הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61987

⸱

4 בפברואר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

במאמר זה

סיכום

פיתחנו פרוטוקול לטרנספקציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים על ידי אלקטרופורציה עם הגן המקודד גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). העברה מוצלחת הודגמה על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA).

תקציר

החברה המזדקנת יותר ויותר שלנו מובילה לשכיחות גוברת של מחלות נוירודגנרטיביות. עד כה, המנגנונים הפתולוגיים אינם מובנים כראוי, ובכך מעכבים את כינונתם של טיפולים מוגדרים. טיפולים גנטיים מוספים מבוססי תאים לביטוי מוגבר של גורם מגן נחשבים כאופציה מבטיחה לטיפול תרופתי במחלות נוירודגנרטיביות, כגון ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). פיתחנו שיטה לביטוי יציב של הגורם הנגזר מאפיתל פיגמנטי (PEDF), המאופיין כחלבון נוירו-פרוטקטיבי ואנטי-אנגיוגני במערכת העצבים, לתוך הגנום של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים (PE) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). תאי PE ראשוניים בודדו מעיני תורמים אנושיים ונשמרו בתרבית. לאחר שהגיעו למפגש, 1 x 104 תאים הושעו ב-11 μL של מאגר resuspension ובשילוב עם 2 μL של תמיסה מטוהרת המכילה 30 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזן היפראקטיבי (SB100X) ו-470 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזון PEDF. השינוי הגנטי בוצע עם מערכת אלקטרופורציה נימית באמצעות הפרמטרים הבאים: שתי פולסים עם מתח של 1,100 V ורוחב של 20 ms. תאים שעברו טרנספקציה הועברו לצלחות תרבית המכילות תוסף בינוני עם סרום בקר עוברי; אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטיקה נוספו עם חילופי המדיום הראשונים. העברה מוצלחת הודגמה בניסויים שבוצעו באופן עצמאי. תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) הראתה את הביטוי המוגבר של טרנסגן PEDF. הפרשת ה-PEDF הייתה גבוהה באופן משמעותי ונותרה יציבה, כפי שהוערך על ידי אימונובלוטציה, וכומתה על ידי בדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA). העברה בתיווך SB100X אפשרה אינטגרציה יציבה של גן PEDF בגנום של תאי PE והבטיחה הפרשה מתמשכת של PEDF, שהיא קריטית לפיתוח טיפול תוספת גנים מבוסס תאים לטיפול ב- AMD או במחלות ניווניות אחרות ברשתית. יתר על כן, ניתוח פרופיל האינטגרציה של טרנספוזון PEDF לתאי PE אנושיים הצביע על התפלגות גנומית כמעט אקראית.

מבוא

גיל מתקדם מתואר כסיכון העיקרי למחלות נוירודגנרטיביות. ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), מחלה פוליגנית המובילה לאובדן ראייה חמור בחולים מעל גיל 60, שייך לארבעת הגורמים השכיחים ביותר לעיוורון ולפגיעה בראייה1 וצפוי לעלות ל -288 מיליון איש בשנת 20402. תפקוד לקוי של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), שכבה אחת של תאים ארוזים היטב הממוקם בין choriocapillaris לבין photoreceptors הרשתית, לתרום פתוגנזה של AMD. ה- RPE ממלא משימות מרובות החיוניות לתפקוד רשתית תקין3 ומפריש מגוון גורמי גדילה וגורמים חיוניים לשמירה על השלמות המבנית של הרשתית והכוריוקפילריס, ובכך תומך בהישרדות הפוטורצפטור ומספק בסיס למחזור הדם ולאספקת חומרים מזינים.

