מאמר שיטה

ספרואידים לב כמו במבחנה ביו מהונדסת רקמות לב לחקור פתופיזיולוגיה לב אנושי

9.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61962

⸱

23 בינואר 2021

 , 
1University of Newcastle, 2University of Sydney, 3Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, 4University of Technology, Sydney

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה נועד להמציא כדורי לב תלת-מיוד (CSs) על-ידי שיתוף תאים בטיפות תלויות. CSs משובץ קולגן מטופלים עם דוקסוקובין (DOX, סוכן קרדיוקסי) בריכוזים פיזיולוגיים כדי מודל אי ספיקת לב. במבחנה בדיקות באמצעות CSS שטופלו DOX עשוי לשמש כדי לזהות טיפולים חדשניים עבור חולי אי ספיקת לב.

תקציר

למרות מספר התפתחויות בהנדסת רקמת לב, אחד האתגרים העיקריים להתגבר נשאר הדור של רשת כלי דם פונקציונלית באופן מלא הכוללת מספר רמות של מורכבות כדי לספק חמצן וחומרים מזינים בתוך רקמות לב מהונדסות ביולוגית. המעבדה שלנו פיתחה מודל תלת מימדי במבחנה של הלב האנושי, המכונה "ספרואיד לב" או "CS". זה מציג תכונות ביוכימיות, פיזיולוגיות, פרמקולוגיות האופייניות ללב האנושי והוא נוצר על ידי שיתוף culturing שלושת סוגי התאים העיקריים שלה, כגון מיוציטים לב, תאי אנדותל, פיברובלסטים. אדם המושרה תאי גזע pluriyocytes נגזר (hiPSC-CMs או iCMs) הם שיתוף תרבותיות ביחסים הערך את אלה שנמצאו vivo עם פיברובלסטים לב אנושיים (HCFs) ותאי אנדותל עורקים אנושיים (HCAECs) בתליית לוחות תרבות טיפה במשך שלושה עד ארבעה ימים. הניתוח הקומי של CSs מוכתם נוגדנים נגד הלב Troponin T, CD31 ו vimentin (סמנים עבור מיוציטים לב, תאי אנדותל ופיברובלסטים, בהתאמה) מראה כי CSs להציג רשת תאים אנדותל מורכב, דומה אחד הילידים נמצא בלב האדם. זה מאושר על ידי ניתוח עיבוד תלת-ממדי של תמונות קונפוקל אלה. CSs גם להציג חלבוני מטריצה חוץ תאית (ECM) אופייני ללב האנושי, כגון קולגן סוג IV, למינין ופיברונקטין. לבסוף, CSs להציג פעילות מתכווצת נמדדת כהתכווצות סינכרונית קרוב יותר לזה אופייני ללב האנושי בהשוואה CSs המכילים iCMs בלבד. כאשר מטופלים עם סוכן אנטי-סרטן cardiotoxic, כגון דוקסובויצין (DOX, משמש לטיפול בלוקמיה, לימפומה וסרטן השד), הכדאיות של CSS שטופלו DOX מופחתת באופן משמעותי ב 10 μM עיכוב גנטי וכימי של סינתאז תחמוצת החנקן אנדותל, יעד במורד הזרם של DOX ב HCFs ו HCAECs, הפחית רעילותה בCSS. בהתחשב בתכונות ייחודיות אלה, CSs משמשים כיום כמו מודלים חוץ-חוץ לחקר ביוכימיה לב, פתופיזיולוגיה, ופרמקולוגיה.

מבוא

הלב האנושי יש יכולת התחדשות מוגבלת בעוד מחלות לב וכלי דם (CVD) נשאר הגורם העיקרי למוות ברחבי העולם למרות ההתקדמות האחרונה בהנדסת רקמות וטכנולוגיות תאי גזע1. הצורך בטיפולים חדשניים כולל גישות מולקולריות ותלתיות כדי לתקן לב פגום או כדי למנוע לב להיכשל הוא אחד הצרכים הקליניים הנוכחיים העיקריים עבורחולים הסובלים ממחלות לב 2,3,4. המטרה העיקרית של הנדסת רקמת לב היא לפברק רקמת לב תלת מימדית (3D) המציגה תכונות מולקולריות, תאיות וחוץ תאיות האופייניות ללב אנושי, כולל רשת כלי הדם שלה ותפקוד כיווץפיזיולוגי 4,5,6.

