מאמר שיטה

קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי

DOI:

10.3791/61923

⸱

6 ביוני 2021

 , 
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine, 2Current Address: Department of Biological Sciences, University of Southern California, 3Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה להכנה והדמיה חיה של תמציות ציטופלסמיות לא מדוללות מביצי Xenopus laevis .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמציות הביצים של Xenopus laevis , המשמשות באופן מסורתי למבחנים ביוכימיים בתפזורת, התגלו ככלי רב עוצמה המבוסס על הדמיה לחקר תופעות ציטופלסמיות, כגון ציטוקינזיס, היווצרות צירים מיטוטיים והרכבת הגרעין. בהתבסס על שיטות מוקדמות שדיימו תמציות קבועות שנדגמו בנקודות זמן דלילות, גישות אחרונות לתמציות חיות של תמונות באמצעות מיקרוסקופיה של קיטועי זמן, וחושפות תכונות דינמיות יותר עם רזולוציה טמפורלית משופרת. שיטות אלה דורשות בדרך כלל טיפולי שטח מתוחכמים של כלי ההדמיה. כאן אנו מציגים שיטה חלופית להדמיה חיה של תמציות ביצים שאינן דורשות טיפול כימי בפני השטח. הוא פשוט ליישום ומשתמש בחומרים מתכלים מעבדתיים בייצור המוני להדמיה. אנו מתארים מערכת שיכולה לשמש הן למיקרוסקופיה רחבת שדה והן למיקרוסקופיה קונפוקלית. הוא מיועד להדמיית תמציות בשדה דו-ממדי (דו-ממדי), אך ניתן להרחיבו בקלות להדמיה בתלת-ממד. הוא מתאים היטב לחקר היווצרות תבניות מרחביות בתוך הציטופלסמה. בעזרת נתונים מייצגים, אנו מדגימים את הארגון הדינמי הטיפוסי של מיקרוטובולים, גרעינים ומיטוכונדריה בתמציות אינטרפאזה שהוכנו בשיטה זו. נתוני תמונה אלה יכולים לספק מידע כמותי על דינמיקה ציטופלסמית וארגון מרחבי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הציטופלסמה מהווה את הנפח העיקרי של התא ויש לה ארגון מובחן. המרכיבים של הציטופלסמה האאוקריוטית יכולים להרכיב את עצמם למגוון רחב של מבנים מרחביים, כגון אסטרים מיקרוטובולים ומנגנון גולג'י, אשר בתורם מסודרים באופן דינמי ומתהפכים בהתאם לזהות התא ולמצבו הפיזיולוגי. הבנת הארגון המרחבי של הציטופלסמה והקשר שלה לתפקודים תאיים חשובה אפוא להבנת אופן הפעולה של התא. תמציות ביצים של Xenopus laevis שימשו באופן מסורתי למבחנים ביוכימיים בתפזורת 1,2,3,4,5,6,7,8, אך עבודה אחרונה מבססת אותן כמערכת הדמיה חיה רבת עוצמה למחקרים מכניסטיים של מבנים ציטופלסמיים ותפקודם התאי 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. תמציות לא מדוללות אלה משמרות מבנים ותפקודים רבים של הציטופלסמה, תוך שהן מאפשרות מניפולציות ישירות של תוכן ציטופלסמי שאינו ניתן להשגה במודלים קונבנציונליים מבוססי תאים19,20. זה הופך אותם לאידיאליים לאפיון תופעות ציטופלסמיות ולניתוח היסודות המכניסטיים שלהם.