בעיניים בריאות, גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) אחראי לאיזון ההשפעות של גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) ומגן על תאי עצב מפני אפופטוזיס, מונע שגשוג תאי אנדותל ומייצב את האנדותל הנימי. יחס VEGF-to-PEDF קשור לניאו-וסקולריזציה של העין, אשר נצפתה במודלים של בעלי חיים 4,5 וכן בדגימות של חולים עם ניאו-וסקולריזציה כורואידלית (CNV) עקב AMD ורטינופתיה סוכרתית שגשוג 6,7,8,9,10 . ריכוז ה-VEGF המשופר הוא היעד לטיפול הסטנדרטי הנוכחי. התרופות נגד VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept ולאחרונה, brolucizumab לשפר את חדות הראייה בכשליש מחולי CNV או ליתר דיוק לייצב את הראייה ב 90% מהמקרים11,12,13. עם זאת, הזריקות התוך-גופיות התכופות, לעתים קרובות חודשיות, נושאות בסיכון לתופעות לוואי14, פוגעות בציות המטופלים ומהוות נטל כלכלי משמעותי על מערכות הבריאות15. יתר על כן, אחוז מסוים מהחולים (2%-20%) אינם מגיבים או רק מגיבים בצורה גרועה לטיפול נגד VEGF16,17,18,19. מקבילות שליליות אלה מחייבות פיתוח של טיפולים אלטרנטיביים, כגון שתלים תוך עיניים, גישות טיפוליות בתאים ו/או בגנים.

הריפוי הגנטי התפתח כטיפול מבטיח במחלות תורשתיות ולא תורשתיות ומתכוון לשחזר רצפי גנים לא מתפקדים או לדכא תקלות. עבור מחלות פוליגניות, שבהן זיהוי והחלפה של הגורמים הסיבתיים כמעט ואינו אפשרי, אסטרטגיות שואפות לאספקה רציפה של גורם מגן. במקרה של AMD, פותחו טיפולים מוספים שונים, כגון הביטוי היציב של אנדוסטטין ואנגיוסטטין 20, אנטגוניסט VEGF מסיס דמוי טירוזין קינאז-1 (sFLT-1)21,22, אשכול החלבון הרגולטורי המשלים של התמיינות 59 (CD59)23 או PEDF 24,25 . העין, ובמיוחד הרשתית, היא מטרה מצוינת לתרופה מבוססת גנים בשל המבנה הסגור, הנגישות הטובה, הגודל הקטן והפריבילגיה החיסונית, ובכך מאפשרת אספקה מקומית של מינונים טיפוליים נמוכים והופכת את ההשתלות לפחות רגישות לדחייה. יתר על כן, העין מאפשרת ניטור לא פולשני, וניתן לבחון את הרשתית בטכניקות הדמיה שונות.

וקטורים נגיפיים הם, בגלל יעילות ההתמרה הגבוהה שלהם, הכלי העיקרי להעברת גנים טיפוליים לתאי מטרה. עם זאת, בהתאם לווקטור הנגיפי המשמש, תוארו תגובות שליליות שונות, כגון תגובות חיסוניות ודלקתיות26, השפעות מוטגניות ואונקוגניות27,28, או הפצה ברקמות אחרות 29. המגבלות המעשיות כוללות גודל אריזה מוגבל30 וכן קשיים ועלויות הכרוכים בייצור מגרשים ברמה קלינית31,32. חסרונות אלה קידמו את המשך הפיתוח של וקטורים לא ויראליים, מבוססי פלסמיד, המועברים באמצעות ליפו-/פוליפלקסים, אולטרסאונד או אלקטרופורציה. עם זאת, אינטגרציה גנומית של הטרנסגן לתוך הגנום המארח בדרך כלל אינה מקודמת עם וקטורים פלסמידים, וכתוצאה מכך ביטוי חולף.

טרנספוזונים הם מקטעי דנ"א טבעיים המשנים את מיקומם בתוך הגנום, מאפיין שאומץ לריפוי גנטי. בשל מנגנון אינטגרציה פעיל, מערכות וקטוריות מבוססות טרנספוזון מאפשרות ביטוי רציף וקבוע של הטרנסגן המוכנס. הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB), ששוחזר מטרנספוזון עתיק מסוג Tc1/mariner שנמצא בדגים33 ושופר עוד יותר על ידי אבולוציה מולקולרית וכתוצאה מכך הגרסה ההיפראקטיבית SB100X34, אפשרה טרנספוזיציה יעילה בתאים ראשוניים שונים ושימשה לתיקון פנוטיפי במודלים שונים של מחלות35. נכון לעכשיו, 13 ניסויים קליניים החלו באמצעות מערכת טרנספוזון SB . מערכת הטרנספוזון SB100X מורכבת משני מרכיבים: הטרנספוזון, המרכיב את הגן המעניין המוקף בחזרות הפוכות סופניות (TIRs), והטרנספוזה, המגייסת את הטרנספוזון. לאחר העברת דנ"א פלסמיד לתאים, הטרנספוזאז קושר את ה-TIRs ומזרז את הכריתה והאינטגרציה של הטרנספוזון בגנום של התא.

