הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

7.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61924

⸱

17 בנובמבר 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2University of Maryland Insect Transformation Facility, The Institute for Bioscience and Biotechnology Research

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

תקציר

זבובי חול הם הווקטורים הטבעיים של מיני לישמניה, טפילי פרוטוזואן המייצרים קשת רחבה של תסמינים החל בנגעים עוריים ועד פתולוגיה קרבית. פענוח אופי האינטראקציות הווקטוריות/טפיליות הוא בעל חשיבות עליונה להבנה טובה יותר של שידור לישמניה למארחיהם. בין הפרמטרים השולטים ביכולת וקטור זבוב החול (כלומר היכולת שלהם לשאת ולהעביר פתוגנים), פרמטרים מהותיים לחרקים אלה הוצגו לשחק תפקיד מפתח. תגובת חיסון חרקים, למשל, משפיעה על יכולת וקטור זבוב חול לישמניה. המחקר של פרמטרים כאלה הוגבל על ידי היעדר שיטות של שינוי ביטוי גנים מותאם לשימוש באורגניזמים אלה שאינם מודל. הסרת רגולציה של גנים על ידי RNA מפריע קטן (siRNA) אפשרית, אך בנוסף להיותה מאתגרת מבחינה טכנית, ההשתקה מובילה לאובדן חלקי בלבד של תפקוד, שלא ניתן להעביר מדור לדור. mutagenesis ממוקד על ידי טכנולוגיית CRISPR / Cas9 הותאם לאחרונה זבוב חול פפטאסי Phlebotomus. טכניקה זו מובילה ליצירת מוטציות הניתנות להעברה במקום שנבחר במיוחד, ומאפשרת לחקור את הגנים המעניינים. מערכת CRISPR/Cas9 מסתמכת על אינדוקציה של הפסקות דנ"א דו-גדילי ממוקדות, שתוקנה מאוחר יותר על ידי הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) או על ידי תיקון מונחה הומולוגיה (HDR). NHEJ מורכב מסגירה פשוטה של ההפסקה ולעתים קרובות מוביל לאירועי הוספה/מחיקה קטנים. לעומת זאת, HDR משתמש בנוכחות של מולקולת DNA תורמת שיתוף הומולוגיה עם ה-DNA היעד כתבנית לתיקון. כאן, אנו מציגים שיטת microinjection עובר זבוב חול עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 באמצעות NHEJ, שהיא טכניקת שינוי הגנום היחידה המותאמת וקטורים זבוב חול עד כה.

מבוא

מחלות המועברות על ידי וקטור מהוות איום מרכזי על בריאות הציבור באבולוציה מתמדת. מאות מינים וקטוריים הפרוסים על פני משפחות פילוגניות שונות מאוד (למשל, יתושים, קרציות, פרעושים) אחראים להעברת מספר עצום של פתוגנים מיקרוביאליים, וכתוצאה מכך יותר מ -700,000 מקרי מוות של בני אדם בשנה, על פי ארגון הבריאות העולמי. בין חרקים וקטוריים, זבובי חול פלבוטומין (דיפטרה, פסיכודידיה) מהווים קבוצה עצומה, עם 80 מינים וקטורים מוכחים המציגים תכונות פנוטיפיות מובהקות ויבולות וקטוריות שנמצאו באזורים גיאוגרפיים שונים. הם וקטורים עבור טפילי פרוטוזואן של הסוג לישמניה, גורם סביב 1.3 מיליון מקרים חדשים של לישמניאסים בין 20,000 ל 30,000 מקרי מוות בשנה. התוצאות הקליניות של לישמניאס מגוונות, עם תסמינים הנעים בין נגעים עוריים המגבילים את עצמם ועד להפצה הקרביים שהיא קטלנית בהיעדר טיפול.

