מוצג כאן פרוטוקול להעברת אוליגונוקלאוטידים כגון RNA מפריע קטן (siRNA), מיקרו-RNA מחקה (miRs), או אנטי מיקרו-RNA (אנטי-miR) לתוך אדיפוציטים בוגרים כדי לווסת חלבון וביטוי מיקרו-RNA.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-RNA על תפקוד אדיפוציטים
במאמר זה
סיכום
תקציר
שינוי בתפקוד אדיפוזיטים תורם לפתוגנזה של מחלות מטבוליות כולל סוכרת מסוג 2 ועמידות לאינסולין. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. אפנון הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים נותר מאתגר מאוד. מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי להבדיל בין פיברובלסטים מורין לאדיפוציטים בוגרים ולווסת את הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים בוגרים באמצעות תעתיק הפוך באמצעות RNA מפריע קטן (siRNA) ומיקרו-RNA מחקה (מחקה חיקוי) אוליגונוקלאוטידים. פרוטוקול תעתיק הפוך זה כרוך בדגורה של ריאגנט טרנס-זיהום והאוליגונוקלאוטידים כדי ליצור קומפלקס בלוח תרביות התא שאליו מתווספים האדיפוציטים הבוגרים. לאחר מכן, אדיפוציטים מורשים לחבר מחדש למשטח הלוח החסידי בנוכחות קומפלקס הריאגנט אוליגונוקלאוטידים/טרנספקטריון. ניתוחים פונקציונליים כגון המחקר של איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, ליפוגנזה, ליפוליזה יכול להתבצע על אדיפוזיטים בוגרים 3T3-L1 כדי לחקור את ההשפעה של חלבון או מניפולציה מיקרו-RNA על תפקוד אדיפוזיט.
מבוא
השמנת יתר נחשבת לגורם סיכון מרכזי למחלות מטבוליות רבות, כולל תנגודת לאינסולין (IR), סוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות לב וכלי דם1. הטיפולים הנוכחיים לא הצליחו לעצור את השכיחות הגואה המתמדת של מחלות אלה, וניהול IR של חולי שמנים וחולי סוכרת נותר נושא קליני חשוב. רקמת השומן ממלאת תפקיד מכריע בשליטה על הומאוסטזיס אנרגיה, וההתרחבות הפתולוגית שלה במהלך השמנת יתר תורמת להתפתחות של IR ו- T2D2,3. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. מחקרים רבים חקרו את התפקיד של RNAs קידוד חלבון בפיזיולוגיה אדיפוציטים ואת הקשר שלה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: השתמש בטכניקות סטריליות כדי לבצע את כל שלבי הפרוטוקול במכסה המנוע של תרבית תא זרימה למינארית. ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים אודות כל הריאגנטים והציוד.
1. הבחנה של פיברובלסטים מורין 3T3-L1 לאדיפוציטים
- לגדל את פיברובלסטים 3T3-L1 במנות 100 מ"מ בתרבות בינונית DMEM ללא פירובט, 25 mM גלוקוז, 10% סרום עגל שזה עתה נולד, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין(איור 1A). מניחים את הכלים באינקובטור תרבית רקמות (7% CO2 ו 37 מעלות צלזיוס).
- יומיים לאחר המפגש, לשנות את המדיום התרבותי, להחליף עם DMEM ללא pyruvate, 25 mM גלוקוז, 10% סרום עגל עוברי (FCS), ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת 0....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות ההליך של טרנס-טרנס-זיהום הפוך המתואר כאן כדי לווסת את הביטוי של חלבונים או מיקרו-RNAs ב 3T3-L1 adipocytes, adipocytes הוכחו כדי לשמר את המורפולוגיה שלהם לאחר transfection (איור 1B,C). ואכן, 2 ימים לאחר transfection, adipocytes היו מפוזרים היטב מחוברים לצלחת והציג טיפות שומנים רב לשוניות כי הם אופייניים של adipocytes 3T3-L1 בוגר. תכולת השומנים לא הייתה שונה בין אדיפוזיטים שהודבקו ללא עבירות(איור 1D,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידול ולהדבקה של אדיפוציטים בוגרים. שיטת טרנס-טרנס-זיהום הפוכה זו היא שיטה פשוטה, חסכונית ויעילה ביותר להדבקת אוליגונוקלאוטידים כגון, אך לא רק, siRNAs, מיקרו-RNA מחקה, ואנטי מיקרו-RNAs לתוך אדיפוציטים 3T3-L1, שהוא אחד מקווי התא הקשים ביותר לבצע תעתיק. לשיטה זו יש כמה מגבלות שיש לקחת בחשבון. פרוטוקול זה אינו יעיל עבור transfection עם DNA plasmid, אשר מגביל את התועלת של טכניקה זו עבור מחקרים רווח של פונקציה. למרות קווי תאים מורינים, כולל קו התא 3T3-L1, שימשו בדרך כלל כדי ללמוד תפקוד אדיפוציטים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת חוף ד'אזור, וסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) באמצעות התוכנית השקעות למעבדת המצוינות העתידית (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ויוזמת המצוינות (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. נתמך על ידי מענקים מן Société Francophone du Diabète (SFD), האגודה Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), המכון Thématique Multi-Organismes טכנולוגיות לשפוך לה סנטה (ITMO), ואת פונדציה בנג'מין-Delessert. J.G. נתמך על ידי ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. נתמך על ידי מענק ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ומענק מן פונדציה לשפוך la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). אנו מודים גם למתקן ליבת ההדמיה של C3M הממומן על ידי קונסיל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 12 באר צלחת תרבית רקמות | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% טריפסין (10x) | Gibco | 15090-046 | מדולל ל-5x עם D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell לא ממוקד Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| סרום בקר אלבומין (BSA) | Sigma | A7030 | |
| קולגן סוג I מעור עגל | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's מדיום נשרים מותאם (DMEM) | ג'יבקו | 41965062 | 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז; ל-גלוטמין; ללא פירובט |
| אתנול | סיגמא | 51976 | |
| תווית FAM בקרה שלילית si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 10270-106 | |
| מגיב גליצרול חופשי | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| תמיסה סטנדרטית | סיגמא-אולדריץ' | G7793 | |
| HSP90 נוגדן | סנטה קרוז | sc-131119 | דילול : 0.5 ומיקרו; g/mL |
| מדיום חיוני מינימלי משופר (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| אינסולין, רקומביננט אנושי | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA מחקה | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer בדיקות Hs_RNU6-2_11 | בדיקות פריימר Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript ערכת PCR ירוקה SYBR סרום עגל | יילוד Qiagen | 219073 | |
| יילוד | סרום Gibco | 16010-159 | |
| שמן אדום O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus עכבר Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon דיסקברי | L-056623-01-0005 | |
| פניצילין וסטרפטומיצין | Gibco | 15140-122 | |
| נוגדן פריליפין-1 | איתות תאים | 3470 | דילול: 1/1000 |
| צלחת פטרי 100 מ"מ x 20 מ"מ | Dutscher | 353003 | |
| PKB נוגדן | איתות תאים | 9272 | דילול: 1/1000 |
| PKB פוספו Thr308 תא נוגדן | איתות | 9275 | דילול: 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| מגיב טרנספקציה (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin נוגדן | Sigma aldrich | T6199 | דילול: 0.5 µ גרם/מ"ל |
| נוגדן Vamp2 | R& D מערכות | MAB5136 | דילול : 0.1 ומיקרו; גרם/מ"ל |
מקורות
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