פיתחנו תוסף שאינו מבוסס על תאים נגיפיים לטיפול ב- AMD ניאו-וסקולרי. הגישה כוללת החדרה מבוססת אלקטרופורציה של הגן PEDF לתאי אפיתל פיגמנטים ראשוניים (PE) באמצעות מערכת הטרנספוזון SB100X 36,37,38. המידע הגנטי של הטרנספוזאז וה-PEDF מסופק על פלסמידים נפרדים, ובכך מאפשר התאמה של יחס הטרנספוזון האידיאלי SB100X-to-PEDF. האלקטרופורציה מתבצעת באמצעות מערכת טרנספקציה נימית מבוססת פיפטה המאופיינת בגודל מרווח מקסימלי בין האלקטרודות תוך מזעור שטח הפנים שלהן. הודגם כי המכשיר משיג שיעורי העברה מצוינים במגוון רחב של תאי יונקים 39,40,41. שטח הפנים של האלקטרודה הקטנה מספק שדה חשמלי אחיד ומפחית את תופעות הלוואי השונות של אלקטרוליזה42.

הפונקציונליות האנטי-אנגיוגנית של PEDF המופרשת על ידי תאי אפיתל פיגמנטיים שעברו טרנספקציה הודגמה בניסויים שונים במבחנה שניתחו את ההנבטה, הנדידה והאפופטוזיס של תאי אנדותל וורידי הטבור האנושיים43. בנוסף, השתלת תאים שעברו טרנספקציה של PEDF במודל ארנב של ניאו-וסקולריזציה של הקרנית44 וכן מודל חולדות שלCNV 43,45,46 הראו ירידה של ניאו-וסקולריזציה.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להחדרה יציבה של הגן PEDF לתאי RPE אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת טרנספוזון SB100X באמצעות מערכת טרנספקציה נימרית. התאים שעברו טרנספקציה נשמרו בתרבית במשך 21 יום ולאחר מכן נותחו במונחים של ביטוי גנים של PEDF על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ובמונחים של הפרשת חלבון PEDF על ידי אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA, איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עיני התורם האנושי התקבלו מבנק אאכן קורניאה של המחלקה לרפואת עיניים (בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) לאחר קבלת הסכמה מדעת בהתאם לפרוטוקולי הצהרת הלסינקי. נהלים לאיסוף דגימות אנושיות ולשימוש בהן אושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית.

