שיטות הדמיה ומיון תאים של בעלי חיים חיים לחקירת ניוון עצבי במודל נמק אקסיטוטוקסי של C. elegans

סיכום

במודל אקסיטוטוקסיות של C. elegans , פרוטוקול זה משתמש בהדמיה in vivo כדי לנתח את הוויסות של ניוון עצבי נמק, השפעת גנים המקודדים מתווכים מועמדים ומעורבות של מיטוכונדריה. דיסוציאציה ומיון תאים משמשים להשגת נוירונים בסיכון באופן ספציפי לניתוח טרנסקריפטומי ספציפי לתא של ניוון עצבי ומנגנוני הגנה עצבית.

תקציר

נמק אקסיטוטוקסי הוא צורה מובילה של ניוון עצבי. תהליך זה של נמק מווסת מופעל על ידי הצטברות סינפטית של המוליך העצבי גלוטמט, וגירוי מוגזם של הקולטנים הפוסט-סינפטיים שלו. עם זאת, חסר מידע על האירועים המולקולריים הבאים שמגיעים לשיאם במורפולוגיה המובהקת של נפיחות עצבית מסוג זה של ניוון עצבי. היבטים אחרים, כגון שינויים בתאים תת-תאיים ספציפיים, או הבסיס לפגיעות התאית הדיפרנציאלית של תת-סוגים עצביים מובחנים, נותרו לא נחקרים. יתר על כן, מגוון גורמים שנכנסים לתמונה במחקרים המשתמשים בתכשירים חוץ גופיים או ex vivo עשויים לשנות ולעוות את ההתקדמות הטבעית של צורה זו של ניוון עצבי. לכן חשוב לחקור נמק אקסיטוטוקסי בבעלי חיים על ידי ניטור ההשפעות של התערבויות המווסתות את היקף הנמק העצבי במערכת המודל השקופה והניתנת גנטית של הנמטודה Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקר נמק אקסיטוטוקסי בתאי עצב של C. elegans , בשילוב ניתוח אופטי, גנטי ומולקולרי. כדי לגרום לתנאים אקסיטוטוקסיים ב - C. elegans, נוקאאוט של גן טרנספורטר גלוטמט (glt-3) משולב עם רקע גנטי רגיש עצבי (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) כדי לייצר גירוי יתר של קולטן גלוטמט וניוון עצבי. ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות של נומרסקי (DIC), מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וקונפוקלית בבעלי חיים הן שיטות המשמשות לכימות ניוון עצבי, מעקב אחר לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המסומנים פלואורסצנטית, וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בנוירונים המנוונים. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי עצבי (FACS) משמש למיון מובהק של נוירונים בסיכון לניתוח טרנסקריפטומי ספציפי לסוג התא של ניוון עצבי. שילוב של הדמיה חיה ושיטות FACS כמו גם היתרונות של אורגניזם מודל C. elegans מאפשרים לחוקרים למנף מערכת זו כדי להשיג נתונים הניתנים לשחזור עם גודל מדגם גדול. תובנות ממבחנים אלה יכולות להיות מתורגמות למטרות חדשות להתערבות טיפולית במחלות ניווניות.

מבוא

אקסיטוטוקסיות היא הגורם המוביל למוות עצבי באיסכמיה מוחית וגורם תורם למחלות נוירודגנרטיביות מרובות 1,2,3,4,5,6,7,8,9. הפרעה בזרימת הדם המחומצן למוח (למשל, עקב קריש דם) גורמת לתפקוד לקוי של מובילי גלוטמט, מה שמוביל להצטברות גלוטמט בסינפסה. עודף זה של גלוטמט מפעיל יתר על המידה קולטני גלוטמט פוסט-סינפטיים (GluRs) מה שמוביל לזרימה מוגזמת (קטליטית, לא סטוכיומטרית) של Ca²⁺ לתאי עצב (איור 1A). זרם מזיק זה מוביל לניוון עצבי פוסט-סינפטי מתקדם שנע מבחינה מורפולוגית ומכניסטית מאפופטוזיס לנמק מווסת 10,11,12. למרות שהם התבססו על התערבויות מוצלחות במודלים של בעלי חיים, ניסויים קליניים מרובים של אנטגוניסטים של GluR שביקשו לחסום את כניסת Ca²⁺ ולקדם את כדאיות התאים נכשלו בסביבה הקלינית 13,14,15,16. תורם קריטי ככל הנראה לכישלונות אלה הוא העובדה (בניגוד למודלים של בעלי חיים) הטיפול בסביבה הקלינית ניתן שעות לאחר הופעת השבץ, מה שגורם להתערבות לחסום מנגנוני הגנה עצביים מאוחרים, תוך כישלון בהפרעה לאיתות ניווני במורד הזרם של GluRs 14,16,17. גישה חלופית, המבוססת על טרומבוליזה, יכולה להינתן רק בחלון זמן מוגבל מאוד, מה שמשאיר חולים רבים (הסובלים משבץ מוחי בבית עם זמן התחלה לא מזוהה) ללא יכולת להפיק ממנו תועלת¹⁷. מכשולים אלה מדגישים את הצורך למקד את מחקר האקסיטוטוקסיות בחקר אירועים המתרחשים לאחר גירוי יתר של GluR ולהבדיל בין מפלים ניווניים עוקבים לבין תהליכים נוירו-פרוטקטיביים בו-זמניים. גישה זו יכולה לסייע במניעת נזק לתאים ולזהות מטרות תרופתיות יעילות שניתן לתת מאוחר יותר לאחר הופעת הנזק.