על מנת ביו-הנדסה ולהמציא רקמת לב אנושית תפקודית המחקה את הלב האנושי עבור במבחנה וביישומים vivo, מספר גישות נחקרו כולל רקמות לב מהונדסות (EHTs), גיליונות תאים ותרבויות spheroid7,8. עם זאת, רקמות אלה להיכשל בסיכום microenvironment 3D אופטימלי האופייני ללב האנושי ואת השימוש הפוטנציאלי שלהם עבור חולי CVD לא יכול לתרגם ישירות מהספסלליד המיטה 7. הסיבה לכך היא שהם לא לסיכום הביולוגיה המורכבת, מורפולוגיה, ופיזיולוגיה של ברקמות לב vivo9. אחד האתגרים העיקריים בהנדסת רקמת לב כולל פיתוח של רשת כלי דם היררכי בתוך רקמת הלב המהונדסת ביולוגית, כמו כל רקמה כי הוא גדול מ 200 μm קוטר מפתחת מוות תאיםבאמצע 2,10. רשת כלי דם שנוצרה כראוי ברקמת לב אנושית ממלאת תפקיד מרכזי באספקת דם, חמצן וחומרים מזינים לתאי לב11. במהלך התפתחות עוברית, נימים כליליים ועורקים טופס באמצעות vasculogenesis (היווצרות כלי הדם דה נובו) ו אנגיוגנזה (דור של כלי דם מאלה קיימים מראש) מתאי אבותל 8,12. פיברובלסטים לב גם לשחק תפקיד מרכזי היווצרות רשת כלי דם נכונה על ידי מתן מטריצה חוץ תאית אופטימלית (ECM)הרכב צמיחה 13,14.

רשת כלי הדם 3D של רקמות לב מהונדסות ביולוגית שולטת בהישרדות תאים ותפקוד על ידי יצירת מעברי צבע של חמצן וחומרים מזינים ואיתות פרקרין, כגון אינטראקציה עם תאים הומוטיפיים, אינטראקציה הטרוטיפית עם תאים, אינטראקציה של תאים באמצעות חלבונים מסיסיםמופרשים ותאי לאינטראקציותECM 3,10,15,16,17,18. זה מונע מוות של תאים באמצע הרקמה ומקדם את הכדאיות של תאים ותפקוד פיזיולוגי ברקמות לב מהונדסותביולוגית 16,18,19.

תרביות ספרואידים מתאי גזע נחקרו לאחרונה כמו במודלים מבחנה של הלב האנושי20. כדי לשפר עוד יותר את המיקרו-סביבה הלבית במבחנה, הם כללו את השימוש בכל סוגי התאים העיקריים שנמצאו בלב האנושי, כגון מיוציטים לביים, תאי אנדותל ופיברובלסטים. תרביות ספרואיד להציג את התמיכה המבנית 3D הנדרש עבור תאים לגדול ולתפקד, ניתן להשתמש בהנדסה ביולוגית רשתכלי דם 14,20,21,22. בהקשר זה, המעבדה שלנו פיתחה spheroids לב אנושי (CSs) על ידי שיתוף culturing מיוציטים לב, תאי אנדותל ופיברובלסטים ביחסים שנמצאובלב האדם 14. מודל זה הוא הרחבה של מודל כדורי הלב חדרי חולדה, שנוצר על ידי שיתוף culturing תאי לב בתרביות טיפה תלויה, משמש מודל פיברוזיס לב21. CSS האדם יכול לשמש כמו רעילות assays על ידי טיפול בהם דוקסורוביצין (DOX, סוכן אנטי סרטני המשמש לטיפול בלוקמיה, לימפומה וסרטן השד), אשר ידוע כדי לגרום פיברוזיס לב ואי ספיקת לב (HF) אפילו 17 שנים לאחר somministrationשלה 14.

בכתב יד זה, אנו מתארים כיצד ליצור CSS אנושי על ידי שיתוף culturing אנושי המושרה תאי גזע פלוריוציטים נגזר cardiomyocytes (hiPSC-CMs או iCMs), פיברובלסט לב אנושי (HCFs) ותאי אנדותל עורקים כליליים אנושיים (HCAECs) בתרביות טיפה תלויות. על מנת להשתמש ותמונה CSs עבור בדיקות במבחנה, הם מוטבעים בג'ל קולגן. הניתוח הנומק של CSS מוכתם נוגדנים נגד CD31, סמן לתאי אנדותל, הראה כי תאים אלה יוצרים רשת דומה לזה שנצפה vivo. כדי לגרום HF וסוכני רומן מבחן פוטנציאליים שעשויים לטפל או למנוע את זה, CSs טופלו עם 10 μM DOX (ריכוז נמצא במחזור הדם של חולי סרטן המקבלים את התרופה). כאשר מוכתם קלצ'ין-AM ואתידיום הומודימר (מכתים תאים חיים ומתים, בהתאמה), CSS שטופלו DOX להציג ירידה משמעותית בכדאיות בהשוואה CSS שלא קיבל את התרופה. CSs גם להציג פעילות כיווץ הומוגנית כאשר בקצב באמצעות גירוי פוטנציאלי שדה בין 1 ו 3 הרץ.

פרוטוקול

הערה: hiPSC-CMs המשמשים עבור פרוטוקול זה זמינים באופן מסחרי. נא בקשו את אישור ועדת האתיקה האנושית המוסדית לפני תחילת עבודה זו במידת הצורך.