1. בידוד של תאי RPE אנושיים ראשוניים

  1. פרשו בגדי מגן סטריליים וכפפות. מניחים וילון סטרילי מתחת לזרימה למינרית.
  2. מניחים מכשירי הכנה סטריליים וציוד סטרילי נחוץ אחר מתחת לזרימה הלמינרית.
  3. להקליט את קבלת גלובוסים העין, את תחילת ההכנה, כמו גם חריגות אפשריות. רשום את גיל התורם, מינו, סיבת המוות והתקופה שבין זמן המוות להסרת העיניים.
  4. מניחים את כדור העין בדחיסת גזה סטרילית ומחזיקים אותו ביד אחת.
  5. הפרידו את המקטע הקדמי מהמקטע האחורי על ידי חתך היקפי של כ-3.5 מ"מ אחורי ללימבוס באמצעות אזמל ומספריים מחודדים עדינים במיוחד.
  6. לאחר הטיית החלק האחורי כלפי מטה, הסר בזהירות את הזגוגית ואת הרשתית באמצעות מלקחיים קוליברי.
  7. סדרו מחדש בדיסקרטיות את קומפלקס ה-RPE/choroidea המכווץ באמצעות מלקחיים ישרים של הקשתית ולאחר מכן החזיקו אותו במקומו עם מלקחיים מעוקלים.
  8. מלאו את העיניים האחורית ב-1 מ"ל של תערובת החומרים המזינים F-12 של Dulbecco (DMEM/F12) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 80 פניצילין U/mL ו-80 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (עט/סטרפ), ו-2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B (אמפוב).
    הערה: בניגוד לבידוד של תאי RPE ראשוניים מעיני חזיר או בקר36,37, אין צורך למלא את כוס העין האחורית ולדגירה עם טריפסין.
  9. קצירת תאי ה-RPE על ידי הברשה עדינה של אפיתל פיגמנט הרשתית מעצב הראייה לכיוון הלימבוס באמצעות פיפטת פסטר זכוכית מעוגלת מלוטשת באש, תוך קיבוע קומפלקס RPE/choroidea בלימבוס באמצעות מלקחיים קוליבריים. מעבירים את מתלה התא לצלחת פטרי.
  10. חזור על השלבים 1.8 ו- 1.9 ואסוף את כל התאים בצלחת פטרי. השהה את מתלה התא בזהירות על ידי צנרת למעלה ולמטה באמצעות פיפטה ערוץ יחיד (100-1,000 μL).
  11. זרעו את תרחיף תאי ה-RPE של כל גלובוס עיניים לשלוש בארות של צלחת תרבית תאים בת 24 בארות ומלאו אותן עד 1 מ"ל ב-DMEM/F12 בתוספת FBS, עט/סטרפ ואמפוב.
  12. שמור על תרביות תאי RPE בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 95% אוויר ו-5% CO2 עד להגעה למפגש. שנה את מדיום תרבית התאים פעמיים בשבוע.