שיטות קיימות להדמיה של תמציות דורשות שינויים כימיים בפני השטח, או ייצור של התקנים מיקרופלואידיים. שיטה אחת המבוססת על כיסוי דורשת פסיבציה של פוליאתילן גליקול (PEG) של כיסויי זכוכית21. שיטה מבוססת מיקרו-אמולסיה דורשת תצהיר אדים של טריכלורו(1H,1H,2H,2H-פרפלואורוקטיל)סילאן על משטחי זכוכית22,23. מערכות מבוססות מיקרופלואידיקה מאפשרות שליטה מדויקת בנפח, בגיאומטריה ובהרכב של טיפות החילוץ, אך דורשות מתקני מיקרו-פבריקציה מיוחדים11,12,24.

כאן אנו מציגים שיטה חלופית להדמיית תמציות ביצים קלה ליישום ומשתמשת בחומרים זמינים ובעלות נמוכה. זה כולל הכנת תא הדמיה עם שקופית וכיסוי מצופה בסרט אתילן פרופילן פלואוריד (FEP). התא יכול לשמש להדמיית תמציות עם מגוון מערכות מיקרוסקופיה, כולל סטריאוסקופים ומיקרוסקופים זקופים והפוכים. שיטה זו אינה דורשת טיפול כימי במשטחים תוך השגת בהירות אופטית דומה המתקבלת בשיטות קיימות מבוססות זכוכית שנדונו לעיל. הוא נועד לדמות שכבה של תמציות בעובי אחיד על פני שדה דו-ממדי, וניתן להרחיב אותו בקלות כדי לדמות נפח תלת-ממדי של תמציות. הוא מתאים היטב להדמיה בהילוך מהיר של התנהגות ציטופלסמית קולקטיבית על פני שדה ראייה גדול.

השתמשנו בתמציות ביצים שנעצרו על ידי אינטרפאזה כדי להדגים את שיטת ההדמיה שלנו. הכנת התמצית עוקבת אחר הפרוטוקול של דמינג וקורנבלות'19. בקצרה, ביצים שנעצרו באופן טבעי במטאפאזה של מיוזה II נמעכות על ידי ספין במהירות נמוכה. ספין זה משחרר את הציטופלסמה ממעצר מיוטי ומאפשר לתמצית להמשיך לאינטרפאזה. בדרך כלל, ציטוכלזין B מתווסף לפני ספין הריסוק כדי לעכב היווצרות F-אקטין. עם זאת, ניתן להשמיט אותו אם רוצים F-actin. ציקלוהקסימיד מתווסף גם לפני ספין הריסוק כדי למנוע מתמצית האינטרפאזה להיכנס למיטוזה הבאה. התמציות ממוקמות לאחר מכן בתאי ההדמיה הנ"ל ומונחות על מיקרוסקופ. לבסוף, תמונות מתועדות לאורך זמן במרווחי זמן מוגדרים על ידי מצלמה המחוברת למיקרוסקופ, ומייצרות סדרות תמונות בהילוך מהיר הלוכדות את ההתנהגות הדינמית של התמצית בשדה דו-ממדי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת סטנפורד.

1. הכנת שקופיות וכיסויים

  1. החל שכבה של סרט דבק אתילן פרופילן פלואוריד (FEP) על מגלשת זכוכית עם אפליקטור רולר. חותכים סרט הדבקה מוגזם על הקצוות בעזרת סכין גילוח נקי. הכינו כיסויים מצופים בנייר דבק FEP באותו אופן (איור 1A).
  2. החל מרווח הדמיה דביק דו-צדדי על הצד המצופה בסרט FEP של השקופית. השאירו את תוחם המגן בחלק העליון ללא כיסוי (איור 1A).
    הערה: יש להכין את השקופיות והכיסויים לפני הניסוי. ניתן להשתמש בהם באופן מיידי, או לאחסן אותם בקופסאות כדי למנוע הצטברות אבק על משטחים. עומק הבאר במרווח ההדמיה הוא 120 מיקרומטר וקוטרה 9 מ"מ.

2. הכנה והדמיה חיה של תמציות ביצים שנעצרו על ידי אינטרפאזה

הערה: הפרוטוקול הבא מותאם מדמינג וקורנבלות'19, מאריי20, סמיית' וניופורט25 עם שינויים. יש לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת.