1. פיברובלסט לב אנושי ותרבית תא אנדותל ציפוי וצמיחה

  1. הפשרה cryovials המכיל HCFs ו HCAECs באמבט מים ב 37 ° C לדקה אחת.
  2. להעביר cryovials תחת זרם למינאר סטרילי זרימה biosafety ארון כיתה 2.
  3. לאסוף 1 מ"ל של מתלה תא מן cryovials באמצעות קצה פיפטה μL 1000 ולהוסיף לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 7 מ"ל של פיברובלסט לב אנושי בינוני עבור HCFs ו 7 מ"ל של אדם Meso אנדו צמיחה בינוני עבור HCAECs.
    הערה: על מנת לאסוף את רוב התאים מכל cryovial, לשטוף אותם פעמיים עם 1 מ"ל של תרבות בינונית מאותו צינור 15 מ"ל.
  4. מערבבים בעדינות מתלי תאים.
  5. העבר מתלי תאים כדי להפריד בין מבחנות תרבות T75 באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
  6. דגירה תאים ב 37 °C עם 5% CO2.
  7. לאחר 18 שעות, לשאוף את המדיום משני מבחנות התרבות ולשטוף אותם פעם אחת עם פוספט סטרילי אגירה תמיסת מלח (PBS) כדי להסיר הקפאת תאים בינוניים ומתים.
  8. החלף PBS עם 7 מ"ל של תרבות מתאימה בינוני לכל בקבוקון תרבות דגירה ב 37 ° C.
  9. לבחון את ההתרחבות הסלולרית ואת הכדאיות באופן קבוע ולהחליף את המדיה כל יומיים עד לתאים להגיע 80-90% confluency.

2. ציפוי תרבות iCM וצמיחה

  1. לפני מעיל שני מבחנות תרבות T25 עם 2 מ"ל של PBS המכיל 40 μg / מ"ל של פיברונקטין (FN) דגירה ב 37 °C, 5% CO2 לפחות 4 שעות.
  2. לאחר 4 שעות, לאסוף cryovial אחד המכיל iCMs ולמקם אותו באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות.
  3. הזז את ההקפאה תחת ארון אבטחה ביולוגית של זרימת למינאר סטרילי מחלקה 2.
  4. העבר בעדינות את ה-iCMs מההקפאה לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל.
  5. לשטוף את cryovial iCMs ריק עם 1 מ"ל של ציפוי טמפרטורת החדר בינוני כדי לשחזר את כל התאים שיורית. העבר את 1 מ"ל של ציפוי בינוני לשטוף מן cryovial טיפה חכם מעל 90 שניות לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל המכיל את מתלי תא iCM.
    הערה: מערבבים בעדינות את הצינור תוך הוספת המדיום כדי לערבב את הפתרון לחלוטין ולהקטין את ההלם אוסמוטי על התאים הפשרת.
  6. לאט להוסיף 8 מ"ל של טמפרטורת החדר ציפוי בינוני לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. להוסיף את הראשון 1 מ"ל dropwise מעל 30 - 60 s. לאחר מכן, הוסף את אמצעי האחסון הנותר על-פני 30 השניות הבאות. מערבבים בעדינות את צינור הצנטריפוגה תוך הוספת מדיום הציפוי. מערבבים בעדינות את תכולת צינור הצנטריפוגה 50 מ"ל על ידי היפוך 2 - 3 פעמים (הימנעות מרעידות נמרצות או מערבולות).
  7. מיד לבצע את ספירת התא באמצעות hemocytometer ולקבוע את צפיפות התא קיימא (בתאים / mL).
  8. קח את מבחנות ה-T25 המצופים מראש FN ושאף את פתרון FN-PBS מבלי לתת למבחנות להתייבש. כדי להוסיף נפח זריעה של iCMs (1.6 x 106 iCMs קיימא ב 8 מ"ל טמפרטורת חדר ציפוי בינוני).
  9. ICMs תרבות באינקובטור עבור 48 שעות ב 37 °C, 5% CO2.
  10. הפשיר את מדיום התחזוקה למשך הלילה ב-4°C יום לפני השימוש.
  11. לצייד את מדיום התחזוקה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ולהשתמש בו באופן מיידי.
  12. לאחר יומיים, העבר את מבחנות ICMs T25 מתחת לארון ההסתה הביולוגית.
  13. לשטוף בעדינות את התאים המתים ופסולת על ידי בעדינות pipetting מדיום ציפוי למעלה ומטה 5 פעמים.
  14. שאפף את מדיום הציפוי והחלף ב-8 מ"ל של מדיום תחזוקה חם מראש. מניחים את מבחנות T25 בחזרה באינקובטור. החלף את מדיום התחזוקה כל יומיים ובדוק את הקונפלציה באופן קבוע.