2. אלקטרופורציה של תאי RPE אנושיים ראשוניים

  1. הכנת תערובת פלסמיד טרנספוזון/PEDF SB100X טרנספוזון
    1. לטהר את ה- SB100X transposase ו- PEDF טרנספוזון פלסמיד DNA באמצעות ערכות טיהור פלסמיד מקובלות, אשר מזוהים כמתאימים לשימוש ביישומים כגון טרנספקציה, על פי פרוטוקול היצרן.
    2. לכמת את תכולת הדנ"א הפלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח ולהתאים אותם לריכוז של 250 ננוגרם/מיקרון עם 10 mM Tris-HCl (pH 8.5).
    3. יש לערבב חלק אחד של 250 ננוגרם/μL SB100X טרנספוזאז פלסמיד DNA (לדוגמה, 2.5 μL) עם 16 חלקים של 250 ng/μL PEDF טרנספוזון פלסמיד DNA (למשל, 40 μL). תערובת פלסמיד שיורית ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש להימנע ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים ונשנים של תערובת הפלסמיד.
    4. מקם 2 μL של תערובת פלסמיד טרנספוזאז/PEDF טרנספוזון/PEDF, המכילה 29.4 ננוגרם של פלסמיד טרנספוז SB100X ו-470.6 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזון PEDF, בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל עם נעילה בטוחה. יש לשמור על הקרח עד לערבוב עם התאים.
  2. הקמת מערכת הטרנספקציה הנימית
    הערה: אלקטרופורציה של תאי RPE אנושיים ראשוניים בוצעה באמצעות מערכת טרנספקציה נימית באמצעות ערכת 10 μL על פי פרוטוקול היצרן. המערכת כוללת את מכשיר הטרנספקציה, את פיפטה הטרנספקציה ואת תחנת הפיפטה. הערכה מכילה 10 קצוות טרנספקציה של μL, צינורות חיץ, חיץ אלקטרוליטי E (חיץ E) וחיץ מחדש R (חיץ R).
    1. חבר את תחנת הפיפטה להתקן הטרנספקציה.
    2. מלא צינור חיץ עם 3 מ"ל של חיץ E והכנס אותו לתחנת פיפטה עד צליל קליק נשמע.
      הערה: ודא שהאלקטרודה הצדדית של צינור החיץ מחוברת לבוכנה הכדורית הצדדית של תחנת הפיפטה.
    3. עבור אלקטרופורציה של תאי RPE אנושיים ראשוניים, הגדר את תנאי הפולס הבאים בהתקן הטרנספקציה: 1,100 V (מתח פולס), 20 מילישניות (רוחב פולס), שתי פולסים (מספר פולס).
  3. הכנת תאי ה-RPE האנושיים הראשוניים המעובדים
    1. תעד צורה ומורפולוגיה של תרביות תאי RPE ראשוניות באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה. קח מיקרוגרפים בהגדלה נמוכה כדי להדגים את הצמיחה של תאי RPE למונו-שכבה משולבת ומשולבת, כמו גם מיקרוגרפים בהגדלה גבוהה יותר כדי להצביע על המורפולוגיה המרוצפת האופיינית של תאי ה- RPE.
    2. שאפו את מדיום תרבית התאים ושטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל מלח פוספט (PBS, pH 7.4).
    3. טריפסיני תאי RPE אנושיים ראשוניים עם 0.5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 95% אוויר ו 5% CO2 במשך 7-15 דקות (מקסימום). בדוק את ניתוק התא באופן מיקרוסקופי.
    4. הפסק טריפסיניזציה עם 1 מ"ל של DMEM/F12 בתוספת FBS. קח 20 μL aliquot לספירת תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה מתלה תא RPE ב 106 x גרם במשך 10 דקות.
    5. מערבבים את האליקוט של 20 μL עם תמיסה כחולה של 20 μL. פיפטה 10 μL בכל מחצית של ההמוציטומטר ולספור את התאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
    6. לאחר צנטריפוגה, יש להשעות את גלולת תא ה-RPE ב-1 מ"ל של PBS.
    7. קח 10,000-100,000 תאי RPE לכל תגובת טרנספקציה וצנטריפוגה אותם ב 106 x גרם במשך 10 דקות.
      הערה: לצד תגובות הטרנספקציה עם יישום שדה חשמלי והוספת דנ"א פלסמיד, כל גישה כוללת גם שתי תרבויות בקרה שונות: (1) ללא יישום שדה חשמלי וללא דנ"א פלסמיד; (2) עם יישום שדה חשמלי, אך ללא דנ"א פלסמיד.
    8. יש לתלות את גלולת התא ב-11 μL של מאגר R ולשלב אותה עם 2 μL של תערובת פלסמיד טרנספוזה/PEDF של SB100X טרנספוזון (ראה שלב 2.1.4).
      הערה: לאחר חידוש במאגר R, יש לעבד את התאים תוך 15 דקות כדי למנוע ירידה בכדאיות התא וביעילות ההעברה.
    9. הכנס את ראש פיפטה transfection לתוך קצה transfection 10 μL transfection עד מהדק לחלוטין להרים את גזע הרכבה של הבוכנה. משכו את תמיסת התא/פלסמיד לתוך קצה הטרנספקציה.
      הערה: הימנעו מיצירת בועות אוויר ושאיפתן לקצה הטרנספקציה.
    10. ספק 1 מ"ל של DMEM/F12 בתוספת FBS, אך ללא עט/סטרפ וללא AmphoB, למספר הבארות הנדרש של צלחת תרבית תאים של 24 בארות.
  4. תהליך אלקטרופורציה
    1. הכנס את פיפטה הטרנספקציה לתוך צינור החיץ הממוקם בתחנת הפיפטה (ראה שלב 2.2.2) עד שיישמע צליל לחיצה.
      הערה: ודא שראש המתכת של פיפטה הטרנספקציה מחובר לבוכנה הכדורית בתוך תחנת הפיפטה ולצינור החיץ.
    2. לחץ על התחל במסך המגע של התקן הטרנספקציה. לפני היישום של הדופק החשמלי, המכשיר בודק באופן אוטומטי אם צינור החיץ ואת פיפטה transfection מוכנסים כראוי. לאחר מסירת הפולסים החשמליים, Complete מוצג על מסך המגע.
    3. הסר בזהירות את פיפטה הטרנספקציה מתחנת הפיפטה ושחרר מיד את התאים האלקטרופוארטיים מקצה הטרנספקציה של 10 μL על ידי הזרמת תמיסת התא/פלסמיד לתוך הבארות המוכנות של צלחת תרבית התאים (ראה שלב 2.3.10).
    4. שמור על תרביות תאי RPE שעברו טרנספקציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 95% אוויר ו-5% CO2. הוסף עט/סטרפ ואמפוב עם ההחלפה הבינונית הראשונה 3 ימים לאחר האלקטרופורציה.