גישה אחת לזיהוי אירועים עוקבים באקסיטוטוקסיות היא לחקור את מנגנוני איתות המוות התאי במורד הזרם של גירוי יתר של GluR, כגון אלה המובילים לקריסת המיטוכונדריה. תקלה דרסטית בפיזיולוגיה והדינמיקה המיטוכונדריאלית היא סימן היכר של ניוון עצבי, כפי שניתן לראות באקסיטוטוקסיות 18,19,20. בעוד שכל התאים תלויים בתפקוד המיטוכונדריה ובזמינות להישרדות, פעילות ותחזוקה תאית, נוירונים תלויים במיוחד בייצור אנרגיה מיטוכונדריאלית כדי לתמוך בהעברת אותות והתפשטותם. באופן ספציפי, נוירונים מוציאים ~50% מצריכת האנרגיה הקשורה לאיתות שלהם כדי לשחזר את פוטנציאל הממברנה במנוחה לאחר הפעלת קולטנים/תעלות פוסט-סינפטיות²¹, עם תלות גבוהה בחמצן וגלוקוז. הזמינות המופחתת של גלוקוז וחמצן שנצפתה בשבץ מוחי מובילה לשינויים מיטוכונדריאלים חמורים, מה שגורם להפחתה נוספת בייצור ה-ATP 19,22,23,24. עם זאת, מחקרים לזיהוי רצף האירועים שהובילו לקריסת המיטוכונדריה הניבו תוצאות שנויות במחלוקת וחסרות קונצנזוס. ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית יכול לעזור להבין את האירועים הללו המובילים לפתולוגיה מיטוכונדריאלית מכיוון שהוא אינדיקטור טוב לבריאות העצבים 25,26,27,28,29. מיטוכונדריה חוטית מייצגת תא עצב בריא, בעוד שמיטוכונדריה מקוטעת מגלה נזק עצבי משמעותי שעלול להוביל למוות של תאים. ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בבעלי חיים חיים בתנאים גנטיים שונים יכול לעזור להתמקד בגנים ובמסלולים ספציפיים המעורבים בניוון עצבי תלוי מיטוכונדריה באקסיטוטוקסיות.

גישה נוספת לזיהוי אירועים עוקבים שעשויים לווסת את היקף הניוון העצבי האקסיטוטוקסי היא לחקור את מנגנוני ההגנה הנוירו-פרוטקטיביים של השעתוק המפחיתים חלק מההשפעות של אקסיטוטוקסיות^14,16. עם זאת, היעדר הספציפיות של גורמי שעתוק נוירו-פרוטקטיביים מרכזיים והסטייה של מערכי הניסוי מעכבים את הצלחת המאמצים לזהות בבירור תוכניות ליבה נוירו-פרוטקטיביות (במיוחד בנמק מוסדר).

לכן, הן חקר מסלולי איתות מוות במורד הזרם והן חקר הגנה עצבית שעתוק באקסיטוטוקסיות נתקלו בקשיים גדולים וחילוקי דעות על התוצאות שנצפו. סביר להניח שחלק גדול מהמחלוקת הזו נובע מהשימוש במודלים ex vivo או in vitro של אקסיטוטוקסיות, והשונות המוצגת על ידי הספציפיות של מערכי ניסוי שונים. לכן כדאי מאוד להתמקד בזיהוי מנגנוני ליבה שנשמרו מאוד, ולחקור אותם in vivo. מערכת המודל הפשוטה של הנמטודה C. elegans מציעה אפשרות יעילה במיוחד, בשל השילוב העוצמתי של כלי מחקר חזקים ומגוונים במיוחד, שימור מסלולי הליבה של מוות תאי והמידע העשיר על המבנה והקישוריות של מערכת העצבים שלה 30,31,32,33. ואכן, העבודה המכוננת של מעבדת דריסקול על הניתוח הגנטי של ניוון עצבי נמק בנוירונים מכניים-חושיים היא הדגמה מצוינת לכוחה של גישה זו³⁴. חשוב לניתוח אקסיטוטוקסיות, שימור מסלולי האיתות בנמטודה כולל את כל המרכיבים העיקריים של העברה עצבית גלוטמטרגית^35,36.

מודל האקסיטוטוקסיות של הנמטודות מתבסס על מחקרים מכוננים אלה, ומאפשר לחוקר לחקור תהליכים ביוכימיים הדומים לאלה המתרחשים בשבץ מוחי ומחלות ניווניות אחרות המושפעות מרעילות עצבית תלויה בגלוטמט. כדי לגרום לתנאים אקסיטוטוקסיים ב- C. elegans גישה ניסויית זו משתמשת בזן אקסיטוטוקסיות שהוא שילוב של נוקאאוט של גן טרנספורטר גלוטמט (glt-3) ורקע גנטי רגיש עצבי (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) כדי לייצר גירוי יתר של GluR וניוון עצבי³⁷. זן אקסיטוטוקסיות זה חושף 30 נוירונים ספציפיים (מבטאים glr-1) שהם קשרים פוסט-סינפטיים לגלוטמטרגיים לניוון עצבי אקסיטוטוקסי. מבין 30 הנוירונים הללו בסיכון, נוירונים בודדים עוברים נמק ככל שהחיה מתקדמת בהתפתחות (עם סטוכסטיות מעורבת והעדפה חלקית לנוירונים ספציפיים מסוימים³⁸), ובמקביל גם גוויות תאים מוסרות בהדרגה. בשילוב עם הנגישות של זנים מוטנטיים רבים, גישה זו מאפשרת לחקור מסלולים מרובים המשפיעים על ניוון עצבי והגנה עצבית. גישות אלה כבר שימשו לניתוח חלק ממפלי איתות המוות במורד הזרם³⁹ ומווסתי שעתוק של ניוון עצבי אקסיטוטוקסי באקסיטוטוקסיות^38,40. כמו מקרים אחרים של ניוון עצבי נמק בתולעת⁴¹, הניוון העצבי האקסיטוטוקסי של הנמטודה אינו כרוך באפופטוזיס קלאסי⁴⁰.