3. בידוד תאים וספירה

  1. התחל על-ידי איסוף HCAECs ו- HCFs הראשון, ולאחר מכן iCMs על-ידי ביצוע שלבים 3.2-3.12.
  2. להכין את תרבות CS בינוני על ידי ערבוב 10 מ"ל של iCMs תחזוקה בינונית, 5 מ"ל של פיברובלסט לב אנושי בינוני ו 5 מ"ל של Meso Endo צמיחה בינונית.
  3. הסר מדיום תרבות מכל בקבוקון רקמות המכיל HCFs ו HCAECs ולשטוף פעם אחת עם 5 מ"ל PBS עבור מבחנות T75. הסר את פי.בי.אס.
  4. הוסף 5 מ"ל של פתרון EDTA טריפסין 0.25% לכל בקבוקון T75 ותדגירה במשך 5 דקות ב- 37 °C, 5% CO2.
  5. לאחר התאים להתנתק, מיד לנטרל את פתרון EDTA trypsin עם 5 מ"ל של תרבות בינונית.
  6. העבר מתלי תאים לצינור 15 מ"ל ותאי צנטריפוגה ב- 300 x g למשך 4 דקות.
  7. הסר את הסופרנטנט בזהירות מכל שפופרת. הוסף 1 מ"ל של CS בינוני לכל גלולת תא ולתוסת אותם מחדש. שמור את הצינור על קרח ולספור תאים באמצעות טריפאן כחול וmocytometer.
  8. הסר מדיום תחזוקה ממבחנות רקמות המכילות iCMs ולשטוף פעם אחת עם 3 מ"ל של PBS.
  9. הוסף 1 מ"ל של 0.25% פתרון EDTA טריפסין לכל בקבוקון T75 דגירה ב 37 °C, 5% CO2. בדוק תאים כל דקה עד למנותק.
  10. לאחר התאים להתנתק, מיד לנטרל את פתרון EDTA trypsin עם 4 מ"ל של תרבות בינונית.
  11. העבר מתלי תאים לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה אותם ב 300 x g במשך 5 דקות.
  12. הסר את הסופרנטנט בזהירות מכל שפופרת. מוסיפים 1 מ"ל של תרבות בינונית לתא ופנסו אותו מחדש. שמור את הצינור על קרח ולספור תאים באמצעות טריפאן כחול וmocytometer.

4.CS ודור וצמיחה

  1. לערבב iCMs, HCFs ו HCAECs ב יחס 2:1:1 על ידי ציפוי 10,000 iCMs, 5,000 HCFs ו 5,000 HCAECs לכל תרבות ירידה תלויה המכילה 20 μL של CS בינוני. כוונן לנפח הסופי עבור המספר הכולל של CSs.
  2. Pipette 20 μL של מתלה תא לתוך כל באר של 384 גם לוח HDC או באופן ידני או באמצעות פיפטה רב ערוצית רובוטית לטיפול נוזלי אוטומטי.
  3. פיפט 1.5 מ"ל של PBS סטרילי בכל צד של הערוץ סביב לוח הטיפה התלויה כדי למנוע ייבוש CSs. דגירה HDC לוח ב 37 ° C.
  4. לבחון היווצרות של CSs על בסיס יומי עד spheroid בצורה מלאה נצפתה ברוב בארות. להוסיף 7.5 μL של CS בינוני זה לזה גם בכל יום אחר עד CS נוצר.

5.CS בהלטה בג'ל קולגן

  1. לאסוף CSs עם קצה פיפטה 1 מ"ל.
    הערה: יש צורך לחתוך את קצה פיפטה סביב 0.2 ס"מ מהקצה לפני השימוש בו עם משטח חד סטרילי (אזמל או מספריים) כדי למנוע כל נזק ג'ל מוטבע spheroids במהלך האוסף שלהם.
  2. לאסוף את מתלה CS לתוך צינור 50 מ"ל על קרח.
  3. צנטריפוגה הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות.
    הערה: יש לשמור את הכדור שהושג על קרח עד לשימוש.
  4. הכן תמיסת ג'ל קולגן (100 μL/well עבור 30 בארות של 96 צלחת היטב) על קרח באמצעות קולגן זנב חולדה וCS בינוני ביחס 3:7.
  5. הסר את חומר העל מהצינור המכיל CSs.
  6. מערבבים את ה-CSs עם הגלולה בתוך תמיסת ג'ל הקולגן.
  7. הוסף 1 μL/mL של 5 מ"מ נתרן הידרוקסיד מתלה ג'ל CS-קולגן ולערבב בעדינות.
  8. מעבירים 100 μL של ג'ל קולגן CS לתחתית שטוחה ברורה 96 גם מיקרו-פלטת פוליסטירן שחורה ותדגירה ב-37°C למשך 30 דקות.