זבובי חול הם חרקים יבשתיים לחלוטין. מחזור החיים שלהם, ארוך יחסית לדיפטרה אחרת, נמשך עד שלושה חודשים, בהתאם לפרמטרים שונים כגון טמפרטורה, לחות ותזונה. הוא מורכב משלב עוברי אחד (6 עד 11 ימים), ארבעה שלבי זחל (הנמשכת בסך הכל 23 עד 25 ימים) ושלב פופי אחד (9 עד 10 ימים) ואחריו מטמורפוזה ולאחר מכן בגרות. זבובי חול דורשים סביבה לחה וחמה לגידול. זכרים ונקבות כאחד ניזונים מסוכרים, המתקבלים בטבע מצוף פרחים. רק נקבות הן מאכילות דם, שכן הן דורשות חלבונים המתקבלים מארוחת הדם לייצור ביצים1.

מוקד מחקר חשוב הוא לזהות את אופי האינטראקציות הווקטוריות/טפיליות המובילות להתפתחות זיהומים הניתנים להעברה. כמו חרקים וקטוריים אחרים, פרמטרים מהותיים לזבובי חול הוכחו כמשפיעים על יכולתם הווקטורית, המוגדרת כיכולתם לשאת ולהעביר פתוגנים למארחיהם. לדוגמה, הביטוי של גלקטינים על ידי חול פפטאסי Phlebotomus לטוס תאים midgut, מתנהג כמו קולטנים זיהוי רכיבים משטח טפיל, יכול להשפיע ישירות על היכולת הווקטורית שלהם עבור Leishmania גדול2,3. מסלול התגובה החיסונית חרקים, מחסור במערכת החיסון (IMD), הוא גם חיוני עבור Phlebotomus papatasi חול זבוב וקטור יכולת עבור לישמניה גדול4. תפקיד קריטי עבור מסלולי תגובה חיסונית חרקים וקטוריים בשליטה על העברתם של פתוגנים זיהומיות דווח באופן דומה יתושים Aedes aegypti 5,6,7, ב tsetse לטוס Glossina morsitans8, וב Anopheles gambiae יתושים 9,10.

מחקרים על זבוב חול / אינטראקציותלישמניה הוגבלו על ידי היעדר שיטות לשינוי ביטוי גנים המותאמות לשימוש בחרקים אלה. רק הסרת רגולציה של גנים על ידי RNA מפריע קטן (siRNA)בוצעה 11,12,13,14 עד לאחרונה. הטכניקה, המוגבלת על ידי התמותה הקשורה למיקרו-אינג'ים של נקבות בוגרות, מובילה רק לאובדן חלקי של תפקוד, שלא ניתן להעביר מדור לדור.

טכנולוגיית CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה במחקר הגנומי הפונקציונלי באורגניזמים שאינם מדגמים כגון זבובי חול. שונה ממערכת החיסון האדפטיבית בפרוקריוטים להגנה מפני בקטריופאג'ים15,16, מערכת CRISPR Cas9 הותאמה במהירות ככלי לעריכת גנום לאורגניזמים אוקריוטיים מעולים, כולל חרקים. העיקרון של עריכת גנום ממוקד CRISPR/Cas9 מבוסס על המשלימות של RNA מדריך יחיד (sgRNA) לוקוס גנומי ספציפי. גרעין Cas9 נקשר לסגנ"א ויוצר שבירת דנ"א דו-גדילי (dsDNA) בדנ"א הגנומי שבו הסג'רנה מתחבר לרצף המשלים שלו. קומפלקס Cas9-sgRNA מונחה לרצף היעד על ידי 17 עד 20 בסיסים משלימים בסגנ"א למוקד הנבחר, ניתן לתקן את הפסקת dsDNA על ידי שני מסלולים עצמאיים: הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) או תיקון מונחה הומולוגיה (HDR)17. תיקון NHEJ כרוך בסגירה פשוטה של ההפסקה אך לעתים קרובות מוביל לאירועי הוספה/מחיקה קטנים. תיקון דנ"א באמצעות HDR משתמש במולקולת דנ"א תורמת החולקת הומולוגיה עם הדנ"א של המטרה כתבנית לתיקון. חרקים מחזיקים בשתי המכונות.

