעים שיפורים, התפוסה של H ו- D תשוכלל על פי מפות הנייטרונים SLD. במהלך בניית מודל אינטראקטיבי, מפות _Fo- _Fc צפיפות הפרשים מאוד אינפורמטיביות בהערכת תפוסות H / D. ניתן להשתמש במפות כדי לקבוע אילו אתרים הם בעלי תפוסת D גבוהה, שהיא אינפורמטיבית במיוחד באתר הפעיל שבו מצבי פרוטוניציה רלוונטיים מבחינה ^{קטליטית63}. מצבים מעורפלים אכן מתעוררים, כאשר H:D התפוסה קרובה ל-0.70:0.30, מה שגורם לביטול אותות מוחלט במפות נויטרונים ^SLD64. כמו כן, יש לקחת בחשבון כי ערכות נתונים נויטרונים מעין לאואה לעתים קרובות יש שלמות סביב 80%, וזה נמוך יותר מאשר ≥ 98% עבור נתוני עקיפה קרני רנטגן. בעת זיקוק נתוני עקיפה של נויטרונים בפניקס, המשרעת הנצפת החסרה (_Fo) מחושבת לפיכך מהמודל כדי להשלים את רשימת ההשתקפות, ובכך מציגה הטיית מודל. כדי להסביר את ההטיה הפוטנציאלית הזו יש לבחון מפות "no_fill" במהלך בניית מודל אינטראקטיבי בניגוד למפות "מלאות".

משתמשים יכולים לבחור לבצע רנטגן משותף / נויטרונים עידון נתונים של המבנה שלהם, או עידון נתוני נויטרונים בלבד. הדמיית מפות SLD של נויטרונים, במיוחד ברזולוציה נמוכה יותר, עשויה להיות בתחילה מדאיגה במיוחד עבור חלבון מוקשה שבו H עדיין קיים באתרים שאינם ניתנים להחלפה למרות חילופי אדי H/ D. התוצאה היא ביטולי מפת צפיפות נויטרונים, מה שנותן רושם של מפות לא ^{רציפות65,66}. איסוף ערכת נתונים תואמת של קרני רנטגן משלים את הביטולים הללו בעידון משותף (איור 13A ואיור 13B). אסטרטגיית עידון משותף כוללת בדרך כלל עידון קואורדינטות עמוד השדרה של החלבון מול נתוני הרנטגן, בעוד נתוני עקיפה של הנויטרונים משמשים כדי לחדד את המיקום והתפוסה של אטומי H/D באתרים הניתנים ^{להחלפה28}. מאז כניסתו של תפוסת H /D משותף באתרים הניתנים להחלפה מגדיל את מספר הפרמטרים להיות מעודן, עידון משותף עם נתוני רנטגן גם מגדיל את יחס נתונים לפרמטר. עידון משותף דורש שסט נתונים רנטגן מתאים ייאסף באותה טמפרטורה על אותו גביש או גביש שגדל באותם תנאים. עבור נתוני עקיפה של נויטרונים שנאספו בטמפרטורת החדר (300K), יש לאסוף את ערכת הנתונים המתאימה של קרני הרנטגן בטמפרטורת החדר באמצעות אסטרטגיית איסוף נתונים במינון נמוך כדי להגביל את נזקי הקרינה. דגימות Perdeuteed, לעומת זאת, לספק מפות SLD נויטרונים משופרים ורציפים שכן אין להם את אותו סדר גודל של ביטול אותות H / D. עם זאת, אורך פיזור הנויטרונים של אלמנטים מסוימים, כולל מתכות וגופרית, הופך אותם לגלויים בצורה גרועה במפות נויטרונים SLD, גם אם החלבון נעשה ללא וודאות (איור 13C-F)¹⁸. אם מתכת צריכה להיות מאופיינת, עדיף להשתמש עקיפה רנטגן עידון משותף או ליישם טכניקות ספקטרוסקופיות כדי להשלים ניסויי עקיפה. שיפורי נתונים של נויטרונים בלבד מבוצעים לעתים קרובות כאשר ערכת הנתונים של הנויטרונים יש ברזולוציה גבוהה או אם נעשה שימוש בחלבון מת.... בנוסף, עידון נתונים נויטרונים בלבד שימושי במיוחד אם חלבון רגיש מאוד לנזק קרינה נחקר, שכן מבנה נגזר רנטגן עשוי להיות בעל חפצים הנגרמים על ידי קרינה. אם יש לבצע עידון של נתוני נויטרונים בלבד, יש לברר אם ערכת הנתונים של הנויטרונים המתאימה כוללת שלמות ורזולוציה מספקת.