6. מדידות קיימות ורעילות של CSS שטופלו על-ידי DOX

  1. לאחר 30 דקות לאסוף את צלחת 96 באר מהאינקובטור
  2. הכן DOX 10 μM (מבוסס על פרוטוקול שנקבע בעבר עבור מוות תאים ב- CSs14).
    הערה: כדי לבדוק סוכנים אחרים שעשויים להגן מפני HF ב- CSs, צור פתרונות המכילים DOX + סוכן A, B, וכו '.
  3. הוסף 100 μL של פתרונות המכילים DOX ו / או סוכנים אחרים לכל באר. תרבויות בקרה מכילות מדיה ללא כל DOX.
  4. דגירה צלחת עבור 18 שעות ב 37 ° C, 5% CO2.
  5. ביום שלמחרת, לאסוף את פתרונות מלאי Reagent כתמים חיים / מתים ולאפשר להם להפשיר על קרח בחושך בארונות אבטחה ביולוגית.
  6. הכן פתרון המכיל כתם Hoechst, 4 μM של אתידיום הומודימר ו 2 μM calcein-AM.
  7. להוסיף 100 μL של כתם Hoechst, קלצ'ין-AM / תמיסת הומודימר אתידיום לתוך כל באר.
  8. למדוד את הפלואורסצנס לתוך כל באר ב 645 צפון לm עבור אתידיום הומודימר וב 530 צפון צפון עבור calcein-AM, בהתאמה, באמצעות קורא מיקרופלאטים multimode.
  9. העבר מדידות פלואורסצנטיות ל- Graphpad PRISM (או תוכנה מקבילה לניתוח סטטיסטי).
  10. השתמש בתוכנה של מנסרה של GraphPad לניתוח נתונים וסטטיסטיקה.
  11. לבקרת איכות, לבדוק תחת מיקרוסקופ epifluorescence עבור כתמים גרעין, יחד עם calcein-AM ואתידיום הומודימר.

הערכת פונקציית .CS 7

  1. לאסוף את המיקרו-פלטה כפי שהוכן בשלב 5.8.
  2. הפעל את המחשב המכיל את תוכנת IonOptix עבור זיהוי קצה מבוסס וידאו, ממשק הסיוע לפלואורסצנטיות וממריץ השדה MyoPacer.
  3. מניחים פתק כיסוי חדש על פלטפורמת מחזיק הרקמות והרכיבו אמבט מים עם אלקטרודות.
  4. אסוף בעדינות CSs מג'ל קולגן באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל לחתוך 0.5 מ"מ מהקצה ולהעביר אותם לצינור בז. הוסף מדיה ל- CS כדי למנוע ייבוש של CSs. העברת CS (אחד בכל פעם) עם כמה μL של מדיה על הבמה של מערכת IonOptix.
  5. בחר את ה- CS שיש לנתח באמצעות הגדרת פסגות בצד שמאל וימין של CS באמצעות תוכנת IonOptix.
  6. השתמש במנתח התנועה המבוסס על מחשב כדי לעקוב אחר התנועה של קצוות CS.
    הערה: בדרך כלל, התכווצות נמדדת ב- % קיצור תאים או בקיצור % שברים. במקרה הזה, מדדנו קיצור של ספרואידים.
  7. ייצב הן את פסגות התאמת סף ואפשרויות קצה מהמחשב.
  8. לחשוף CSs לתדרים שונים (0.3, 0.6, 1, 2 ו- 3 הרץ) ולחץ (1, 2, 3 ו- 5 V) באמצעות ממריץ השדה Myopacer.
  9. קיצור אורך CS של DOX ו- CSs שלא טופלו על-ידי DOX.

8. מיקרוסקופיה של CSS: קיבעון ואימונולציה

  1. לאסוף את צלחת 96 באר לאחר 30 דקות (כפי שהוכן בשלב 5.8) ולתקן CSs ב 4% paraformaldehyde (PFA) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
  2. הסר PFA ולשטוף שלוש פעמים עם PBS המכיל 0.01% נתרן אזיד (PBSA).
  3. הסר PBSA.
  4. הוסף 200 μL של PBSA המכיל 0.02% Triton-X-100 לכל באר במשך 30 דקות על שייקר.
    הערה: שלב זה מחלחל ל- CSs להסתננות נוגדנים טובה יותר.
  5. הוסף 200 μL של 3% אלבומין סרום בשר בפתרון PBSA במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: שלב זה חוסם איגוד נוגדנים לא ספציפי ב- CSs.
  6. הכן פתרון המכיל 10 μg/mL של נוגדנים נגד בני אדם עכבר ראשי נגד CD31 מדולל בחסימת פתרון.
  7. הוסף 100 μL של פתרון נוגדן ראשי לכל באר ותדגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר.
  8. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBSA במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על צלחת נדנדה.
  9. הכן פתרון המכיל כתם DNA Hoechst ו 10 μg / מ"ל של Cy3-conjugated חמור משני נגד עכבר נוגדן מדולל בחסימת פתרון.
  10. הוסף 100 μL של תמיסת נוגדנים משנית המכילה כתם Hoechst לכל באר ודגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר.
    הערה: מכסים את הצלחת בנייר כסף מאלומיניום מנומה זו ואילך.
  11. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים במשך 20 דקות עם PBSA בטמפרטורת החדר על צלחת נדנדה.
  12. להוסיף 100 μL של Vectashield הרכבה בינוני לכל באר.
  13. CSS תמונה תחת מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal. בצע מקטע אופטי לאורך ציר Z וכווץ תמונות לתוך מישור מוקד יחיד באמצעות תוכנת ImageJ.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מייצג גישה חלופית לפיתוח רשת תאי אנדותל לב מורכבת בתוך רקמת לב מהונדסת ביולוגית עם יכולת תפקוד תאים משופרים בהשוואה למודליםקיימים (איור 1). היוון של 3D במיקרו-סביבה לב vivo בתוך CSs קידם את תגובתם DOX בריכוז שנמצא במחזור הדם של חולי סרטן (בין 5 ו 10 μM, איור 2). DOX שטופל CSs הציג הפחתה משמעותית סטטיסטית בכדאיות תאים לעומת שליטה (אין DOX) CSs בתוך 24 שעות(איור 2), השפעהרעילה שנצפתה בקרב חולי סרטן אנושיים אפילו 17 שנים לאחר הטיפול שלהם בתרופה.