טכנולוגיית CRISPR/Cas9 יכולה ליצור מוטציות בלוקוס שנבחר, דרך מסלול התיקון של NHEJ; או לאסטרטגיות מורכבות יותר לעריכת גנום, כגון דפיקות או כתבי ביטוי, דרך מסלול HDR עם תבנית תורמת מתאימה. בזבובי חול, אללים מוטנטים ריקים של גורם התגובה החיסונית Relish נוצרו באמצעות CRISPR בתיווך NHEJ בפלבוטומוס פאפטאסי4. עוברי זבוב חול הוזרקו גם במחקר אחר עם תערובת CRISPR/Cas9 המכוונת לגן המקודד צהוב. ובכל זאת, לא היו מבוגרים הנושאים את המוטציה18. אנו מתארים כאן שיטה מפורטת של זבוב חול mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR /Cas9 בתיווך NHEJ, עם דגש מסוים על microinjection העובר, צעד קריטי של הפרוטוקול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש בעכברים כמקור דם להאכלת זבוב חול נעשה בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). הפרוטוקול אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של NIAID, NIH (מספר פרוטוקול LPD 68E). חסרי חוליות אינם מכוסים תחת הנחיות NIH.

1. הכנת מחט (איור 1)

  1. משוך מחטים ושיפוע כמתואר ב Meuti והארל19. בקצרה, משוך מחטים על משיכת מיקרופיפט זכוכית דו-שלבית, באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט.
  2. לחדד את המחטים על ידי שיפוע רטוב על שיפוע micropipette, באמצעות אבן עדינה נוספת.

2. אוסף עוברים ומיקרומניפולציה (איור 2)

  1. חמישה ימים לפני יום ההזרקה, נקבות חול מאכילות דם עפות כפי שהן מבוצעות באופן שגרתי לתחזוקת המושבה. לפרטים על מושבות זבוב חול גידול נהלים וחומר נדרש, אנא עיין עו"ד ואח'1 לשמור על החרקים באינקובטורים ב 70% לחות ו 26 °C (60 °F), במהלך כל התפתחותם.
    1. יום אחד לאחר האכלת הדם, ללכוד נקבות שניזונו בדם על ידי קבוצות של 100-150 בסירי גבס עם נמל צדדי. לשמור על הנקבות על ידי האכלת אותם עם תמיסת סוכר (30% סוכרוז – נפח מספיק כדי להשרות כדור כותנה קטן) וזה הרגיל לתחזוקת המושבה.
  2. ביום 2-3 לאחר האכלת הדם, אין להרטיב את סירי הגבס. שמירה על הנקבות על מצע יבש תמנע הטלת ביצים מוקדמת, שכן הנקבות מעדיפות להטיל ביצים על סביבה לחה.
  3. ביום 5 לאחר האכלת הדם, לבצע את אוסף העובר, מיקרומניפולציה, microinjection. הכניסו נייר סינון לח לתא הטלת הביצים. לעוברים טריים אין כוריון מפותח לחלוטין והם נראים לבנים. השתמש בנייר סינון שחור במהלך ההליך כדי להקל על הדמיית העוברים הלבנים.
  4. מעבירים קבוצה קטנה של נקבות מסיר הגבס לתא הטלת הביצים דרך היציאות הצדדיות באמצעות שאיפת פה. נוכחותו של מצע לח (נייר הסינון) גורם לנקבות לביצית.
  5. לאחר 30-60 דקות, בזהירות לאחזר את נייר המסנן עם עוברים שהונחו לאחרונה מן התא. שומרים את נייר הסינון והעוברים בצלחת פטרי עד 3 שעות. במהלך תקופה זו, להעריך באופן קבוע את רמת הלחות של נייר המסנן כדי להבטיח שהוא נשאר לח. במהלך תקופה זו, לחזור על שלבים 2.4 כדי 2.6 עם קבוצות חדשות של נקבות ולאסוף עוברים רבים ככל האפשר.
  6. מכינים שקופיות מיקרוסקופ להזרקה: אוספים ידנית את הביצים אחת אחרי השנייה עם מברשת צבע עדינה מאוד ומעבירים אותן בזהירות לחתיכה אחרת של נייר סינון שחור לח שהונח על מגלשת מיקרוסקופ ומעליה כיסוי זכוכית.
    1. מוסיפים מים לנייר הסינון, מספיק כדי לשמור על העוברים לחים אך לא גורמים להם לצוף הרחק מהכיסוי או להישאב מתחת לכיסוי. תסדר את העוברים כנגד הכיסוי. העטיפה משמשת כפסע אחורי המונע מהביצים להתגלגל במהלך ההזרקה.

