מאמר שיטה

בידול תאי קודמן עצבי הנגרמת על ידי שדה חשמלי בהתקנים מיקרופלואידיים

DOI:

10.3791/61917

⸱

14 באפריל 2021

 ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang Ming Chao Tung University, 3Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 4College of Engineering, Chang Gung University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבידול של גזע עצבי ותאי אב (NPCs) המושרה אך ורק על ידי גירוי דופק זרם ישיר (DC) במערכת מיקרופלואידית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שדות חשמליים פיזיולוגיים (EF) ממלאים תפקידים חיוניים בנדידת תאים, בידול, חלוקה ומוות. מאמר זה מתאר מערכת תרבית תאים מיקרופלואידית ששימשה למחקר התמיינות תאים ארוך טווח באמצעות מיקרוסקופיה. המערכת המיקרופלואידית מורכבת מהרכיבים העיקריים הבאים: שבב אלקטרו-טקטי שקוף אופטית, תנור תחמוצת אינדיום-פח (ITO) שקוף, משאבת מילוי מדיה תרבותית, ספק כוח חשמלי, מגבר הספק בתדר גבוה, מולטיפלקסר EF, שלב ממונע X-Y-Z מתוכנת ומיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך המצויד במצלמה דיגיטלית. המערכת המיקרופלואידית מועילה לפישוט ההתקנה הניסיונית הכוללת, ובתורו, לצריכת ריאגנט ודגימה. עבודה זו כרוכה בהבחנה של גזע עצבי ותאי אב (NPCs) הנגרמת על ידי גירוי דופק זרם ישיר (DC). במדיום תחזוקת תאי גזע, העכבר NPCs (mNPCs) מובחן לנוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים לאחר גירוי הדופק DC. התוצאות מראות כי טיפול דופק DC פשוט יכול לשלוט על גורלם של mNPCs והוא יכול לשמש לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות עבור הפרעות במערכת העצבים. המערכת יכולה לשמש לתרבות תאים בערוצים מרובים, לגירוי EF לטווח ארוך, לתצפית מורפולוגית של תאים, ולרכישת תמונה אוטומטית בזמן לשגות. מערכת מיקרופלואידית זו לא רק מקצרת את זמן הניסוי הנדרש, אלא גם מגבירה את דיוק השליטה במיקרו-וירוס.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי מבשר עצבי (NPCs, הידוע גם בשם גזע עצבי ותאי אב) יכול להיות כמועמד מבטיח עבור אסטרטגיה טיפולית ניוונית1. NPCs מובחנת יש יכולת חידוש עצמי, רב עוצמה, ויכולת התפשטות2,3. מחקר קודם דיווח כי מטריצה חוץ תאית ומתווכים מולקולריים לווסת את הבידול של NPC. גורם הגדילה האפידרמלי (EGF) וגורם הגדילה הבסיסי פיברובלסט (bFGF) לקדם התפשטות NPC, ובכך לשמור על מצב מובחן4.

מחקרים קודמים דיווחו כי גירוי חשמלי יכול לווסת פעילויות פיזיולוגיות של התא כגוןחטיבה 5,הגירה 6,7,8, בידול1,9,10, ומוותתאים 11. שדות חשמליים (EFs) ממלאים תפקידים חיוניים בפיתוח והתחדשות של התפתחות מערכת העצבים המרכזית12,13,14. משנת 2009 עד 2019, מעבדה זו חקרה תגובות סלולריות ליישום EF במערכת המיקרופלואידית1,6,7,8,15,16,17. שבב רב-ערוצי, שקוף אופטית ואלקטרו-טקטי (MOE) תוכנן כך שיתאימו לכתם כשל חיסוני למיקרוסקופיה קונפוקלית. השבב היה בעל שקיפות אופטית גבוהה ועמידות טובה ואיפשר התנהלות סימולטנית של שלושה ניסויי גירוי עצמאיים ומספר תנאים אימונו-מוכתמים במחקר אחד. המערכת המיקרופלואידית מועילה לפישוט ההתקנה הניסיונית הכוללת, ובתורו, לצריכת ריאגנט ודגימה. מאמר זה מתאר את התפתחותה של מערכת תרבית תאים מיקרופלואידית ששימשה למחקר דיפרנציאציה ארוך טווח של תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנון והפיה של שבב MOE