3. ניתוחים של תאי RPE אנושיים ראשוניים שעברו טרנספקציה

  1. הכנת דוגמאות
    1. לאחר זמן גידול של 3 שבועות, בסופו של דבר דגירה של תרביות תאי RPE בנפח מוגדר של 1.0 מ"ל DMEM/F12 בתוספת FBS, עט/סטרפ ואמפוב לזמן מוגדר של 24 שעות.
    2. קח את תרבית התאים supernatants ולאחסן אותם ב -20 °C עד עיבוד נוסף כמעט בזמן או ב -80 °C עבור דגימות לא יציבות תרמית ואחסון לטווח ארוך.
    3. טריפסיניזציה של תרביות תאי RPE שעברו טרנספקציה עם 0.5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 95% אוויר ו-5% CO2 למשך 10 דקות.
    4. הפסק טריפסיניזציה עם 1 מ"ל של DMEM/F12 בתוספת FBS. קח aliquots קטנים לספירת תאים באמצעות hemocytometer (ראה שלב 2.3.5). צנטריפוגה מתלי תא RPE ב 106 x גרם במשך 10 דקות.
    5. אחסן את כדורי תא RPE בטמפרטורה של -80°C עד לעיבוד נוסף.
  2. הערכת הפרשת PEDF על ידי כתם מערבי
    הערה: לצורך הערכה איכותית, סופרנאטנטים של תרביות תאים (ראה שלב 3.1.2) מנותחים באמצעות אלקטרופורזה של נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל (SDS-PAGE) והכתמה מערבית לאחר מכן. בהתאם ל PEDF טרנספוזון פלסמיד DNA בשימוש, supernatants צריך להיות מעובד אחרת.
    1. טיהור חלבוני היתוך PEDF המתויגים שלו מתרבי-על של תרביות תאים
      1. יש ליטול 30 μL של חומצה ניקל-ניטרילוטריאצטית (Ni-NTA) לכל דגימה באמצעות קצה משופע לחתוך וכדור את שרף Ni-NTA על ידי צנטריפוגה (2,660 x גרם במשך 30 שניות).
      2. יש להשעות בזהירות את שרף Ni-NTA עם 200 μL של מאגר דגירה 1x (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) וכדור אותו על ידי צנטריפוגה (2,660 x g עבור 30 שניות).
      3. חזור על השלב הקודם.
      4. יש לחדש בזהירות את שרף Ni-NTA עם מאגר דגירה 40 μL 4x (200 mM NaH 2 PO4,1.2M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) לכל דגימה.
      5. יש לערבב 900 μL של תרבית-על של תרבית תאים עם 260 μL של מאגר דגירה 4x ו-55 μL של תרביית Ni-NTA שטופלה מראש (ראה שלב 3.2.1.4).
      6. דגרו את התערובת על שייקר מתנדנד בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
      7. גלולה שרף Ni-NTA על ידי צנטריפוגה (2660 x גרם עבור 60 שניות).
      8. יש להשעות בזהירות את שרף Ni-NTA עם 175 μL של מאגר דגירה 1x ושרף גלולות על ידי צנטריפוגה (2,660 x g עבור 60 שניות).
      9. חזור על השלב הקודם.
      10. יש להשעות בזהירות את שרף Ni-NTA עם 30 μL של חיץ אלוטיון (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) ולדגור את התערובת על שייקר נדנדה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
      11. גלולה שרף Ni-NTA על ידי צנטריפוגה (2,660 x גרם עבור 30 שניות).
      12. קח בזהירות את הסופרנטנט וערבב אותו עם 2x מאגר דגימות SDS47.
      13. מחממים את התערובת בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות ומפרידים את החלבונים המטוהרים של Ni-NTA על ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד בטמפרטורה של 10%.
      14. בצע הכתמה מערבית באמצעות נוגדנים נגד פנטה-הו (מונוקלונל עכבר, 1:500) ונוגדנים מצומדים נגד עכברים (נוגדנים נגד עכבר ארנב, 1:1,000) כפי שתואר קודם לכן36,37.
    2. אנליזה ישירה של חלבוני PEDF שאינם מתויגים