3. זריקות עוברים (איור 3)

  1. התחל זריקות 2.5 עד 3 שעות לאחר תחילת איסוף הביצים. בצעו זריקות בטמפרטורת החדר ובלחות המעבדה הסביבתית.
  2. ודאו שלעוברים המיושרים יש מספיק מים כדי שהם יישמרו לחים.
    הערה: זה קריטי כי העוברים נשמרים לחים במהלך הזריקות. אם הם לא לחים במהלך תהליך ההזרקה, זריקות להיות קשה כי המחט מתקשה פירסינג העובר. כמות המים הנכונה היא הנקודה שבה לעוברים יש מניסקוס של מים סביבם, אך הכיסוי אינו צף על גבי המים וגורם לעוברים לדחוף מתחת לכיסוי. זה קריטי כדי לפקח על כמות המים סביב העוברים במהלך זריקות. מוסיפים מים לפי הצורך כדי לשמור על העוברים לחים.
  3. מוסיפים מים בזהירות על ידי הרטבת מברשת עם מים והעברת המים לקצה האחורי של נייר המסנן. הוספת מים בצורה זו מאפשרת להוסיף מים בצורה איטית ומבוקרת, כך שרק מספיק מתווסף כדי לשמור על העוברים לחים. יותר מדי מים יכולים לגרום לעוברים לצוף מחוץ ליישור, מה שמקשה על הזרקת העוברים.
  4. תערובת הזרקת עומס גב לתוך מחט microinjection. הוסף כ 0.5 כדי 1 μL של תערובת הזרקה לתוך המחט באמצעות מילוי מחט borosilicate מצויר ביד, טיפים צינור טעינת ג'ל ניתן להשתמש גם. תערובת ההזרקה מורכבת RNA מדריך אחד או יותר (80 ng / μL כל אחד) שנועד למקד לוקוס ספציפי מעורבב עם חלבון Cas9 רקומביננטי מסחרי (300 ng / μL).
  5. החל מלחץ ההזרקה ב 30 psi, לחץ על ההדק ההזרקה כדי לגרש אוויר מקצה המחט. זה יאלץ את תערובת ההזרקה לקצה המחט ומאפשר לתערובת ההזרקה לזרום. בשלב זה, לאט להגדיל את הלחץ להחזיק / קבוע עד חומר ההזרקה מתחיל לזרום, ולאחר מכן לסגת להחזיק / לחץ קבוע, כך שהוא ממש מתחת לנקודת תערובת ההזרקה זורם מן המחט. ההגדרה מגודרת צריך לספק רק מספיק חומר הזרקה, כך כמות קטנה של חומר ניתן לראות להיכנס העובר.
    הערה: הזרקת עוברים זבוב חול תחת שמן halocarbon דומה לפרוטוקולים אחרים המשמשים Drosophila ו יתושים נבדק בתחילה, אולם אחוז ההישרדות עבור זריקות אלה היה נמוך מאוד. ההישרדות שופרה על ידי מעבר לזריקות על נייר סינון לח כמתואר לעיל.
  6. הכנס את המחט לצד העובר. השתמש בכיסוי מאחורי העובר כמו backstop אשר יסייע המחט לנקב את העובר. לספק כמות קטנה של תערובת הזרקה לתוך העובר לפני בעדינות להסיר את המחט.
  7. מיד לאחר הסרת המחט, לחץ על המזרק כדי להסיר כל חומר ממולא לאחור מקצה המחט. זה יעזור למנוע את המחט סתימת.
  8. המשך לעובר הבא. בין כל זריקה, ודא כי נייר המסנן לח והמחט אינה סתומה.
  9. לאחר שכל העוברים הוזרקו, לספור את מספר העוברים מוזרקים כדי לשמור על ספירת ריצה.
  10. הסר את הכיסוי על-ידי הוספת מים לנייר הסינון כך שהכיסוי יצוף. בשלב זה, השתמש בבדיקה (מקל אפליקטור עץ עם סיכת חרק מודבק לקצה) כדי להחזיק את נייר המסנן במקום בעוד אצבע משמשת כדי למשוך את הכיסוי מן העוברים מוזרקים.
  11. מחק מים עודפים מנייר הסינון לאחר הסרת העטיפה.