  1. שלושה עד עשרה ימים לפני איסוף הביצים, יש להזריק נקבות בוגרות של צפרדעי Xenopus laevis באופן תת-עורי לתוך שק הלימפה הגבי עם 100 יחב"ל של גונדוטרופין בסוסה הרה (PMSG).
  2. שש עשרה עד שמונה עשרה שעות לפני איסוף הביצים המתוכנן, הזריקו לצפרדעים משלב 2.1 500 יחב"ל של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG). השאירו צפרדעים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס במאגר הטלת ביצים (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2.5 mM CaCl 2·2H2 O, 0.5 mMHEPES, 0.1 mM EDTA, הכינו כפתרון מלאי 20x ב- pH7.4 ודללו עם מי מיכל צפרדע נקיים עד פי 1 לפני השימוש) עד לאיסוף הביצים.
  3. ביום הניסוי, אספו ביצים בצלחת פטרי זכוכית גדולה ובדקו את איכות הביצים. השליכו את כל הביצים שנראות כמו כדורים לבנים נפוחים או מופיעות בחוט (איור 1B). בחנו את הביצים תחת סטריאוסקופ, שמרו על הביצים בעלות מראה תקין (איור 1C), והשליכו אותן עם פיגמנט לא סדיר או מנומר (איור 1D).
    הערה: פרוטוקול זה עובד עם ביצים שנאספו מצפרדע בודדת, אשר בדרך כלל מטילה 25 מ"ל של ביצים על ידי 16 שעות לאחר הזרקת hCG. בדרך כלל, סך של 3 עד 6 צפרדעים מושרות על ידי hCG, ואת הצפרדע עם איכות הביצים הגבוהה ביותר נבחר לניסוי הכנת תמצית.
  4. מעבירים ביצים לכוס זכוכית של 400 מ"ל, ומסירים כמה שיותר חיץ מטיל ביצים על ידי פירוק.
  5. לדגום את הביצים ב-100 מ"ל של תמיסת דג'ל טרייה (2% עם L-ציסטאין במים, להסתגל ל-pH 8.0 עם NaOH) ולסובב אותן בעדינות מעת לעת. לאחר כ-3 דקות, יוצקים את התמיסה, ומוסיפים 100 מ"ל של תמיסת דג'לי טרייה. ממשיכים את הדגירה עד שהביצים ארוזות היטב (אין רווח בין הביצים), אך הימנעו מהשארת ביצים בתמיסת הפסולת למשך יותר מ-5 דקות בסך הכל.
  6. הסר כמה שיותר מתמיסת ההרגעה על ידי פירוק, ושטוף את הביצים בחיץ MMR 0.25x (25 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 0.25 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl2, 0.025 mM EDTA, 1.25 mM HEPES, מוכן כתמיסת מלאי 10x, מותאם ל- pH 7.8 עם NaOH, ומדולל במי Milli-Q לפני השימוש) על ידי הוספת המאגר, מערבלים את הביצים, ואז שופכים את החיץ. חזרו על הפעולה מספר פעמים עד לשימוש כולל של 1 ליטר מהמאגר לשטיפה.
  7. שטפו את הביצים מספר פעמים עם סך של 400 מ"ל של חיץ ליזיס ביצים (250 מ"מ סוכרוז, 10 מ"ל HEPES, 50 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ MgCl2, 1 mM DTT, עשוי טרי ומותאם ל- pH 7.7 עם KOH). הסר ביצים עם מראה חריג באמצעות פיפטה פסטר בין השטיפות.
    הערה: ביצים עם מראה לא תקין מתייחסות לאלה שנראות כמו כדורים נפוחים לבנים (איור 1B), שיש להן פיגמנטציה מנומרת (איור 1D), מתדרדרות עם אזור לבן שגדל (איור 1E), או מראות אזור פיגמנטי כהה ומכווץ בחצי הכדור של בעלי החיים (איור 1F).
  8. באמצעות פיפטה העברה עם קצה פתוח לרווחה, מעבירים את הביצים לצינור צנטריפוגה עגול-תחתון 17 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חיץ ליזיס ביצים. סובבו את הצינור בצנטריפוגה קלינית בגודל 400 x גרם למשך 15 שניות כדי לארוז את הביצים.
  9. הסירו כמה שיותר ממאגר התסיסה של הביצים מהחלק העליון של ביצים ארוזות בעזרת פיפטה של פסטר.