  1. צייר דוגמאות מילוי לשכבות polymethyl methacrylate (PMMA) בודדות ולסרט הדו-צדדי באמצעות התוכנה המתאימה (איור 1A, טבלת החומרים). חותכים הן את יריעות ה-PMMA והן את הקלטת הדו-צדדית באמצעות סופר מכונת לייזר CO2 (איור 1B).
    1. הפעל את סופר הלייזר CO2 וחבר אותו למחשב אישי. פתח את קובץ התבנית המעוצב באמצעות התוכנה.
    2. הנח את יריעות ה- PMMA (275 מ"מ x 400 מ"מ) או סרט דו-צדדי (210 מ"מ x 297 מ"מ) על פלטפורמת סופר הלייזר (איור 2A). מקד את הלייזר על פני השטח של יריעות PMMA או על הסרט הדו-צדדי באמצעות כלי המיקוד האוטומטי.
    3. בחר את סופר הלייזר כמדפסת ולאחר מכן "הדפס" את התבנית באמצעות סופר הלייזר כדי להפעיל את אבלציה ישירה על גיליון PMMA או קלטת דו-צדדית ולקבל דפוסים בודדים בגיליון PMMA או בקלטת (איור 2B).
  2. הסר את סרט המגן מגליונות PMMA, ולנקות את פני השטח באמצעות גז חנקן.
    הערה: הציור של תבנית PMMA ועיבוד ישיר של גיליון PMMA בוצעו על פי דו"ח קודם17.
  3. לחיבור שכבות מרובות של יריעות PMMA, ערמו שלוש חתיכות של יריעות PMMA של 1 מ"מ (שכבות 1, 2 ו-3), וקשרו אותן בלחץ של 5 ק"ג/ס"מ2 בשוד תרמי למשך 30 דקות ב-110 מעלות צלזיוס ליצירת הרכבה של ערוץ זרימה/גירוי חשמלי(איור 2C).
    הערה: קבוצות שונות של גיליון PMMA שהושג מסחרית יש טמפרטורת מעבר זכוכית שונה במקצת (Tg). טמפרטורת מליטה אופטימלית צריך להיבדק במרווחים של 5 מעלות צלזיוס קרוב Tg.
  4. הדבק 12 חתיכות של מתאמים לפתחים הבודדים בשכבה 1 של מכלול שבב MOE עם דבק ציאנואקרילאט מהיר.
    הערה: המתאמים עשויים PMMA על ידי הזרקת דפוס. המשטחים השטוחים בתחתית מיועדים לחיבור לשבב MOE. המתאמים הנושאים חוט בורג נקבה של 1/4W-28 מיועדים לחיבור תקעים לבנים צמודים לאצבע, מחברים תחתונים שטוחים או מתאמי Luer. היזהר בעת שימוש בדבק ציאנואקרילאט מהיר. הימנע התזה לתוך העיניים.
  5. חטאו את מצעי PMMA בגודל 1 מ"מ (שכבות 1-3), את הסרט הדו-צדדי (שכבה 4) ואת PMMA בעל הדרגה האופטית 3 מ"מ (שכבה 5) באמצעות הקרנה אולטרה סגולה (UV) למשך 30 דקות לפני הרכבת השבב (איור 1A).
  6. דבק במצעי PMMA בגודל 1 מ"מ (שכבות 1-3) ב- PMMA בעל הכיתה האופטית של 3 מ"מ (שכבה 5) עם הקלטת הדו-צדדית (שכבה 4) כדי להשלים את הרכבת PMMA (שכבות 1.5) (איור 1A).
  7. מכינים את זכוכית הכיסוי הנקי למכלול על השבב.
    1. מלאו דילול פי עשרה של חומר הניקוי בצנצנת מכתימה (ראו טבלת החומרים),ונקו את זכוכית הכיסוי בחומר ניקוי זה באמצעות מנקה קולי למשך 15 דקות.
    2. לשטוף ביסודיות את צנצנת הכתמים תחת מי ברז זורמים כדי להסיר את כל העקבות של חומר הניקוי.
    3. המשך לשטוף במים מזוקקים כדי להסיר את כל העקבות של מי ברז, ולחזור על שלב 1.7.2 פעמיים.
    4. יבש את זכוכית הכיסוי המנוקה על ידי ניפוחה בגז חנקן.
  8. לחטא את מכלול PMMA (שכבות 1-5), את הסרט הדו-צדדי (שכבה 6) ואת זכוכית הכיסוי (שכבה 7) באמצעות הקרנת UV בתוך ארון biosafety במשך 30 דקות לפני הרכבת השבב (איור 1A).
  9. הדבק את זכוכית הכיסוי המנוקה (שכבה 7) להרכבת PMMA (שכבות 1.5) עם הקלטת הדו-צדדית (שכבה 6) (איור 1A).
  10. דגירה שבב MOE בתא ואקום לילה; השתמש בהרכבת שבב MOE עבור ההליכים הבאים (איור 3).