figure-results-1
איור 1. היווצרות CS וניתוח כלי דם. (A) פרוטוקול המציג את השלבים להיווצרות CS מהתרבות ההפופה של iCMs, HCAECs ו- HCFs בטיפות תלויות. תמונות ברייטפילד בצד ימין מראות את היווצרות הפרוגרסיב של ספרואידים מתאים בודדים בטיפות תלויות. (ב)ערימות Z מכווצות של תמונות קונפוקליות של CS מוכתם נוגדנים נגד הלב Troponin T (cTNT), PECAM ו vimentin, הכתים מיוציטים לב, תאי אנדותל ופיברובלסטים, בהתאמה. נתון זה שונה מ-14. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2
איור 2. קיימות ורעילות ב-CSS. ניתוחים סטטיסטיים של calcein-AM(A)ואתידיום הומודימר (ב)פלואורסצנס של CSs שטופלו בנוכחות מדיה בלבד (DOX 0 μM) או דוקסורצין (10 μM). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

דיון

מבחינה התפתחותית, היווצרות רשת כלי דם נכונה היא קריטית לדור של רקמות פונקציונליות, כוללהלב האנושי 10,12,23,24,25,26. התחשבות בכלי הדם הנכונים של רקמות תלת-מידות מאפשרים החלפה של חמצן, גורמי גדילה, מולקולות איתות וחומרים מזינים, מניעת פיתוח של נמק תא בתוך כל רקמה עבה יותר מ 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. כיום זמין במבחנה מודלים לב 3D מציגים רשת כלי דם הם בעיקר הצגת רשתות כלי דם בגודל נכים, לא מאורגן וחסר כלי דם מסועף מורכב היררכי שנצפה vivo6,8,29. הגישה החלופית לפיתוח רשת תאי אנדותל לב מורכבת המתוארת בכתב יד זה מציגה יכולת ותפקוד משופרים של תאים בהשוואהלמודלים קיימים( איור 1 )14,22. 3D במבחנה CSs מודל הלב האנושי על ידי סיכום טוב יותר שלה במיקרו-סביבה vivo, כולל רכיבים מולקולריים, תאיים וחוץתאיים שלה 14,22. דור CS מתאי גזע הנגזרים מתאי גזע בטיפות התלויות מאפשרים את התרבויות שלהם בתנאים מוגדרים (למשל, סוגי תאים ויחס, היווצרות רקמות נכונה). תרבויות משותפות של iCMs יחד עם HCFs ו HCAECs בתוך CSs להגדיר את crosstalk מולקולרי ותא המווסת את פתופיזיולוגיה הלב, כולל תפקוד ההתכווצות שלה ותגובה לתרופות בריכוזים שנמצאו במחזור הדם שלהמטופל 14. בשל תכונות ייחודיות אלה, CSS נוצלו כדי מודל פיברוזיס לב, תוצאה חמורה של אוטם שריר הלב ואי ספיקת לב21. המחקרים הקודמים שלנו הראו כיצד הנוכחות של שני תאי אנדותל ופיברובלסטים היא קריטית עבור היוון מחדש של מיקרו-סביבה של כלי הדם בלב האדם, המאפשר תצהיר אופטימלי של חלבוני ECM נגזר פיברובלסט, כגון למין, פיברונקטין קולגן סוג IV, מקומי בסמיכות של רשת תאים אנדותלמתפתחת 14,21.