    הערה: חשוב להסיר כמה שיותר חיץ מהביצים הארוזות, על מנת למזער את דילול תמצית הביצית. לפעמים יש צורך להסיר כמה ביצים רופפות יחד עם החיץ השיורי כדי להשיג זאת.
  10. קבעו את הנפח המשוער של הביצים הארוזות, ולאחר מכן הוסיפו 5 מיקרוגרם/מ"ל אפרוטינין, 5 מיקרוגרם/מ"ל לאופטין, 5 מיקרוגרם/מ"ל ציטוכלזין B ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסימיד ישירות על גבי הביצים הארוזה.
    הערה: אפרוטינין ולאופפטין הם מעכבי פרוטאז. ציטוכלזין B מעכב פולימריזציה של אקטין, ומונע מהתמצית להתכווץ ולג'ל26. ציקלוהקסימיד מעכב סינתזת חלבונים, ובכך שומר על התמצית באינטרפאזה של מחזור התא.
  11. מרסקים את הביצים על ידי צנטריפוגה של הצינור ב 12,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, במשך 15 דקות, ברוטור דלי מתנדנד.
    הערה: בסוף הצנטריפוגה, הביצים היו צריכות להיקרע והליזאט הופרד לשלוש שכבות עיקריות: שכבת שומנים צהובה למעלה, תמצית ציטופלסמית (הנקראת גם תמצית גולמית) באמצע, ושכבה צפופה כהה המכילה את גרגירי הפיגמנט בתחתית (איור 1G).
  12. חברו מחט באורך 18 מ"מ למזרק. כאשר שיקוע קצה המחט פונה כלפי מעלה, לנקב את הצינור מהצד בתחתית השכבה הציטופלסמית, ולשחזר את התמצית על ידי ציור לאט.
    הערה: יש לשאוב את התמצית הציטופלסמית באיטיות כדי למנוע הכללה של תוכן מזהם משכבת השומנים הצהובה.
  13. העבירו את התמצית הציטופלסמית המשוחזרת לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש והחזיקו אותה על קרח. השתמש בתמצית תוך שעה.
  14. כשאתם מוכנים לתמונה, השלימו את התמצית עם הריאגנטים הרצויים ובדיקות הדמיה פלואורסצנטיות.
    הערה: בדיקות הדמיה פלואורסצנטיות מסמנות מבנים ציטופלסמיים ספציפיים כך שניתן לדמיין אותם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  15. הסר את תוחם המגן העליון ממרווח ההדמיה בשקופית שהוכנה בשלב 1.2, והפקיד כ -7 μL של תמצית במרכז הבאר. יש למרוח מיד את הכיסוי המצופה בנייר דבק של FEP כאשר צד ה-FEP פונה לתמצית כדי לאטום את הבאר. המשיכו במהירות להדמיה (איור 1H,I).
  16. הנח את המגלשה על מיקרוסקופ הפוך או זקוף עם במה ממונעת ומצלמה דיגיטלית. צלמו את החלציות במיקומים המרחביים ובמרווחי הזמן הרצויים, הן בערוצי השדה הבהיר והן בערוצים הפלואורסצנטיים.
    הערה: בדרך כלל, מטרה פי 5 משמשת להדמיה. השלב הממונע מאפשר קליטת תמונה אוטומטית במספר מיקומים מרחביים מוגדרים. מיקרוסקופיית שדה בהיר מדמיינת מבנים ציטופלסמיים עם דרגות שונות של שקיפות. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ממחישה את המבנים הציטופלסמיים שסומנו במיוחד על ידי בדיקות ההדמיה הפלואורסצנטיות שנוספו בשלב 2.14. המצלמה מתעדת תמונות בהילוך מהיר של מבנים אלה, ובכך לוכדת את הדינמיקה של הארגון הציטופלסמי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להשתמש בתמציות ביצים של Xenopus laevis כדי לחקור את הארגון העצמי של הציטופלסמה במהלך interphase. איור 2A מראה תוצאות מניסוי מוצלח. הוספנו תמציות אינטרפאזה עם גרעיני זרע 19 שעברו דה-ממברן של Xenopus laevis בריכוז של 27 גרעינים/μL ו-GST-GFP-NLS מטוהרים בנפח של 0.38 מיקרומטר בריכוז של 27,28,29,30 (חלבון היתוך המורכב מגלוטתיון-S-טרנספראז