2. ציפוי פולי-ל-ליצין (PLL) על המצע באזורי תרבות התא

  1. הכינו את שפופרת הפוליטרפלואורואתילן, מחבר שטוח-תחתון, מחבר חרוט, מתאם חרוט-לואר, תקע לבן צמוד לאצבע (המכונה גם פקק), מתאם לואר, מזרק מנעול לואר ובאנג גומי שחור(איור 4A, לוח חומרים). לעקר את כל הרכיבים לעיל במובלעת אוטומטית ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  2. אטמו את פתחי מתאמי גשר אגר(איור 1A)באמצעות התקעים הלבנים הצמודים לאצבע. חבר את המחבר השטוח לתחתית למכלול שבבי MOE באמצעות מתאמי כניסת ושקעים בינוניים (איור 4B). חבר את מתאם החרוט-לואר לפסקי ה-3.
  3. הוסף 2 מ"ל של פתרון PLL של 0.01% באמצעות מזרק של 3 מ"ל שמתחבר לעצירה התלת-כיוונית של המפרצון הבינוני (איור 4B- figure-protocol-1 ).
  4. חבר מזרק ריק של 3 מ"ל לשקע התלת-כיווני(איור 4B figure-protocol-2 ).
  5. מלא את אזורי תרבות התאים בפתרון PLL. יש לשאוב ידנית את פתרון הציפוי קדימה ואחורה לאט. סגור את שני stopcocks 3-way כדי לאטום את הפתרון בתוך אזורי התרבות.
  6. דגירה שבב MOE ב 37 °C (60 °F) לילה באינקובטור מלא 5% CO2 אווירה.

3. הכנת רשת גשר המלח

  1. לאחר שלב 2.6, פתחו את שני המזרקים התלת-כיווניים וסמקו את הבועות בתעלות על ידי שאיבת פתרון הציפוי באופן ידני הלוך ושוב בערוץ באמצעות שני המזרקים.
  2. לצייר 3 מ"ל של מדיום מלא (תא גזע תחזוקה בינונית המורכבת של Dulbecco של שונה הנשר בינוני / Ham של תערובת תזונה F-12 (DMEM / F12), 2% B-27 תוספת, EGF של 20 ng/mL ו- 20 ng/mL bFGF) למזרק של 3 מ"ל שמתחבר לעצירה התלת-כיוונית של הכניסה הבינונית (איור 4B- figure-protocol-3 ואיור 4B- figure-protocol-4 ).
  3. הוסף 3 מ"ל של מדיום שלם כדי להחליף את פתרון הציפוי באזורי תרבות התא. חברו מזרק ריק של 5 מ"ל לשקע התלת-כיווני של השקע הבינוני (איור 4B- figure-protocol-5 ).
  4. הכינו את רשת גשר המלח (איור 5).
    1. חותכים את באנג הגומי השחור כדי לייצר רווח, ומכניסים את אלקטרודות הכסף (Ag)/כסף כלוריד (AgCl) דרך באנג הגומי השחור לתוך מזרק מנעול Luer(איור 4A).
    2. החליפו את התקע הלבן עם מתאם הלואר, והזריקו 3% אגרוז חם כדי למלא את מתאם הלואר.
      הערה: להכנת agarose חם, להמיס 3 גרם של אבקת agarose ב 100 מ"ל של מלוחים אגירה פוספט (PBS) ו לעקר אוטוקלאב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
    3. חבר את מזרק מנעול הלואר ומתאם הלואר. להזריק 3% חם agarose דרך באנג גומי שחור כדי למלא את מזרק מנעול לואר באמצעות המזרק עם מחט. אפשר 10 עד 20 דקות עבור agarose להתקרר ולחזק.
      הערה: כדי להגדיל את קיבולת הנפח של האגרוז, מזרק מנעול הלואר מותקן על מתאם הלואר(איור 4 ואיור 5). לאחר מכן, האלקטרודות הגדולות מוחדרות למזרק מנעול הלואר. האלקטרודה מסוגלת לספק גירוי חשמלי יציב לניסוי ארוך הטווח.