DOX היא תרופה קרדיוקסית ידועה שעשויה לפתח אי ספיקת לב חולי סרטן אפילו 17 שנים לאחר הטיפול שלהם30. אף על פי כן, זה נשאר תרופה של בחירה לטיפול לוקמיה ולימפומה בחולים ילדים וסרטן השד בנשים30. טיפול DOX ב CSS שימש אז כדי מודל אי ספיקת לב (HF) במבחנה כדי ללמוד את שני המנגנונים ויסות רעילות מיוציטים לב, תאי אנדותלופיברובלסטים 14 ולדגם HF המושרה פיברוזיסלב 21. הכדאיות של תאים הופחתה סטטיסטית ב- DOX שטופלו CSs בתוך 24 שעות כאשר נחשף לתרופה בריכוז שנמצא במחזור הדם של חולי סרטן (בין 5 ו 10 μM)14 (איור 2). מחקרים קודמים במעבדה שלנו גם הדגימו את ההשפעות הרעילות של DOX על שני תאי אנדותל הלב ופיברובלסטים באמצעות סינתאז תחמוצת החנקן אנדותל (eNOS) באמצעות מעכבים גנטיים וכימיים של מסלול איתותזה 14. השימוש גנטי (NOS3 shRNA) וכימי (N5-(1-iminoethyl)-L-ornithine, דיהידרוצלוריד, או L-NIO) אנטגוניסטים של מסלול איתות eNOS כי יעד במורד הזרם של DOX מנע את השפעותיו הרעילות הן בתאי אנדותל הלב והן פיברובלסטים14.

פעילות כיווץ בתוך CSs נמדדה גם הודות לצימוד חשמלי של תאי לב כאשר נחשפים לגירוי פוטנציאלי שדה. מצאנו כי CSs תרבות עם מדיה שליטה (DOX 0 μM) חוזה באופן ספונטני והומוגני בקצב מכות שניתן לפרוע על ידי גירוי שדה בתוך 1 ו 3 הרץ, דומה עם לב אנושי בריא. מצד שני, CSS שטופלו DOX אינם עוקבים אחר הגירוי החשמלי כפי שהם לא יכולים חוזה. יחד עם המדידות של תאי הכדאיות והרעילות באמצעות calcein-AM ואתידיום הומודימר, תסא פונקציונלי זה עבור תפקוד CS contractile לאפשר את ההערכה של התרחיש המורכב אופייני ללב האנושי במבחנה, כרגע לא בר השגה עם מודלים אחרים. בהשוואה למדידות פעילות מתכווץ של תאי לב בודדים באמצעות אותה מערכת, אנחנו לא יכולים לדמיין ומדיד את sarcomere ב CSS. לכן, אנו מוגבלים למדידות של קיצור % ספרואיד לאורך זמן, תחסה שהיינו צריכים לפתח בתוך המעבדה שלנו. כאשר אנו שולטים במספר התאים, אנו שותף לתרבות בכל CS ולכן הגודל של כל CS, אנו משתמשים CSs עם גודל דומה כי אכן להציג פונקציה מתכווצת הומוגנית. עם זאת, גם במקרה שיצרנו CSS בגדלים שונים, פעילות ההתכווצות שלהם לא השתנה.

חשוב גם לדווח כי האופי הרב-תאי של CSs הופך אותם כבדים מספיק כדי למצוא את המקום בתחתית הכיסוי במערכת יון-אופטיקס, גם במקרה שהם superfused. . בהתבסס על העובדה שCSS יושבים לבדם בעמדה ספציפית, אנחנו לא צריכים לגרום להם לדבוק בכיסוי, בניגוד למה שנעשה בדרך כלל עם תאי לב בודדים ברוב המעבדות.

הניתוח המיקרוסקופי של CSs מוכתם נוגדנים נגד טרופונין לב T, CD31/PECAM, ו PECAM (כמו סמנים עבור iCMs, HCAECs, ו HCFs, בהתאמה) הראה היווצרות של רשת תא אנדותל(איור 1,כחול). כדי לא לכלול את הנמק בחלק הפנימי של CSS, הערכה מרחבית של הכדאיות של התא בוצעה במעבדה שלנו על ידי ניתוח confocal של calcein-AM / אתידיום הומודימר מוכתם CSs(נתונים לא מוצגים). עם זאת, חשוב להכיר בכך שהתפתחויות עתידיות בתחום הביו-תברוקציה כדי לסכם טוב יותר תכונות מורכבות אחרות האופייניות ללב האנושי ב-vivo, שכרגע אינן זמינות במודל הקיים. אלה כוללים: i) פונקציה מכווץ אופייני cardiomyocytes למבוגרים; ii) זרימת דם וכוחות לחץ; iii) איתות פרקרין; ד) תגובה חיסונית, אשר תהיה קריטית כדי לשפר את זה ומודלים אחרים במבחנה לבמודלים 6. כמו כל מודל אחר שואף לסכם את התכונות העיקריות של רקמה בריאה או מצב מחלה, הפרוטוקול עבור הדור והשימוש של CS המתואר בכתב יד זה שמטרתו לסייע לחוקר לענות על שאלות ספציפיות, זה לא יכול להיות ממצה באמצעות גישה זו. לדוגמה, השימוש הפוטנציאלי של תאים הנגזרים ממטופלים עבור הדור של CSs יספק כלים לרפואה מותאמת אישית, כרגע לא זמין באמצעות תפוקה גבוהה זמין בדרך כלל עבור מחקר לב וכלי דם.