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמציות הביצים של Xenopus laevis התגלו כמערכת מודל רבת עוצמה למחקרים מבוססי הדמיה של מבנים תת-תאיים שונים 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 וארגון ציטופלסמי בכללותו

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'יי קמנץ, י' צ'ן וו' י' סי הואנג על הערותיהם על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM110564, P50 GM107615 ו- R35 GM131792) שהוענקו לג'יימס א. פרל הבן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
17 מ"ל צינור צנטריפוגהבקמן קולטר337986
22x22 מ"מ מרובע #1 כיסוי זכוכיתקורנינג284522
אפרוטיניןמיליפורסיגמאמעכב פרוטאז10236624001
ציקלוהקסימידMilliporeSigma01810מעכב סינתזת חלבון
ציטוכלזין BMilliporeSigmaC6762אקטין מעכב פילמור
נקבה Xenopus laevis צפרדעיםNascoLM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 עם תווית חלבון טובוליןCytoskeleton, Inc.TL488M-Aלהמחשת שלד התא של המיקרו-צינוריות
פלואורסצנטי HiLyte 647 שכותרתו חלבון טובוליןCytoskeleton, Inc.TL670M-Aלהמחשת שלד הציטו של המיקרו-צינוריות
אתילן פרופילן פלואור (FEP) קלטת שקופה אופטיתCS Hyde Company23-FEP-2-5
זכוכית פסטרפיפטה פישר סיינטיפיק13-678-20C
גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG)MilliporeSigmaCG10
מרחב הדמיהמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית70327-8S
לופפטיןMilliporeSigma11017101001מעכב פרוטאז
מיקרוסקופ שקופיות פישרסיינטיפיק12-518-100B
שמן מינרליMilliporeSigma330760
MitoTracker אדום CMXRosThermo Fisher ScientificM7512להדמיית מיטוכונדריה
סוסה בהריון סרום גונדוטרופין (PMSG)BioVendorRP1782725000
מוליך רולראמזוןB07HMBJSP8למריחת סרט ה-FEP על שקופיות הזכוכית והכיסויים
סכיני גילוח חד-פיפיותסיינטיפיק12-640להסרת קלטת FEP מוגזמת
העברת פיפטהפישר סיינטיפיק13-711-7M
פישר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
  2. Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
  3. Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
  4. Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
  5. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
  6. Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
  7. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
  8. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
  9. Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
  10. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  11. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  12. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
  13. Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
  14. Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
  15. Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
  16. Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
  17. Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
  18. Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
  19. Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
  20. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  21. Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  22. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
  23. Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240(2018).
  24. Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  25. Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
  26. Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).
  27. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
  28. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  29. Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
  30. Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
  31. Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
  32. Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
  33. Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
  34. Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
  35. Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
  36. Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
  37. Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
  38. Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  39. Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XenopusFEPTime lapse

מאמרים קשורים