4. הכנת MNPCs

  1. תרבות mNPCs1 במדיום המלא בבקבוק תרבות תאים 25T ב 37 °C (69 °F) באינקובטור מלא 5% CO2 אווירה. תת-תרבות התאים כל 3-4 ימים, ולבצע את כל הניסויים עם תאים שעברו 3-8 קטעים מהמקור.
  2. להעביר את ההשעיה התא צינור חרוט 15 מ"ל, וספין למטה נוירוספרות ב 100 × גרם במשך 5 דקות. לשאוף את supernatant, ולשטוף את הנוירוספרות עם PBS של 1x Dulbecco (DPBS). ספין למטה נוירוספרות ב 100 × g במשך 5 דקות.
  3. לשאוף את 1x DPBS ולאחר מכן resuspend את הנוירוספרות במדיום המלא. מערבבים היטב ובעדינות.
  4. הוסיפו 1 מ"ל של ההשעיה הנוירוספרית באמצעות מזרק של 1 מ"ל שמתחבר לעצירה התלת-כיוונית של השקע(איור 4B- figure-protocol-6 ).

5. הגדרת המערכת המיקרופלואידית לגירוי פולס DC (איור 6)

  1. התקן את שבב MOE בעל זרעי התאים על תנור ITO השקוף המהודק על שלב ממונע X-Y-Z הניתן לתכנות.
    הערה: טמפרטורת פני השטח של ITO נשלטת על ידי בקר פרופורציונלי-אינטגרלי-נגזר ומתוחזקת בטמפרטורה של 37 °C (70 °F). תרמוקופול מסוג K מהודק בין השבב לתנור ITO כדי לפקח על הטמפרטורה של אזורי תרבות התא בתוך השבב. שבב MOE מותקן על שלב ממונע X-Y-Z לתכנות ומתאים לרכישת תמונה אוטומטית בזמן לשגות בקטעי ערוץ בודדים. הייצור של תנור ITO ואת ההתקנה של מערכת חימום תרבות התא תוארו בעבר18,19.
  2. להחדיר את mNPCs על ידי שאיבה ידנית לתוך שבב MOE דרך השקע הבינוני. דגירה שבב MOE זרעי תא על 37 °C ITO תנור עבור 4 שעות.
  3. לאחר 4 שעות, לשאוב את המדיום המלא דרך שבב MOE דרך כניסת בינוני בקצב זרימה של 20 μL / h באמצעות משאבת מזרק.
    הערה: mNPCs גדלים ומתוחזקים בשבב במשך 24 שעות נוספות לפני גירוי EF כדי לאפשר חיבור וצמיחה של התא. נוזל הפסולת נאסף במזרק ריק של 5 מ"ל המחובר לעצירה התלת-כיוונית של השקע, המוצגת כ"פסולת" באיור 6A. תצורת המערכת המיקרופלואידית של MOE מוצגת באיור 6. מערכת מיקרופלואידית זו מספקת אספקה רציפה של תזונה לתאים. המדיום הטרי המלא נשאב ללא הרף לתוך שבב MOE כדי לשמור על ערך pH קבוע. לכן, התאים יכולים להיות תרבית מחוץ לאינקובטור CO2.
  4. השתמש בחוטי חשמל כדי לחבר מולטיפלקסר EF לשבב MOE באמצעות אלקטרודות Ag / AgCl על השבב. חבר מולטיפלקסר EF ומחולל פונקציות למגבר כדי ליצור פולסים DC של גל ריבועי בעוצמה של 300 mV/mm בתדר של 100 הרץ במחזורי חובה של 50% (50% פסק זמן ו-50% פסק זמן)(איור 6B).
    1. חבר את חוטי החשמל למולטיפלקסר EF. חבר את חוטי החשמל לשבב MOE באמצעות האלקטרודות Ag/AgCl.
    2. חבר את מולטיפלקסר EF למגבר באמצעות חוטי חשמל. חבר את מחולל הפונקציות למגבר ולאוסצילוסקופ הדיגיטלי.
      הערה: מולטיפלקסר EF הוא מעגל הכולל את העכבה של תא התרבות במעגל ומחבר את כל התאים הבודדים ברשת אלקטרונית מקבילה. כל אחד משלושת תאי התרבות מחובר חשמלית בסידרה לנגד משתנה (Vr) ולאמטר (המוצג כ- μA באיור 6A)במוליך. הזרם החשמלי דרך כל תא תרבות משתנה על ידי שליטה Vr, ואת הזרם מוצג על ammeter המקביל. חוזק השדה החשמלי בכל אזור תרבות תאים חושב על ידי חוק אוהם, I = σEA, שבו אני הזרם החשמלי, σ (מוגדר כ- 1.38S·m-1 עבור DMEM / F1220) הוא המוליכות החשמלית של מדיום התרבות, E הוא השדה החשמלי, ו- A הוא האזור החתך של התא האלקטרו-טקי. עבור ממד אזור תרבות התא המוצג באיור 1, הזרם החשמלי הוא ~ 87 mA ו ~ 44 mA עבור DC ו- DC פולס ב 50% מחזור חובה, בהתאמה.
  5. הכפפ את ה- mNPCs לפולסים DC מרובעים בעוצמה של 300 mV/mm בתדר של 100 הרץ למשך 48 שעות. ברציפות לשאוב את המדיום המלא בקצב של 10 μL / h כדי לספק תזונה נאותה לתאים ולשמור על ערך pH קבוע באמצעי.