מאמר שיטות זה מתאר את המערכת הבסיסית לגרימה, כימות ומניפולציה של ניוון עצבי נמק אקסיטוטוקסי ב - C. elegans. יתר על כן, הוא מתאר שני פרוטוקולים עיקריים הנמצאים כיום בשימוש לייעול מחקרים של היבטים ספציפיים של אקסיטוטוקסיות נמטודות. על ידי שימוש במדווחים פלואורסצנטיים והדמיה חיה in vivo, החוקר יכול לחקור מעורבות ודינמיקה מיטוכונדריאלית במודל הנמטודה של ניוון עצבי אקסיטוטוקסי. כדי לקבוע את ההשפעה של גורמי שעתוק נוירו-פרוטקטיביים ספציפיים, החוקר יכול להשתמש בביטוי ספציפי לסוג התא של סמנים פלואורסצנטיים, דיסוציאציה של בעלי חיים לתאים בודדים ו-FACS כדי לבודד נוירונים ספציפיים הנמצאים בסיכון לנמק מאקסיטוטוקסיות. לאחר מכן ניתן להשתמש בנוירונים מבודדים ספציפיים מסוג תאים אלה לריצוף RNA בזנים המכילים מוטציות בגורמי שעתוק מרכזיים. יחד, שיטות אלה יכולות לאפשר לחוקרים לבחון את היסודות המולקולריים של ניוון עצבי אקסיטוטוקסי והגנה עצבית in vivo בבהירות ובדיוק רב.

פרוטוקול

1. זנים המשמשים לחקירת ניוון עצבי אקסיטוטוקסי והגנה עצבית

1. השתמש בזן האקסיטוטוקסיות של הנמטודות ZB1102 כנקודת ייחוס לניוון עצבי אקסיטוטוקסי סטנדרטי.
   הערה: אקסיטוטוקסיות תלויה בגלוטמט ב - C. elegans מיוצרת בזן ZB1102 על ידי שילוב נוקאאוט (ko) של טרנספורטר גלוטמט עם טרנסגן הרגיש לנוירונים בבעלי חיים אלה לרעילות עצבית ומתבטא בתת-קבוצה של נוירונים קשרים פוסט-סינפטיים לגלוטמטרגיים³⁷. שילוב גנטי זה מכונה זן אקסיטוטוקסיות של נמטודות, והוא זמין באופן חופשי מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC).
2. כדי לחקור את ההשפעה של גנים המקודדים מווסתים מועמדים לנמק אקסיטוטוקסי, שלבו מוטציה בגנים כאלה (למשל, dapk-1, או crh-1) עם זן האקסיטוטוקסיות של הנמטודה.
3. לבצע הכלאות גנטיות על פי שיטות סטנדרטיות של C. elegans ³⁰, כמתואר wormbook.org^42,43.
4. מכיוון שהבסיס המולקולרי של המוטציה מתועד בדרך כלל, עקוב אחר הצאצאים הצולבים על ידי גנוטיפ של הלוקוס הספציפי באמצעות PCR. הבדיל בין WT לעומת מוטציה לפי גודל השבר (עבור מחיקות) או רצף (עבור מוטציות נקודתיות).
   הערה: טבלה 1 מתארת זנים ששימשו לחקר מסלולים שונים של ניוון עצבי והגנה עצבית, במיוחד עבור פרוטוקול זה.
5. גזור את כל הזנים הקריטיים על ידי שני קווים בלתי תלויים ובדוק אותם בנפרד כדי לאשר את תקפות הפנוטיפ הנצפה.

2. אמצעי גידול וגידול בעלי חיים

1. גדל תולעים בטמפרטורה של 16-25 מעלות צלזיוס על לוחות NGM סטנדרטיים ^30,37,42 או צלחות MYOB ^38,44 זרעים עם OP50 E.coli לפי שיטות סטנדרטיות.
   הערה: צלחות MYOB נותנות תוצאות זהות ללוחות NGM אך מעט קלות יותר להכנה.
2. שמור על זני הניסוי מוזנים היטב באופן עקבי.
   הערה: רעב יכול להשפיע על ניוון עצבי ולהפחית את מספר נוירוני הראש הגוססים. אם תולעים ניזונות בצורה גרועה או מורעבות, הניחו אותן על צלחות טריות והמתינו כמה דורות לפני שתמשיכו בניסויים. ההשפעה הטרנס-דורית של הרעבה תדעך לאחר כמה דורות.

3. כימות נוירוני ראש מנוונים על ידי ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC) של נומרסקי וניקוד