ORNL מציעה שני מתקנים לאיסוף נתוני עקיפה של נויטרונים: קו הקרן IMAGINE ב- HFIR, כמו גם קו הקרן של MaNDi ב- ^SNS36,67. בעוד ששני המכשירים מספקים אמצעים יעילים לאיסוף ערכת נתונים של עקיפה של נויטרונים תוך שימוש בעקרונות דומים, לכל מכשיר יש מפרטים ייחודיים שיש לקחת בחשבון בעת הגשת בקשה לזמן קרן. IMAGINE אוספת נתוני מעין-לאואה ומותטבת לאיסוף נתוני טמפרטורת החדר בגבישים עם תאי יחידה עד כ- 100 Å. MaNDi יכול לשמש לאיסוף טמפרטורת החדר ונתונים בטמפרטורת הקפאה המעסיקים אוסף TOF-Laue על גבישים עם תאי יחידה עד ~ 300 Å. לפני איסוף ערכת נתונים מלאה, מתבצעת בדיקה על הגביש כדי להעריך את איכות תבנית ההשתרעות שבה הקריסטל חשוף לקרן הנויטרונים למסגרת אחת. אם הגביש באיכות מספקת, תיאסף ערכת נתונים מלאה של עקיפה של נויטרונים, תבוצע באינדקס, תשולב, תגדל ותמוזג בתהליך מקביל לעיבוד נתוני רנטגן. IMAGINE עושה שימוש בלאוג'ן וב-Lscale ו-MaNDi מנצלת את חבילת Mantid ומפעילה פרופיל תלת מימדי המתאים ל-48,50,51,68,69,70. מדענים שיהפכו למשתמשים באחד ממתקנים אלה יקבלו ערכת נתונים בפורמט MTZ או HKL לניתוח נוסף.

עקיפה של נויטרונים היא טכניקה לא הרסנית ורגישה מאוד לבדיקת מצב הפרוטוניציה ואינטראקציות קשר מימן של מקרומולקולות ביולוגיות. זה שימושי במיוחד עבור חלבונים רגישים לצילום ומטלופרוטאין. יש לקחת בחשבון מספר שיקולים לגבי הטכניקה כמו גם עיבוד הנתונים לפני ביצוע ניסוי, אולם התוצאה מניבה תוצאות שעשויות לתת תובנה חשובה על המנגנון הקטליטי של חלבון העניין. קריסטלוגרפיה של חלבון ניוטרון משלימה מחקרים חישוביים, מבניים, ביוכימיים וספקטרוסקופיים, מה שהופך אותו לכלי בעל ערך בארגז הכלים של הביולוגים של טכניקות המשמשות לאפיון מקרומולקולים ביולוגיים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
נקודות נייר סופגות גודל #30-#40, אורך 60 מ"מ	DiaDent/DiaVet	218-292
שעווה נימית	המפטון	HR4-328
CCP4		גרסה 7.0.077
צינורות צנטריפוגה חרוטיים (15 מ"ל)		חרוטיים
(50 מ"ל)	קורנינג	CLS430828
Coot		גרסה 0.8.9.2
CrystalCap ALS	המפטון	HR4-779
מלקחיים עם קצה מעוקל	מיטגן	TW-CTF-1
תמיסת דאוטריום כלוריד, 35 wt. % ב-D2O, ≥ 99 אטום % D	סיגמא-אולדריץ'	543047
תחמוצת דאוטריום 99.9 אטום % D	סיגמא-אולדריץ'	151882