6. בדיקות אימונופלואורסצנטיות של mNPCs לאחר גירוי DC פעמו

הערה: בשלב זה, כל ריאגנט נשאב דרך כניסת בינונית באמצעות משאבת מזרק.

  1. לאחר 3, 7, או 14 ימים במבחנה (DIV) culturing לאחר זריעה1, לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 25 μL / min במשך 20 דקות.
  2. לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA). משאבה 4% PFA לתוך השבב בקצב זרימה של 25 μL / min במשך 20 דקות כדי להחליף את 1x PBS. כדי להחליף את 4% PFA, לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 25 μL / min במשך 20 דקות.
  3. משאבה 0.1% טריטון X-100 לתוך השבב בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 6 דקות כדי לחלחל התאים. להפחית את קצב הזרימה ל 50 μL / h במשך 30 דקות נוספות כדי להגיב עם התאים. כדי להחליף את 0.1% טריטון X-100, לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 6 דקות.
  4. חסום את התאים עם PBS המכיל 1% אלבומין סרום שור (BSA) כדי להפחית איגוד נוגדנים לא ספציפי. משאבה 1% BSA לתוך השבב בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 6 דקות. להפחית את קצב הזרימה ל 100 μL / h ומשאבה במשך 1 שעה.
  5. לשאוב את הנוגדנים עבור immunostaining כפול לתוך השבב בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 6 דקות, ולהדגיר את השבב במשך 18 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 15 דקות.
  6. לשאוב את הנוגדנים המשניים אלקסה פלואור מצומד לתוך השבב בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 6 דקות. להפחית את קצב הזרימה ל 50 μL / h, ולשאוב את הנוגדנים במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 15 דקות.
  7. עבור כתמים גרעיניים, משאבה Hoechst 33342 לתוך השבב בקצב זרימה של 20 μL / min במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 15 דקות.
  8. לאחר immunostaining, להתבונן בתאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal.