1. השתמש בזן האקסיטוטוקסיות של הנמטודות (ZB1102: glt-3(bz34) IV; nuIs5 V) כבקרה הניסיונית לכמות, המייצגת רמות אקסיטוטוקסיות נורמליות. הפרוטוקול אינו עוקב אחר אותה חיה בשלבי התפתחות שונים. במקום זאת, הוא נותן תמונת מצב של אוכלוסייה מעורבת של בעלי חיים, כך שבסך הכל אוספים מידע מבעלי חיים שונים כדי לייצג את כל שלבי ההתפתחות.
   הערה: הטרנסגן nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L). Pglr-1::GFP]⁴⁵ (המבטא Gαs ו-GFP מופעלים בתאי עצב פוסט-סינפטיים לקשרים גלוטמטרגיים) מייצר רמת ניוון עצבי נמקית בלתי תלויה ב-GluR ברקע של ~1 נוירון/בעל חיים גוסס (בכל זמן נתון במהלך ההתפתחות). התוספת של glt-3 (ko) מגבירה את הניוון העצבי הנמק של תאי העצב המבטאים nuIs5 הפוסט-סינפטיים באופן תלוי ב-GluR, ועולה ל-4-5 נוירוני ראש גוססים/חיה בשלב הזחל השלישי (L3)³⁷.
2. עבור זני הבדיקה, השתמשו בבעלי חיים מצלב גנטי שהושלם לאחרונה, או הפשירו זנים מעניינים מ-80 מעלות צלזיוס שהוכנו מצלבים טריים. המתן כמה דורות (≥4) לפני שתקבל פנוטיפ וניוון עצבי.
3. חותכים ומסירים חתיכה קטנה של אגר מצלחת של אוכלוסייה מעורבת של בעלי חיים שניזונו היטב, ומרכיבים אותה על כיסוי על ידי הפיכת גוש האגר, כך שהחיות שזחלו על פני האגר פונות כעת לכיסוי.
   הערה: בעלי חיים עדיין יכולים לנוע, אך כעת הם מרוסנים במידה מסוימת וניתן לצפות בהם ללא הרדמה. ניתן להשתמש בנתח כזה למשך ~ שעה לפני החלפתו בטרי.
4. באמצעות טווח DIC הפוך עם עין x10 ומטרה x40 או x63, סרוק בעלי חיים באופן אקראי על ידי החלקת הכיסוי באופן ידני. בעוד ששלבי הדמיה אחרים המתוארים להלן יכולים להתבצע במיקרוסקופים הפוכים או זקופים, בדיקת תולעים בגוש האגר דורשת היקף הפוך.
5. זהה את השלב ההתפתחותי של כל בעל חיים לפי צורת הרחם שלו (עיין בדיאגרמות הרחם wormbook.org).
6. עבור כל בעל חיים, רשום את שלב ההתפתחות שלו ואת מספר הנוירונים הגוססים (כלומר, שואבים). ספרו ורשמו את המספר הכולל של נוירונים גוססים בראש, את מספר הנוירונים הגוססים בגנגליון הרטרו-שלפוחית (מה שנותן זיהוי קל של תאים ספציפיים), ואת מספר הנוירונים הגוססים בזנב (שאינו מושפע מגלוטמט ומשמש כבקרה פנימית, המאשרת כי הטרנסגן הרגיש nuIs5 פעיל במלואו).
7. רשום נתונים אלה בטבלה שבה בעלי חיים מזן נתון מקובצים לפי קטגוריות של שלב התפתחותי.
8. בכל מפגש, לאסוף נתונים באופן אקראי מתולעים במספר שלבי התפתחות; בצע מספר מפגשי ניקוד על פני מספר ימים כדי לאסוף מספיק נתונים לניתוח סטטיסטי. רשמו רמות ניוון עצבי בשלבים מרובים ובנו גרף עמודות בדומה לאיור 1C.
   הערה: שיטה זו תאפשר לקבוע אם טיפול או מוטציה מסוימת מעלים/מורידים את רמות הניוון העצבי בכל השלבים (הזזת ההתפלגות למעלה/מטה) או מעבירים את שיא הניוון העצבי לשלב התפתחותי מוקדם או מאוחר יותר (הזזת ההתפלגות שמאלה/ימינה).
9. לבצע איסוף נתונים תוך עיוורון לזהות הגנוטיפ. לאשר בשני מבודדים עצמאיים של הקו הגנטי (כדי למזער את הסכנה של השפעות לא מכוונות של הבדלים גנטיים אחרים/בלתי צפויים בין מבודדים), ולאגד נתונים לניתוח.
10. בכל זן, חישבו את הממוצע ואת ה-SEM של מספר תאי העצב המנוונים בראש (כולל הגנגליון הרטרו-שלפוחית) בכל שלב התפתחותי (איור 1D). בצע ניתוח דומה של גנגליון רטרו-שלפוחית גוסס בלבד ונוירוני זנב, לפי הצורך.

4. זיהוי נוירוני ראש מנוונים ספציפיים

1. הרכיבו בעלי חיים בודדים (או קבוצות קטנות של) על כרית אגר⁴⁶, ושיתקו את התולעת בטטרמיסול (ראה להלן, סעיף 5).
2. עם פלואורסצנטיות משולבת והיקף DIC (זקוף או הפוך) אתר נוירונים ואקוולטים ספציפיים.
3. קבע את זהות הנוירון הספציפית של תא העצב המוואקם על ידי מעקב אחר התהליכים המסומנים ב-GFP שלו והשוואת מיקום גוף התא וצורת התהליכים לאלו של הנוירונים הידועים כמבטאים glr-1 באמצעות WormAtlas⁴⁷.
   הערה: לחלופין, ניתן לסייע בזיהוי על ידי שיטות חדשות לזיהוי מהיר של נוירונים על ידי תיוג רב-צבעוני שיגיעו בקרוב ממעבדת הוברט⁴⁸.

5. הדמיה חיה של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית עצבית על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של זני מדווח

1. להדמיה של שינויים מיטוכונדריאלים בנוירונים פוסט-סינפטיים מנוונים (המסומנים ב-GFP ציטופלזמי בזן האקסיטוטוקסיות המקורי) בדוק את הקרינה של מיטו-מ-צ'רי.
2. חצו את זן האקסיטוטוקסיות של הבדיקה עם זנים המסמנים מיטוכונדריה של נוירונים פוסט-סינפטיים עם פלואורסצנטיות אדומה (על ידי ביטוי היתוך בין החלבון הפלואורסצנטי לבין מסוף ה-N של TOM-20 תחת מקדם glr-1 ; לפרטים על מבנים וזנים, ראה⁴⁹). כיום ניתן לדמות בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי רגיל (זקוף או הפוך) או מיקרוסקופ קונפוקלי.
3. כדי לשתק את התולעת מבלי להשפיע על ההישרדות העצבית, פיפטה 5 מיקרוליטר של 10 מ"מ טטרמיסול על כרית אגרוז טרייה. ראה Arnold et ^al.46 לפרוטוקול מפורט על הכנת רפידות.
4. הנח בעלי חיים על מרכז טיפת הטטרמיסול והרכיב בעזרת כיסוי.
5. אטמו את דפנות הכיסויהחלקה עם לק והניחו ללק להתייבש.
6. תוך 20 דקות מטיפול בטטרמיסול ושימוש בסקופ עם DIC והדמיה פלואורסצנטית, אתר תולעים באמצעות עדשת אובייקטיבית פי 20.
7. ברגע שראש התולעת נמצא (או נוירונים מעניינים) עברו לאובייקט שמן פי 100 והתמקדו בתיוג הקרינה של המיטוכונדריה בסומה.
8. צלם תמונות Z-stack באמצעות הגדרות המסנן DIC, GFP ו-TxRed.