מיקרו-לולאות בעובי כפול 1000 ומיקרו; m	Mitegen	M5-L18SP-1000
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit	Mettler Toledo	30266626
Foam Dewars כלי סטנדרטי 800 מ"ל	Spearlab	M-FD-800
ארבעה צבעים הרכבה חימר	המפטון	HR4-326
HEPES, BioUltra, לביולוגיה מולקולרית, ≥ 99.5% (T),	Sigma-Aldrich	54457
דיפרקטומטר רנטגן אנודה מסתובב בשטף גבוה עם גלאי EIGER 4M	Rigaku, Oxford Cryostream ו-Dectris	XtaLAB Synergy-R	מקור ביתי דיפרקטומטר רנטגן
שרביט מגנטי ישר	מיטגן	M-R-1013198
מיקרו-מעמיס, קצה למילוי פמטוטיפים ומיקרו-נימי זכוכית אחרים (לשימוש מחקרי בלבד), 0.5 – 20 ומיקרו; L, 100 מ"מ, אפור בהיר, 192 יח'. (2 ארונות תקשורת וזמנים; 96 יח')	Eppendorf	930001007
Microtubes נפח 1.5 מ"ל	Eppendorf	Z606340
צלחות פטרי עם מכסה שקוף קוטר 100 מ"מ	Fischerbrand	FB0875713
Phoenix		Version 1.14-3260
מלקחיים 18 מ"מ	Mitegen	M-R-1013196
פיפטה נפח 0.1-2.5 μ L	Eppendorf Research	Z683779
פיפטה כרך 100-1000 μ L	Eppendorf Research	Z683825
פיפטה כרך 10-100 μ L	Eppendorf מחקר	Z683809
פיפטה כרך 20-200 μ L	Eppendorf Research	Z683817
פולי (אתילן גליקול) BioXtra, משקל מול ממוצע 3,350, אבקת	Sigma-Aldrich	P4338
קוורץ נימי, קוטר פנימי 1.00 מ"מ, אורך 80 מ"מ	Hampton	HR6-146
מערכת סטריאומיקרוסקופ מחקר	אולימפוס	SZX16
לשימוש חוזר B3 (סגנון SSRL / SAM) בסיסי	גוניומטרMitegen	GB-B3-R
עגול - צינורות זכוכית חלולים מיניאטוריים (VitroTubes) קוורץ התמזג שקוף / קוטר פנימי 1.00 מ"מ, אורך 100 מ"מ	VitroCom	CV1012	סנדוויץ' נימית בעלת קירות עבים
עם כיסוי	Hampton	HR3-132
צלחת זכוכית סיליקון 9 באר	המפטון	HR3-134
צלחת התגבשות טיפה יושבת (24 באר גדולה)	מיטגן	XQ-P-24S-A
תמיסת נתרן דאוטרוקסיד, 40 wt. % ב-D2O, 99 אטום % D	Sigma-Aldrich	176788
שקופיות כיסוי עיגול עבות סיליקון (22 מ"מ x 0.96 מ"מ)	Hampton	HR3-247
קצות פיפט אוניברסליים, 0.1 - 10 ומיקרו; L	VWR	76322-528
טיפים אוניברסליים לצנרת, 1 - 100 ומיקרו; L	VWR	76322-136
טיפים אוניברסליים לצנרת, 100 - 1000 ומיקרו; L	VWR	76322-154
טיפים אוניברסליים לצנרת, 20 - 200 ומיקרו; L	VWR	76322-150
טיפים אוניברסליים לצנרת, 1 - 20 ומיקרו; L	VWR	76322-134
עט שעווה	המפטון	HR4-342