7. ניתוח תמונה ועיבוד נתונים

  1. נתח את התמונות הפלואורסצנטיות באמצעות תוכנה באמצעות כלי מדידה מובנים (ראה טבלת החומרים).
  2. השווה את הגרעינים המוכתמים על-ידי Hoechst (המספר הכולל של תאים) בקבוצות הבקרה והטיפול, וחשב את אחוז התאים המבטאים כל סמן פנוטיפי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התצורה המפורטת של שבב MOE מוצגת באיור 1. השבב המיקרופלואידי מספק גישה מועילה להפחתת גודל ההתקנה הניסיונית, נפח הדגימה ונפח ריאגנט. שבב MOE תוכנן לבצע שלושה ניסויי גירוי EF עצמאיים ומספר תנאים חיסוניים בו זמנית במחקר אחד (איור 3). בנוסף, שבב MOE, בעל שקיפות אופטית גבוהה, מתאים לבדיקות מיקרוסקופיות קונפוקל. שבב MOE נועד גם לחקור את ההשפעות של תנאים שונים של תרבות התא (למשל, גירוי EF מרובים, מספר תרופות, מצע ציפוי שונה, סדרות מרובות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך הייצור של שבב MOE, המתאמים מחוברים לשכבה 1 של שבב MOE עם דבק ציאנואקרילאט מהיר. הדבק מוחל על 4 פינות של המתאמים, ולאחר מכן הלחץ מוחל באופן שווה על המתאמים. יש להימנע מכמות עודפת של דבק כדי להבטיח פולמור מלא של הדבק. יתר על כן, הרכבת שבב MOE הושלמה הוא דגירה בתא ואקום. שלב זה מסייע בהסרת הבועות בין שכבת PMMA, הסרט הדו-צדדי וזכוכית הכיסוי.