6. ניקוד וכימות מורפולוגיה של מיטוכונדריה עצבית

1. לנתח את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית במהלך הדמיה חיה של התולעת או לאחר רכישת תמונה באמצעות ImageJ או תוכנת הדמיה אחרת.
2. לזיהוי קל וניתוח חוזר של נוירונים ספציפיים, זהה את שלושת הנוירונים בגנגליון הרטרו-שלפוחית, RIGL/R ו-AVG (במקרים מסוימים רק שניים קיימים עקב פינוי גוויות תאים באקסיטוטוקסיות).
3. סווג את המיטוכונדריה לשלוש קבוצות עיקריות: חוטים, ביניים ומקוטעים 50,51,52.
   הערה: מיטוכונדריה חוטית מופיעים כמבנים דקים רציפים בסומה של נוירונים, בדרך כלל מקיפים את הגרעין. מיטוכונדריות ביניים מופיעות כשילוב של לפחות רשת חוטית אחת לכאורה, אם כי עם שברים, ופיצול מסוים בסומה. מיטוכונדריה מקוטעת מציגה שברים שלמים ברשת המיטוכונדריה, יש להם מראה נפוח והם מפוזרים ברחבי הסומה (איור 2A).
4. עבור כל תולעת, ציין את אחוז הנוירונים עם מיטוכונדריה חוטית, בינונית או מקוטעת בסך הכל 30 תולעים לפחות.
5. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA חד כיווני ואחריו בדיקת טוקי פוסט הוק עבור כל מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בין זנים⁵³.

7. הכנת בופר וריאגנט לדיסוציאציה של תולעים עבור FACS של נוירונים בסיכון לניוון עצבי

1. הכן את מאגר M9 באופן הבא: 3 גרם של KH₂PO₄, 6 גרם של Na₂HPO₄, 5 גרם NaCl, H₂O עד 1 L. עיקור על ידי חיטוי. הוסף 1 מ"ל של 1 M_{MgSO 4} מעוקר בפילטר. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
2. הכן מאגר ביצים באופן הבא: 118 מ"מ NaCl, 48 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl₂, 2 מ"מ MgCl₂ ; חיטוי לעיקור. הוסף 2 M של תמיסת מלאי HEPES pH 7.3 (שסוננה בעבר עם מסנן עליון של בקבוק 0.2 מיקרומטר) לריכוז סופי של 25 מ"מ. התאם את ה-pH ל-7.3 עם 1 N NaOH (לא יותר מ-10 מ"ל). השתמש באוסמומטר כדי להבטיח שהאוסמולריות הסופית היא בין 335 -345 mOsm. מסננים את מאגר הביצים לעקר עם מסננים עליונים של בקבוק 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: המלחים מתמוססים בקלות רבה יותר בעת שימוש ב-MgCl₂ ·6H₂O ו-CaCl₂·2H₂O כדי ליצור פתרונות מלאי MgCl₂ ו-CaCl₂ בהתאמה. אתה יכול גם להכין מלאי של מאגר ביצים פי 10 ולדלל אותו בעת הצורך במים סטריליים נטולי יונים.
3. הכן SDS-DTT באופן הבא: 20 מ"מ HEPES pH 8.0, 0.25% SDS, 200 מ"מ DTT, 3% סוכרוז. במכסה המנוע של תרבית רקמות, יש לעקר SDS-DTT עם מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר. אחסן 300 מיקרוליטר ב-20 מעלות צלזיוס מכוסה בנייר כסף כדי להגן מפני אור.
4. הכן תמיסת פרונאז באופן הבא: הכן את יום הדיסוציאציה 15 מ"ג/מ"ל פרונאז במאגר ביצים. יש לאחסן על קרח.

8. סנכרון גיל עבור FACS ספציפי לנוירונים

1. השתמש בבעלי חיים המשלבים את גנוטיפ האקסיטוטוקסיות (ומוטציות אחרות, לפי הצורך) עם ביטוי טרנסגני של סמן פלואורסצנטי חזק שניתן להשתמש בו בקלות למיון (למשל, FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)⁵⁴. גדל בעלי חיים על שתיים או שלוש צלחות NGM/MYOB בגודל 100 מ"מ בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שהצלחת מלאה בתולעים בעיקר גרבידיות.
2. שטפו תולעים מהצלחות באמצעות מאגר M9. מעבירים תולעים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית מזכוכית של 10 מ"ל.
3. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 2.5 דקות ב-250x גרם והסר את הסופרנטנט.
4. השעו מחדש את כדור התולעת ב-10 מ"ל של תמיסת אקונומיקה (2% 10 N NaOH ו-5% אקונומיקה ביתית טרייה במים סטריליים נטולי יונים).
5. הניחו צינורות על שייקר אופקית, סלעו במהירות נמוכה. ודא שהתולעים לא ישקעו בתחתית הצינור. האקונומיקה פותחת את הקוטיקולה של התולעת אך אינה משפיעה על העוברים, המוגנים על ידי קליפת הביצה.
   1. שלב הלבנה זה אורך כ -5 דקות, אך זה משתנה. כדי להבטיח שלא תתרחש הלבנת יתר, עקוב אחר התהליך על ידי אחזור דגימה כל דקה: פיפטה בעדינות 10 מיקרוליטר מכל צינור על שקופית מיקרוסקופ זכוכית ובדוק את התולעים באמצעות מיקרוסקופ מנתח.
6. לאחר שרוב תולעי הגרביד נסדקות אך לא מומסות לחלוטין, עצור את שלב ההלבנה על ידי מילוי הצינורות החרוטיים במאגר ביצים.
7. כדי לאחזר את הביציות/עוברים, צנטריפוגה את הצינורות ב-250x גרם למשך 2.5 דקות, הסר את הסופרנטנט ושטוף שוב עם מאגר ביצים.
8. חזור על ארבע כביסות נוספות.
9. השעו מחדש את הביצים על ידי פיפטינג עדין של הכדור ומרחו על ארבע צלחות NGM/MYOB עם זרעים של 100 מ"מ. תנו לעוברים לבקוע ולגדול בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
   הערה: הצלחות צריכות להיות מלאות כעת בתולעים בעיקר גרבידיות.
10. חזור על סנכרון הגיל על ידי חזרה על פרוטוקול סנכרון אקונומיקה/גיל זה.
11. שפכו את הביצים על שמונה צלחות 100 מ"מ NGM/MYOB. תנו לבעל החיים לבקוע ולגדול בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד לשלב הזחל הרצוי.