לסיכום, הראינו דרך פשוטה כדי ליישר טוב יותר את המיקרו-סביבה של הלב האנושי באמצעות תאי לב. כדורי לב מציגים רשת תא אנדותל שבאופן טוב יותר מסכמת את זו שבלב האנושי בהשוואה לתרביות חד שכבתיות של תאי לב. בהתחשב בתכונות הייחודיות שלהם, הם מייצגים כלים מתקדמים לבדיקות חוץ-חוץ למחקר לב וכלי דם. מחקרים עתידיים באמצעות תאים הנגזרים ממטופל יכולים לספק אפשרויות לרפואה מותאמת אישית ולטיפלים חדשניים כדי למנוע ולטפל טוב יותר במחלות לב וכלי דם.

תודות

תודה מיוחדת לנט ג'ונסטון על ההקלטה ועריכת הסרטון.

פונאם שארמה נתמך על ידי אוניברסיטת ניוקאסל עם מלגות UNIPRS ו- UNRS Central &Faculty School (UNRSC5050). קרמיין גוי נתמך על ידי מימון זרעי UTS, הארכיבישוף הקתולי של סידני גרנט למחקר תאי גזע למבוגרים ומענק מחקר ניתוח לב-חזה קרן בית הספר לרפואה של סידני.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-AldrichA1933
חמור נגד עכבר נוגדנים משנייםמעבדות מחקר אימונולוגיות ג'קסון, בע"מ715-165-150נוגדן משני מצומד ציאנין Cy3
דוקסורוביצין הידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'D1515
פיברונקטיןסיגמא-אולדריץ'F1141-1MGמפלזמת בקר
פיברובלסטים לבביים אנושיים (HCFs)Cell Applications, Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב306AK-05a5x10^5 תאים (מבוגרים), בינוניים ובינוניים ריאגנטים של תת-תרבות
תאי אנדותל של העורקים הכליליים האנושיים (HCAECs)Cell Applications, Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב300K-05a5x10^5 תאים (מבוגרים), בינוניים ובינוניים תת-תרבות ריאגנטים
קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושי (iCMs)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.ערכת קרדיומיוציטים של iCellR1057
HCF GrowthMedium Cell Applications, Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב316-500
Human MesoEndo Cell Growth MediumCell Applications, Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב212-500
LIVE/DEAD כדאיות/ערכת ציטוטוקסיותInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בL3224
מדיום תחזוקה (iCells)Fujifilm Cellular דינמיקס, בע"מערכתקרדיומיוציטים של תאים R1057, 01434
עכבר חד-שבטי אנטי-אנושי CD31/PECAMBD Pharmingen, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב566177
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342)Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בR37605
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
תמיסת מלח סיגמא-אולדריץ'D8537
מדיום ציפוי (iCells)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.ערכת קרדיומיוציטים של תאיםR1057
קולגן זנב עכברושסיגמא-אולדריץ'C3867
נתרן אזידסיגמא-אולדריץ'S2002
טריפסין– EDTA, 0.25%Gibco, Thermofisher Scientific25200072
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco, Thermofisher Scientific15250061
Triton-X 100Sigma-AldrichX100
צלוחיות תרבית רקמות (T25)Thermofisher Scientific156367
96 בארות שטוח שקוף שחור פוליסטירן מטופל TC מיקרופלטותקורנינג, ניו יורק, ארה"ב3603
384 באר צלחת טיפה תלויה3D ביומטריקס, אן ארבור, מישיגן, ארה"בHDP1385
, 01434, 01434

מקורות

  1. Dzobo, K., et al. Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine. Stem Cells International. 2018, 2495848(2018).
  2. Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. Myocardial tissue engineering for cardiac repair. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).
  3. Sekiya, S., Shimizu, T. Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue. Inflammation and Regeneration. 37, 25(2017).
  4. Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation. Einstein. 16 (3), Sao Paulo. 4538(2018).
  5. Pena, B., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering. Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079(2018).
  6. Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).
  7. Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts. Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).
  8. Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature. Advanced Functional Materials. (1910811), 23(2020).
  9. O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95(2019).
  10. Gentile, C. Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology. Current Stem Cell Research & Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).
  11. Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
  12. Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation. Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).
  13. Sweeney, M., Foldes, G. It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154(2018).
  14. Polonchuk, L., et al. Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment. Scientific Reports. 7 (1), 7005(2017).
  15. Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy. Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).
  16. Langhans, S. A. Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  17. Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. 3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).
  18. Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147(2018).
  19. Grounds, M. D. Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).
  20. Campbell, M., et al. Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Reis, R. L. , Academic Press. Oxford. 387-393 (2019).
  21. Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis. Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).
  22. Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).
  23. Pagliari, S., et al. A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds. Frontiers in Physiology. 5, 210(2014).
  24. Gentile, C., et al. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids. Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).
  25. Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).
  26. Fleming, P. A., et al. Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels. Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).
  27. Traore, M. A., George, S. C. Tissue Engineering the Vascular Tree. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
  28. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  29. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).
  30. Kalyanaraman, B. Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree. Redox Biology. 29, 101394(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Co culture
ספרואידים לב כמו במבחנה ביו מהונדסת רקמות לב לחקור פתופיזיולוגיה לב אנושי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.