הבחירה בחומר האלקטרודה מבוססת על העובדה כי יוני כלוריד, הנמצאים בשפע במדיום, הם המוצרים האלקטרוליטיים הזורמים באזור תרבות התא. במהלך ניסוי גירוי EF, ה- ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לפרופסור טאנג ק. טאנג, המכון למדעים ביו-רפואיים, אקדמיה סיניקה, על עזרתו במתן גזע עצבי עכבר ותאי אב (mNPCs). המחברים מודים גם לפרופסור טאנג ק. טאנג ולגברת יינג-שאן לי, על הדיון החשוב שלהם על הבידול של MNPCs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מצעי PMMA 1 מ"מ (שכבות 1-3)BHTK2R20פולימתיל מתאקרילט (PMMA),
http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html צינור פלסטיק 15 מ"לProtech Technology Enterprise Co., LtdCT-15-PL-TWצינור תחתון חרוטי עם מכסה, מורכב, מעוקר מראש
מזרק 3 מ"לTERUMODVR-3413מזרקים אוראליים 3 מ"ל, ללא מחט
3 מ"מ PMMA בדרגה אופטית (שכבה 5)CHI MEI CorporationACRYPOLY PMMA גיליוןבדרגה אופטית
NIPRONCN-3Lחד פעמי תלת כיווני
מזרק 5 מ"לTERUMODVR-34105 מ"ל מזרקים אוראליים, ללא מחט
מתאםDong Zhong Co., Ltd.מתאם PMMAמותאם אישית
AgaroseSigma-AldrichA9414Agarose, מגבר טמפרטורת ג'ל נמוכה
A.A. Lab Systems LtdA-304מגבר מתח גבוה
תוכנת AutoCADAutodeskגרסה חינוכיתשרטוט
תוסף B-27 תוסףGibco12587-010תוסף B-27 (פי 50), מינוס ויטמין A
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) פפרוטקAF-100-18Bנקרא גם רקומביננטי אנושי FGF-בסיסי
באנג גומי שחורTERUMODVR-3413ממזרקים אוראליים של 3 מ"ל, ללא מחט
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-AldrichB4287מגיב חוסם 
צנטריפוגהHSIANGTAICV2060צנטריפוגה
CO2 סופר לייזרLaser Tools and Technics Corp. ILS-IIנרכש ממחבר חרוט http://www.lttcorp.com/index.htm
IDEX Health & ScienceF-120Xמקשה אחת אטומה לאצבעות 10-32 קונוסים, עבור מתאם 1/16 אינץ' טבעי OD
Cone-LuerIDEX Health & ScienceP-659Luer Adapter 10-32 נקבה לנקבה Luer,
PEEK מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקליLeica MicrosystemsTCS SP5Leica TCS SP5 מדריך למשתמש, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
מצלמה דיגיטליתOLYMPUSE-330רכישת תמונות אוטומטיות בזמן-lapse
אוסילוסקופ דיגיטליTektronixTDS2024מדוד אותות מתח או זרם לאורך זמן במעגל אלקטרוני או ברכיב כדי להציג משרעת ותדר.
סרט דו צדדי3M PET 8018נרכש מ- http://en.thd.com.tw/
Dulbecco' s שונה Eagle' s medium/Ham's nutrient blend F-12 (DMEM/F12)Gibco12400024-DMEM/F-12, אבקה,
תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) של HEPES Dulbecco21600010-DPBS, אבקה, ללא סידן, ללא מגנזיום
מרבב EFAsiatic Sky Co., Ltd.מותאם אישיתניטור ובקרה של הזרם החשמלי בערוצים בודדים
גורם גדילה אפידרמיס (EGF)PeprotechAF-100-15נקרא גם EGF אנושי רקומביננטי
דבק ציאנואקרילט מהיר פעולה3M 7004Tחוזק דבק מיידי (נוזלי)
מחבר תחתון שטוחIDEX Health & מדעP-206אגוז זכר ללא אוגן Delrin, 1/4-28 תחתית שטוחה, עבור מחולל פונקציות OD כחול 1/16 אינץ'
Agilent Technologies33120Aביצועים גבוהים 15 מגה-הרץ מסונתז  מחולל פונקציות  עם יכולת צורת גל שרירותית מובנית
עז נגד עכבר IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150117עז נגד עכבר IgG H& L (Alexa Fluor 488) נספג מראש
עיזים נגד ארנב IgG H& L (Alexa Fluor 555)Abcamab150086נוגדן משני פוליקלונלי עז לארנב IgG - H& L (Alexa Fluor 555), נספג מראש
Hoechst 33342InvitrogenH3570צביעה גרעינית
תוכנת ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות1.48vנתח את התמונות הפלואורסצנטיות 
אינדיום– פח – תחמוצת (ITO) זכוכיתMerck300739למחמם ITO
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוךOLYMPUSCKX41לתצפית מורפולוגיה של תאים
צמד תרמי מסוג KTecpelTPK-02Aטמפרטורה  צמדים תרמיים
מתאם LuerIDEX Health & מדעP618-01מתאם לואר נקבה לואר ל 1/4-28 זכר פוליפרופילן
לואר מנעול מזרקTERUMODVR-3413עבור גשרי מלח אגר
עכבר אנטי-GFAPeBioscience14-9892סמן אסטרוציטים
אוליגודנדרוציטים   סמן  O4  נוגדניםR& D SystemsMAB1326סמן אוליגודנדרוציטים
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148תיקון  סוכן
פוספט חוצץ מלח (PBS)Basic LifeBL2651תמיסת כביסה
פולי-L-ליזין (PLL)SIGMAP4707תמיסת ציפוי
עובי משקפיים כיסוי מדויק מס' 1.5HMARIENFELD107242https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
לתכנות XYZ שלב ממונעTanlian Incמותאם אישיתנרכש מ http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
פרופורציונלי– אינטגרל– בקר נגזרת (PID)Toho ElectronicsTTM-J4-R-ABבקר טמפרטורה 
צינור PTFEפלסטיק מקצועי בע"מ סניף טייוואןקוטר חיצוני 1/16 אינץ 'צינורות PTFE שקופים לבן
ארנב אנטי-Tuj1Abcamab18207סמן נוירון
משאבת מזרקEra Systems IncNE-1000NE-1000 משאבת מזרק יחיד לתכנות
TFD4 חומר ניקויFRANKLABTFD4כיסוי מנקה זכוכית
מחבר תרמיקואן-מין טק ושות 'מותאם אישיתשנרכש מ- http://kmtco.com.tw/
Triton X-100Sigma-AldrichT8787תמיסה חדירה
מנקה אולטרסאונדLEOLEO-300Sשואב סטרי אולטרסאונד
תא ואקוםDENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.תנור ייבוש ואקוםDOV-30
תקע אטום לבןIDEX Health & מדעP-3161/4-28 תחתית שטוחה, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html
PMMA תלת כיווני סטרילי New

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).
  2. Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
  3. Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
  4. Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
  5. Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
  6. Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094(2019).
  7. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116(2012).
  8. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
  9. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
  10. Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
  11. Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
  12. Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
  13. Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
  14. Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
  15. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928(2011).
  16. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
  17. Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340(2015).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
  19. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105(2008).
  20. Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
  21. AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738(2011).
  22. Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XYZIndium Tin Oxide

מאמרים קשורים