9. דיסוציאציה של תאי תולעת שלמים עבור FACS

1. לגדל תולעים מסונכרנות לשלב ההתפתחותי הרצוי. שטפו בעדינות צלחות 100 מ"מ עם חיץ M9 ופיפטות סרולוגיות מזכוכית והעבירו לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
2. הוסף M9 קר עד 45 מ"ל. הניחו את הצינורות על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר לתולעים להתיישב בתחתית על ידי כוח הכבידה, בעוד שכל שאריות של פסולת חיידקים מהצלחות יצופו בסופרנטנט.
3. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התולעים עם M9 טרי.
4. חזור על כוח הכבידה של 30 דקות כשהוא מתיישב על קרח.
5. הסר את הסופרנטנט, הוסף M9 עד 45 מ"ל וצנטריפוגה ב -250 x גרם למשך 5 דקות.
6. העבירו את הגלולה לצינור מיקרו-צנטריפוגה והוסיפו M9 עד 1 מ"ל.
7. סובב במהירות של 14,000 סל"ד על צנטריפוגה על השולחן למשך דקה אחת והסר את הסופרנטנט.
8. כדי לשבש את הציפורן, יש להשעות מחדש את כדור התולעת עם SDS-DTT באמצעות (בערך) פי שניים מנפח הגלולה, ולדגור עם נדנוד בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות עבור שלבי L2-בוגרים.
   הערה: אין לחרוג מ-4 דקות דגירה ב-SDS-DTT מכיוון שאות החלבון הפלואורסצנטי יקטן באופן דרסטי עם טיפול ארוך יותר ב-SDS-DTT. מכיוון שה-SDS-DTT רגיש לאור, הוא לא אמור להיות בן יותר מ-3 חודשים מכיוון שהתמיסה עלולה לאבד את עוצמתה עם הזמן; דיסוציאציות פועלות בצורה הטובה ביותר עם פתרון SDS-DTT שהוכן לאחרונה.
9. הוסף 1x מאגר ביצים (pH 7.3, 335-345 mOsm) עד 1 מ"ל כדי להפסיק את הטיפול ב-SDS-DTT.
10. סובב במהירות של 14,000 סל"ד על צנטריפוגה על השולחן למשך דקה אחת והסר את הסופרנטנט.
11. כדי לשבש עוד יותר את הקוטיקולה ולנתק את תאי החיות, השהה מחדש את הגלולה עם תמיסת פרונאז בטמפרטורת החדר, תוך שימוש בנפח משולש של הגלולה.
12. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות.
13. פיפטה למעלה ולמטה 40 פעמים כל 5 דקות עם פיפטה P-200 או P-1000, נוגעת בתחתית הצינור עם קצה הפיפטה.
    הערה: הלחץ שנוצר על ידי הקצה הנוגע בתחתית הצינור מקל על דיסוציאציה של תולעת. השתמש בקצה מסנן כדי שהתולעים לא ייכנסו בטעות לפיר הפיפטה במהלך פיפטינג מהיר.
14. לאחר 15 דקות, בדוק את התקדמות דיסוציאציה של התולעת על ידי פיפטינג עדין של 5 מיקרוליטר על שקופית זכוכית והתבוננות בהתקדמות תחת מיקרוסקופ מנתח. כאשר רוב (~90%) התולעים השלמות התפוצצו, התהליך הושלם.
    הערה: ניתן להאריך את הדגירה של הפרונאז אם תולעים רבות נשארות שלמות.
15. במכסה המנוע של תרבית תאים, הוסף 1x מאגר ביצים עד 1.5 מ"ל כדי להפסיק את הטיפול בפרונאז.
16. מעבירים לצינורות FACS, מוסיפים מאגר ביצים של 5 מ"ל ומסובבים בחום של 800 x גרם למשך 5 דקות.
17. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש במאגר ביצים של 3 מ"ל pf.
18. הנח מכסה מסננת תאים של 70 מיקרומטר על צינורות FACS חדשים, מתלה תאי פיפטה על מסננת וסובב ב-800 x גרם למשך דקה אחת. אסוף את תרחיף תאי הפליטה.
19. הנח מכסה מסננת תאים של 5 מיקרומטר על צינורות FACS חדשים, מתלה תאי פיפטה על המסננת וסובב בטמפרטורה של 800 x גרם למשך דקה אחת.
20. הוסף DAPI לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל במאגר ביצים, הניח על קרח עם מכסה/כיסוי להגנה מפני אור.
21. בצע FACS בהקדם האפשרי. אות החלבון הפלואורסצנטי פוחת עם הזמן והחשיפה לאור, לכן חשוב לבצע פרוטוקול דיסוציאציה במהירות האפשרית ולבצע FACS מיד לאחר השלמת הדיסוציאציה.
    הערה: פרוטוקול דיסוציאציה של תולעים הותאם מפרוטוקולים ממעבדת מילר 55,56,57, מעבדת מרפי⁵⁸ ומעבדת שחם⁵⁹.