4. גידול לאחר הזרקה (G0) (איור 4)

  1. מעבירים את נייר המסנן עם העוברים על גבי מספר שכבות של נייר סינון לח הממוקם בצלחת פטרי כדי לשמור על לחות. שמור את העוברים כאן בזמן הדרוש כדי להזריק עוברים אחרים. עוברים יכולים להיות מוחזקים לכל היותר 3 שעות כאלה. לאחר ההזרקה הם יהפכו לאט חום.
  2. לאחר כל העוברים הוזרקו, להעביר אותם באופן ידני על סירי גבס בגודל קטן לח בעבר. אין לשים יותר מדי עוברים בכל סיר ולשמור על מרחק ביניהם, כדי למנוע זיהום פטרייתי אפשרי בין אנשים. מכסים את הסירים במסך ומאחסנים אותם כפי שנעשה בדרך כלל עבור ביצי מושבת זבוב חול, המתוחזקות באינקובטורים ב 70% לחות ו 26 °C (60 °F), במהלך כל הפיתוח שלהם.
  3. ביום הראשון שלאחר ההזרקה, הסר את כל העוברים הפגומים והמתים עם מברשת צבע. הוסף 100 μL של 0.5% חומצה propionic, טיפה אחר טיפה, על סירי טיח המכילים את העוברים מוזרקים להגביל זיהום פטרייתי. שחרור ציטופלסמה מעוברים שנפגעו במהלך תהליך ההזרקה הוא חיובי במיוחד לצמיחה פטרייתית.
  4. בדוק את סירי הגבס כל יום ולהסיר את כל העוברים רעים או מתים. אם פטרייה קיימת, להסיר את כל העוברים הנגועים ולהוסיף כמה טיפות של 0.5% חומצה propionic.
  5. הזחלים בוקעים בין היום ה-8 ל-12 לאחר ההזרקה. פעמיים ביום, להעביר את הזחלים החדשים הגיח על סירי גבס חדשים, בקבוצות של 5-10 מקסימום. מוסיפים כמות קטנה של מזון ולבדוק את האוכל 2-3 פעמים בשבוע.
    1. בזהירות לפקח על כמות המזון הזחל, כמו יותר מדי מגדיל מאוד את הסיכון לזיהום פטרייתי. זחלי זבוב חול לשרוד טוב יותר בקבוצות עם זאת הם יכולים להיות קניבליים אם אין מספיק מזון.
  6. כאשר הזחלים גורים, להפריד אותם על ידי מין כדי לשמור על הנקבות כמו בתולות. אם יש הרבה ניצולים, להשליך את הזכרים ולשמור רק את הנקבות.
    הערה: זכרים ונקבות כאחד יכולים לשאת ולהעביר מוטציות. עם זאת, כמו נקבות צריך להישמר בתולות לפני שהם להיות חצה, קל יותר להשתמש רק G0 מוזרק נקבות, כדי למנוע צורך להפריד wt חרקים על ידי מין. זכרי G0 יכולים להישמר כגיבוי אם מספר הניצולים הבוגרים נמוך ובמקרה זה יוזדווגו עם נקבות בתולות ממוינות.

