Method Article

צואה (מיקרו) בידוד RNA

DOI:

10.3791/61908

⸱

October 28th, 2020

 ,  , 
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מבודד RNA כולל באיכות גבוהה מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. ערכת בידוד miRNA מסחרית משמשת עם הסתגלות משמעותית לבידוד RNA טהור עם כמות ואיכות אופטימליות. מבודדי ה-RNA טובים לרוב מבחני ה-RNA במורד הזרם, כגון ריצוף, מיקרו-מערך ו-RT-PCR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה הולך ומתברר כי RNA קיים לומן המעיים וצואה בבעלי חיים ובני אדם. הפרוטוקול המתואר להלן מבודד את סך הרנ"א כולל מיקרו-רנ"א מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. המטרה היא לבודד RNA כולל עם טוהר וכמות גבוהים עבור ניתוחים במורד הזרם כגון ריצוף RNA, RT-PCR ומיקרו-מערך. היתרונות של פרוטוקול אופטימלי זה בבידוד miRNA הם היכולות של בידוד מוצרי RNA מטוהרים מאוד עם שלבי שטיפה נוספים שתוארו, כמות מוגברת של RNA המתקבלת בשיטה משופרת בחידוש הדגימה, וטיפים חשובים של פירוק. מגבלה אחת היא חוסר היכולת לעבד ולטהר מדגם גדול יותר של יותר מ -200 מ"ג מכיוון שגודלי דגימה אלה יגרמו לקושי בהיווצרות ברורה של האינטרפאזה. כתוצאה מכך, גודל המדגם הגדול עלול לזהם את הפאזה המימית שיש לחלץ כמתואר בפרוטוקול עם עניינים אורגניים המשפיעים על איכות הרנ"א המבודד בסופו של דבר. עם זאת, רנ"א מבודד מדגימה של עד 200 מ"ג מספיק לרוב הניתוחים במורד הזרם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רנ"א חוץ-תאי מקבל הכרה כגורם משמעותי המתווך תהליכים ביולוגיים רבים1. RNA חוץ-תאי בצואה דווח לראשונה בשנת 2008 כסמן לסרטן המעי הגס ולקוליטיס כיבית פעילה2, והוא התגלה לאחרונה כמרכיב נורמלי של לומן המעיים והצואה ומתווך תקשורת בין חיידקים מארחים 3,4,5. מטרת פרוטוקול בידוד RNA זה היא לחלץ RNA חוץ-תאי באיכות גבוהה מדגימות צואה שנאספו מנבדקים בעלי חיים ובני אדם. הפרוטוקול הותאם מתוך ערכת בידוד miRNA מסחרית. הרנ"א הנרכש מנוצל לניתוחים במורד הזרם כגון ריצוף RNA, RT-PCR ומיקרו-מערך. הפרוטוקול כולל מספר טיפים חשובים ושימושיים כדי למקסם את ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המערבות חיות מחקר המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית החולים בריגהם אנד נשים, בית הספר לרפואה של הרווארד.

כל השיטות המערבות את נושאי המחקר בבני אדם המתוארות כאן הן בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת המחקר האנושית של השותפים.

1. איסוף דגימות צואה

  1. Autoclave או להכין צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי ונטול נוקלאז 2 מ"ל עם מכסה בורג לכל נבדק בעל חיים בניסוי.
    1. עבור נבדקים אנושיים, ספק מכשיר איסוף דגימות צואה מתאים, ללא נוקלאז וסטרילי עבור כל נושא.
  2. לאסוף 25-100 מ"ג (כ 1-4 כדורי צואה עבור דגימות צואה עכבר) של דגימות צואה מכל נושא בעל חי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רנ"א מייצגים בודדו מדגימות של 50 מ"ג צואת עכברים (2 כדורי צואה של עכברים) ו-100 מ"ג של דגימות צואה אנושית בהתאמה, ונלקחו במים נטולי נוקלאז של 50 μL. מניתוח ספקטרופוטומטר של הריכוז עולה כי כמות כוללת של 49 מיקרוגרם ו-16 מיקרוגרם RNA בודדו בהתאמה (טבלה 1). טוהר הרנ"א היה גבוה כפי שצוין על ידי יחס A260/A280 של ~2.0 ויחס A260/A230 של ~1.8 (טבלה 1). כפי שדווח3, רוב הרנ"א בצואה הם מיקרו-רנ"א, והמיקרו-רנ"א האלה יכולים להתקיים באקסוזום. באופן עקבי לכך, בדיקת אלקטרופורזה מ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חשוב להשתמש בטכניקה נטולת RNase כדי למנוע זיהום RNase במהלך הבידוד7. לאחר צנטריפוגה והיווצרות אינטרפאזה קומפקטית, חשוב להימנע מהאינטרפאזה, הפאזה התחתונה ומזיהום החלקיקים המרחף על החלק העליון של הפאזה המימית בעת שחזור הפאזה המיימית. בנוסף, מתווספים שני שלבי שטיפה עם 500 μL ו- 250 μL Wash Solution 2/3 כדי לסלק מזהמים בקרום המסנן לאיכות מיטבית. יתר על כן, חומר דגימת התחלה של יותר מ -200 מ"ג אינו מומלץ מכיוון שהוא עלול ליצור קושי בהיווצרות ברורה של אינטרפאזה. באופן דומה, חומר דגימה של פחות מ-25 מ"ג אי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים על היעדר אינטרסים כספיים רלוונטיים או מהותיים הקשורים לשיטת המחקר המתוארת במאמר פרוטוקול זה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קיבלנו סיוע טכני ממתקן הביופולימרים בבית הספר לרפואה של הרווארד לביואנליזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המחקר של האגודה הלאומית לטרשת נפוצה RG-1707-28516 (H.L.W. ו- S.L.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
חומצה-פנול: כלורופורם, pH 4.5 (עם IAA, 125:24:1)Thermo Fischer ScientificAM9720
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםThermo Fischer Scientific14190-144
כפפות
מיקרוצנטריפוגה
mirVana miRNA ערכת בידודThermo Fischer ScientificAM1561
צינורות מיקרוצנטריפוגה ללא נוקלאז (1.5 מ"ל, 2 מ"ל)
מים ללא נוקלאז (לא מטופלים ב-DEPC)Thermo Fischer ScientificAM9937
קצות פיפטור ופיפטות ללא נוקלאז (עם מסנן)
PowerLyzer 24 הומוגנייזרQIAGEN13155
RNaseZap RNase Deconservation SolutionThermo Fischer ScientificAM9780
מערבולת שייקר

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fecal RNA IsolationMicroRNA ExtractionAcid Phenol ChloroformRNA PurificationSample ResuspensionCentrifugation ProtocolFilter Cartridge WashNuclease Free WaterChip ElectrophoresisAbsorbance Ratio

Related Articles