10. שינויים בתפעול מכונת FACS לזיהוי נוירונים של C. elegans

1. השתמש ב-4 ליטר של מאגר ביצים צונן (4 מעלות צלזיוס) במקום נוזל נדן רגיל בעת מיון נוירונים של C. elegans .
   הערה: האוסמולריות של תאי C. elegans גבוהה בהרבה מתאי יונקים ונוזל נדן סטנדרטי יפוצץ את הנוירונים. כל הגדרות המכונה והכיולים נעשים לאחר הוספת מאגר הביצים, מכיוון שהצמיגות של מאגר הביצים שונה מזו של נוזל נדן רגיל. טכנאי המיון יעביר את חרוזי האבחון דרך המכונה כדי לוודא שהלייזרים פועלים כראוי.
2. כאשר יש להשתמש בנוירונים ממוינים במחקרי טרנסקריפטומיקה עוקבים, מיין מינימום של 100,000 תאי GFP+ ישירות ל-800 מיקרוליטר של Trizol-LS + 10 מיקרוליטר של מעכב RNase.
3. הפוך תאים בטריזול 15 פעמים לערבוב.
4. יש להקפיא באמבט קרח יבש/אתנול ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שמוכנים לחלץ RNA מכל הדגימות לניסוי ריצוף RNA אחד.
   הערה: בעוד שרוב התאים הממוינים נאספים ישירות לתוך טריזול לניתוח טרנסקריפטום, הקפד לאחזר דגימה קטנה של תאים ממוינים GFP+ (מכל זן) שנאספו למאגר ביציות, לאימות מיקרוסקופיה של יעילות המיון.

11. אסטרטגיית שער FACS

1. לזיהוי אות חיובי GFP השתמש בלייזר 488 ננומטר עם מסנן 530/30 ומעבר ארוך 502 (LP).
2. לזיהוי תאים חיוביים ושליליים של DAPI השתמש בלייזר 405 ננומטר עם מסנן 450/50.
3. לזיהוי תאים פלואורסצנטיים אוטומטיים שעלולים להיחשב בטעות כתאים חיוביים ל-GFP השתמשו בלייזר 488 ננומטר עם מסנן 610/20 ו-595 LP (תקשורת אישית, סטנקה סמובה, מנהלת תפעול, מרכז המשאבים לציטומטריית זרימה, אוניברסיטת רוקפלר).
4. בצע אסטרטגיית שער סטנדרטית והסר אירועים עם אזור פיזור צדדי גדול (SSC-A) ואזור פיזור קדמי קטן (FSC-A), שעשויים לייצג גושי תאים ופסולת.
5. בודד סינגלים של פיזור הקדמה ולאחר מכן סינגלים של פיזור צדדי.
6. בודד תאים עם אות GFP גבוה ואות אוטופלואורסצנטי נמוך.
   הערה: תאים גבוהים לאוטופלואורסצנציה ונמוכים יותר ב-GFP אינם תאים חיוביים ל-GFP אמיתיים.
7. הסף לשער GFP+ נקבע על ידי השוואת תאי GFP (כלומר N2) לתאי GFP+^55,56.
8. הסר תאים מתים עם שער חי/מת, בהתבסס על החדירות הסלקטיבית של DAPI לתאים מתים: הסף לשער מת חי נקבע על ידי השוואת תאים לא מוכתמים לתאים מוכתמים DAPI.
   הערה: בעת מיון מספר דגימות, שטוף את הזרם בין הדגימות כדי להבטיח שאין זיהום צולב.

12. מיקרוסקופיה של נוירונים ממוינים כדי לאמת את היעילות של אסטרטגיית שער FACS

1. צייר עיגול על שקופית מיקרוסקופ זכוכית עם עט דוחה נוזלים.
2. פיפטה 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים ממוינים במאגר הביצים בתוך המעגל. הניחו כיסוי מעל הדגימה ואטמו עם לק סביב היקף החלקה של הכיסוי.
3. לאחר שהלק התייבש, בדוק במיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף/הפוך שהתאים הממוינים הם אכן בעיקר תאי GFP +.
   הערה: בצע בדיקה זו לאחר כל הפעלת מיון כדי לאמת את אסטרטגיית השער של FACS⁵⁷.

13. מיצוי RNA וכימות איכות RNA במערכת אלקטרופורזה אוטומטית לבקרת איכות

הערה: כל עבודת ה-RNA צריכה להתבצע בזהירות רבה כדי למנוע זיהום ב-RNase (כולל הכנה קפדנית של ריאגנטים, חומרים מתכלים ושיטות עבודה מומלצות ל-RNase).

הערה: בצע את כל השלבים שבהם הדגימות מכילות פנול ו/או כלורופורם במכסה אדים.

1. להפשיר בקבוקונים של תאים בטריזול בטמפרטורת החדר.
2. בעזרת קצה פילטר P200 קצה פיפטה, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להומוגניזציה של הדגימה.
3. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
4. הוסף 0.2 מ"ל כלורופורם לכל 1 מ"ל של ריאגנט טריזול המשמש לליזה, ולאחר מכן מכסה היטב את הצינור.
5. הופכים את הצינורות 15 פעמים, ודוגרים (בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס) למשך 2-3 דקות.
6. צנטריפוגה של הדגימה למשך 15 דקות ב-12,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס. התערובת נפרדת לפנול-כלורופורם אדום תחתון, אינטרפאזה ושלב מימי עליון חסר צבע.
7. אסוף אך ורק את השלב המימי העליון המכיל את ה-RNA והעביר לצינור חדש של 1.5 מ"ל נקשר DNA/RNA.
   הערה: במקרים מסוימים, אם יחס התאים במאגר הביציות שנשר מממיין התאים לטריזול גדול מיחס דגימה של 1:3: טריזול-LS, תכולת המלח הגבוהה של מאגר הביצים עלולה לגרום להיפוך השכבות; אם זה קורה, הוסף עוד Trizol-LS וחזור על ההיפוך והצנטריפוגה. ניתן להימנע מכך גם אם תשים לב לעלייה בנפח הדגימה לאחר המיון; אם היחס של 1:3 לא נשמר, הוסף מספיק טריזול לפני תחילת מיצוי ה-RNA.
8. כדי לטהר עוד יותר את ה-RNA השתמש בכימיה של עמודות מיצוי RNA.
9. השתמש במערכת האלקטרופורזה האוטומטית של בקרת האיכות כדי למדוד את מספר שלמות ה-RNA (RIN) ולאשר RNA RIN של 8.0 ומעלה לקלט לניסויי ריצוף RNA הבאים.