5. בחירה והקרנה של אללים מוטנטים (איור 5)

  1. המוני לחצות את נקבות G0 עם זכרים wt בכלוב. דם להאכיל אותם לגמרי, כפי שנעשה לתחזוקת מושבה נורמלית.
  2. יום אחד לאחר האכלת הדם, להעביר כל נקבת G0 עם 2-3 זכרים wt לתוך צינורות גבס בודדים באמצעות שאיפה בפה. להאכיל את הזבובים עם סוכר על כדור כותנה קטן השתנה כל יום ולהשתמש במזרק מים כדי להבטיח את לחות הטיח מתאים הטלת ביצה.
  3. לאחר נקבות G0 הטילו ביצים (המקביל G1), לאסוף את גופם בודדים, מבואר צינורות Eppendorf עבור genotyping מאוחר יותר. לשמור על העוברים כפי שנעשה בדרך כלל עבור מושבות wt.
  4. לחלץ את ה-DNA מן הנקבות G0 בשיטת הבחירה.
  5. לסנן את ה-DNA לנוכחות של מוטציות, למשל על ידי עיצוב PCR assay באמצעות פריימרים המקיפים את האזור של חתכים CRISPR צפוי.
  6. שמור רק את עוברי G1 שהונחו על ידי נקבות G0 מראה ראיות לשינוי. כאשר עוברים אלה G1 לפתח גלמים, להפריד אותם על ידי מין ולשמור רק את הנקבות. לחצות את נקבות G1 מאותה נקבת G0 לזכרים wt, להאכיל אותם בדם, ואז להעביר בקבוצות קטנות של 2-3 נקבות ו 4-5 זכרים לתוך מיכלים בגודל קטן.
    הערה: כל האנשים G1 יש סיכוי לשאת מוטציה ייחודית, אז אם מספר האנשים ששרדו הוא לא גבוה מדי אז עדיף לחצות G1 נקבות בנפרד עם זכרים wt. המקרה של מספר נקבות הנושאות מוטציה שונה נוכח בצינור זהה הוא נדיר אבל יכול להתרחש. אם מקרה כזה נצפה לאחר genotyping, נקבות צאצאי G2 אז צריך להיות מזדווג בנפרד עם זכרים wt. ערכת הזדווגות זו מונעת את האפשרות של מוטציות מרובות בצאצאים.
  7. לאחר הטלת ביצים, לאסוף את הגופות הנשיות G1 ולסנן אותם מוטציות. שמור רק את הצינורות שבהם לפחות נקבה אחת הראתה ראיות למוטציה.
  8. במשך דורות מאוחרים יותר לעשות זוג אחד בצלבים. לאחר הטלת ביצים, הורים מסך לנוכחות של מוטציה. חזרו על הפעולה בכל דור עד ששני ההורים יהיו הומוזיגיים לאותה מוטציה. ברגע שזוהו, הם יהיו המייסדים של מלאי מוטנטים הומוזיגי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול המיקרו-injection CRISPR/Cas9 המתואר כאן ליצירת מוטנטים של זבוב חול הוקם בפרסום הקודם4. גישה זו יצרה mutagenesis יעיל מאוד, כמו 11 מתוך 540 אנשים שרדו את ההליך, מתוכם 9 היו מוטנטים. בעת תכנון מדריכים למוטציה CRISPR/Cas9, צעד ראשון קריטי הוא לרצף את האזור סביב האזור שיש לפלח. התבנית לריצוף צריכה להיות מהזן שישמש כמקור לעוברים להזרקה. מסוכן להסתמך רק על רצפי גנום שפורסמו כדי לעצב מדריכים. זה לא יוצא דופן שיש הבדלים בין הגנום שפורסם ורצפי עיצוב מראש מדריך. במקרים מסוימים, מדריכים שעוצבו מרצף ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מציגים כאן שיטת מיקרו-אינג'ינג עובר שפותחה לאחרונה עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 בפליבוטומוס פאפטאסי חול זבובים. מיקרו-לינקציה של עוברים לשינוי גנטי של חרקים פותחה בדרוסופילה באמצע שנות ה-80 של21 וכיום נעשה בה שימוש שגרתי במגוון רחב של חרקים. שיטות אחרות להעברת חומרים לשינוי גנטי פותחו לשימוש חרקים, כגון ReMOT20,21,22,23 ו electroporat...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