תוצאות

מודל נמטודה של אקסיטוטוקסיות וזיהוי נוירונים מנוונים בוואקאולציה
הנתונים המוצגים כאן משוכפלים מפרסומים קודמים^37,38. כדי לחקות ניוון עצבי המושרה על ידי אקסיטוטוקסי, נוקאאוט של גן טרנספורטר גלוטמט (glt-3) משולב עם רקע טרנסגני רגיש עצבי (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L); Pglr-1::GFP)]). המבנה הטרנסגני מתבטא בתאי עצב המבטאים קולטן GLutamate 1 (GLR-1, תת-יחידה קריטית של קולטני AMPA) ומעקב אחריו ב...

דיון

בעוד שהמחלוקות והכשלים הרווחים מצביעים על כך שאקסיטוטוקסיות מציגה תהליך קשה במיוחד לפענוח, ניתוח האקסיטוטוקסיות בנמטודה מציע אסטרטגיה אטרקטיבית במיוחד להאיר מסלולי מוות של תאי עצב שמורים בצורה קריטית זו של ניוון עצבי. החוקר יכול להסתמך על האוסף העשיר של כלי המחקר הזמינים במערכת זו, ובמיוחד על השקיפות של בעל החיים (המאפשר ניתוח in vivo) והרפרטואר הגדול של מוטציות ברות קיימא (זמין בחינם מה-CGC או מוכן בחברה על ידי טכניקות כמו מוטגנזה EMS ו-CRISPR). יתר על כן, התקדמות המחקר נהנית מהקלות היח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגר	VWR	AAA10752-0E
בקטופפטון	VWR	90000-264
BD FACSAriaIII
BD אקונומיקה	כל משק בית
CaCl2	VWR	97062-586
CaCl2· 2 ש'<תת>2O	BioExpress	0556-500G
, PluriStrainer מיני 70um	PluriSelect	43-10070-40
מסננת תאים, PluriStrainer מיני 5um	PluriSelect	43-10005-60
צנטריפוגה - 15-50 מ"ל Sorval benchtop  LEGENDX1R TC	פישר מדע	75618382
צנטריפוגה - מיקרופוגה ; Ependorff 5424	VWR	MP022629891
כלורופורם	VWR	97064-680
כולסטרול	סיגמא	C8667-25G
DAPI	פישר מדע	EN62248
קרח יבש	יונייטד סיטי אייס קיוב
DTT	VWR	97061-340
E. coli OP50	CGC	OP50
אתנול (100%)	VWR	EM-EX0276-1S
אתנול (90%)	צינורות VWR	BDH1160-4LP
FACS ארה	"ב Sci	1450-2810
טיפים לסינון	ארה"ב מדע	1126-7810
זכוכית 10 מ"ל פיפטות סרולוגיות	ארה"ב Sci	1071-0810
בלוק חימום	ביואקספרס	D-2250
Hepes	VWR	97061-824
שמן טבילה - Carl Zeiss Immersol	Fisher Sci	12-624-66A
איזופרופנול		VWR EM-PX1830-4
KCl	VWR	BDH9258-2.5 ק"ג
KH2PO4	VWR	BDH9268-2.5KG
צינורות כריכה נמוכה 1.5 מ"ל	ארה"ב Sci	4043-1021
Metamorph Imaging Software	Molecular Devices Molecular MgCl
2	VWR	97063-152
MgCl2· 6H2O	BioExpress	0288-500g
MgSO4	VWR	97061-438
מיקרוסקופ, קונפוקלי, להדמיה פלואורסצנטית	Zeiss	LSM 880
מיקרוסקופ, הפוך, להדמיה פלואורסצנטית	Zeiss	Axiovert 200 M
מיקרוסקופ  מצלמה	Q-Imaging	Retiga R1
מיקרוסקופ מקור אור להדמיה פלואורסצנטית	Lumencor	SOLA SE מנוע
, Nomarski DIC	Zeiss	Axiovert Observer מיקרוסקופ A1
, Nomarski DIC	Nikon	Eclipse Ti-S
Na2HPO4	VWR	97061-588
NaCl	VWR	BDH9286-2.5 ק"ג
NaOH	VWR	97064-476
צלחות פטרי, 100 מ"מ	פישר מדע	FB0875712
צלחות פטרי, 60 מ"מ	TriTech	T3308
בקר פיפט		P2002
פיפטור P10 טיפים	ארה"ב מדע	1110-3000
פיפטור P1000 טיפים	ארה"ב מדע	1111-2020
פיפטור P200 טיפים	ארה"ב מדע	1110-1000
פרונאז	סיגמא	P8811-1G
RNAse תרסיס משם	פישר מדע	7000TS1
פיפטות סרולוגיות ללא RNA	"ב מדע	1071-0810
50 מ"ל ללא RNA ארה	"ב מדע	5622-7261
RNeasy מיקרו	קיגן	74004
SDS	VWR	97064-496
סטרפטומיצין סולפט	סיגמא	S6501-100G
סוכרוז	VWR	AAJ63662-AP
SUPERase· in מעכב RNase	פישר Sci	AM2694
בקרת איכות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית: Tapestation - רגישות גבוהה RNA ScreenTape	אג'ילנט	5067-5579
Tapestation - סולם רשת RNA בעל רגישות גבוהה	אג'ילנט	5067-5581
Tapestation - מאגר דגימת RNA ברגישות גבוהה	Agilent	5067-5580
Tapestation - IKA MS3 vortexer	Agilent/IKA	4674100
Tapestation - מתאם מערבולת IKA ב-2000 סל"ד	Agilent/IKA	3428000
Tapestation - טיפים לטעינה	Agilent	5067- 5152 או 5067- 5153
Tapestation - כובע אופטי 8x Strip	Agilent	401425
Tapestation - צינור אופטי 8x Strip	Agilent	401428
בקרת איכות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית: TapeStation 2200	Agilent	G2964AA
Tetramisole	Sigma	L9756-10G
בסיס	TrisFisher Sci	BP152-500
Tris hydrochloride	Fisher Sci	BP153-500
Trizol-LS	Fisher Sci	10296-010
Wescor Vapro 5520 מד אוסמומטר לחץ אדים	Fisher Sci	NC0044806
Wheaton Unispense μ מתקן P	VWR	25485-003