המחברים מודים לוונסה מלדנר-הארל על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נייר סינון שחור 4.25 ס"מ PK100VWR28342-012חתוך למלבנים בגודל של כ-46 X 22 מ"מ. אלה ממוקמים בין השקופית לכיסוי ומשמשים כשכבת בסיס לחה לעוברים במהלך ההזרקה.
CoverslipsFisher Scientific12-543A
ניתוח מיקרוסקופכל מותגליישור עוברים
שקופיות זכוכיתFisher Scientific12-550-A3שכבת בסיס של המיקרו-הזרקה הוקמה איור 2A
כלוב חרקיםבהתאמה אישית או מספר אפשרויות מסחריותכלוב פוליקרבונט למבוגרים אוחזים ומזדווגים עורך דין, פיליפ, מיריי קיליק-קנדריק, טובין רולנד, אדגר רוטון ופטר וולף. “ קולוניזציה במעבדה וגידול המוני של זבובי חול פלבוטומינים (Diptera, Psychodidae)." טפיל 24. גישה ל-6 באוגוסט 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
מזון זחליםבהתאמה אישית הכיןתערובת של צ'או ארנב וצואת ארנב עורך דין, פיליפ, מיריי קיליק-קנדריק, טובין רולנד, אדגר רוטון ופטר וולף. " קולוניזציה במעבדה וגידול המוני של זבובי חול פלבוטומינים (Diptera, Psychodidae)." טפיל 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
מיקרוקאפ 100 מ"לדראמונד1-000-1000משמש למילוי חוזר של מחטי מיקרו-הזרקה
שואב פהג'ון וו. הוק חברתדגם 612שואב פה עם מסנן HEPA
אולימפוס SZX12אולימפוס מדעימיקרוסקופ מיקרוסקופ הזרקה
חברת OvipotsNalgeביצים עשויות מצנצנות פלוליפרופילן של 125 מ"ל או 500 מ"ל ששונו על ידי קידוח חורים של 2.5 ס"מ בתחתית וממולאות בטיח של 1 ס"מ של פריז. עורך דין, פיליפ, מיריי קיליק-קנדריק, טובין רולנד, אדגר רוטון ופטר וולף. “ קולוניזציה במעבדה וגידול המוני של זבובי חול פלבוטומינים (Diptera, Psychodidae)." טפיל 24. גישה ל-6 באוגוסט 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
מברשת צבע 6-0כל חברת אספקת אמנותn/aמשמש ליישור עוברים
חומצה פרופיוניתסיגמא-אולדריץ'402907חומר אנטי פטרייתי
נימי זכוכית סטנדרטייםמכשירי דיוק עולמיים1B100-3משמש לייצור מחטי מיקרו-הזרקה
בקר Trio-MPC100 ומניפולטור MP845מכשירי סאטרבקר מיקרו-הזרקה ו מיקרומניפולטור
החיים

מקורות

  1. Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42(2017).
  2. Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
  3. Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
  4. Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
  5. Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098(2008).
  6. Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
  7. Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561(2012).
  8. Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
  9. Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542(2009).
  10. Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
  11. Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
  12. Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
  13. Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62(2009).
  14. Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486(2011).
  15. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  16. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  17. Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
  18. Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769(2018).
  19. Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651(2020).
  20. Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008(2018).
  21. Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
  22. Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
  23. Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PCRNHEJ
זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.