      1. קח 15 μL של תרבית תאים supernatant ולערבב אותו עם 2x SDS דגימה מאגר47.
      2. מחממים את התערובת ל-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומפרידים את החלבונים על ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד 10%.
      3. בצע הכתמה מערבית באמצעות נוגדני PEDF אנטי-אנושיים (רב-שבטיים של ארנב, 1:4,000) ונוגדנים מצומדים נגד ארנבים של HRP (רב-שבטי עזים, 1:2,000) כפי שתואר קודם לכן38.
    3. כימות הפרשת PEDF על ידי ELISA
      1. ניתוח תרביות-על של תרביות תאים (ראה שלב 3.1.2) באמצעות ערכת PEDF ELISA אנושית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      2. יש לקשר את כמות ה-PEDF המופרשת לזמן ולמספר התא שנקבע עבור כל תגובת טרנספקציה (ראו שלב 3.1.4).
    4. ניתוח ביטוי גנים של PEDF בתאי RPE שעברו טרנספקציה
      1. יש לבודד את סך הרנ"א מכדורי תאי ה-RPE (ראה שלב 3.1.5) באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      2. כימות תכולת RNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
      3. לבצע שעתוק הפוך על 0.1 מיקרוגרם RNA באמצעות מערכת שעתוק הפוך על פי פרוטוקול היצרן.
      4. בצע qPCR בזמן אמת כפי שתואר קודם לכן38.
    5. ניתוח של אתרי החדרת טרנסגנים בתאי RPE שעברו טרנספקציה
      1. לבודד דנ"א גנומי מכדורי תאי RPE (ראה שלב 3.1.5) באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      2. כימות תכולת הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
      3. צור ספריות אתר הכנסה באמצעות ערכת PCR ספציפית ל- hemi בסיוע חישוב כפי שתואר קודםלכן 38.
      4. בצע ניתוח חישובי כפי שתואר קודםלכן 38.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טיפוח ואלקטרופורציה של תאי RPE אנושיים ראשוניים
הראינו כי זריעה של מספר מספיק של תאי RPE ראשוניים ממוצא מן החי מאפשרת טיפוח וצמיחה לחד-שכבתי משולב של תאים בעלי פיגמנטציה בצורת משושה36,37,48. יכולתם ליצור צמתים הדוקים, להפגין פעילות פאגוציטית ולבטא גנים ספציפיים של סמנים במבחנה48 משקפת משימות משמעותיות של אפיתל פיגמנט הרשתית in vivo. תאי RPE ראשוניים מעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרויקט שלנו, אנו שואפים לייצור לא ויראלי של תאי RPE אנושיים ראשוניים מהונדסים גנטית, אשר מבטאים יתר על המידה ומפרישים ללא הרף גורם יעיל על מנת להשתמש בתאים המועתקים כטיפול ארוך טווח להקמה ותחזוקה של סביבה מגוננת. ביססנו את ההקדמה של הגן המקודד PEDF, חלבון רב-תפקודי המתבטא בכל מקום עם פונקציות אנטי-אנגיוגניות ונוירו-פרוטקטיביות. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כאן כדי להעביר ביציבות ובשכפול תאי RPE אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון SB100X . העברת דנ"א והכנסתו לתאי ה-RPE מתבצעת באמצעות מערכת העברה נימית מבוס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

זולטן איביץ' וז'וז'נה איזבאק הם ממציאים על מספר פטנטים על טכנולוגיית טרנספוזון SB

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי והדגמה, הסכם מענקים מס' 305134. Zsuzsanna Izsvák מומן על ידי מועצת המחקר האירופית, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). המחברים רוצים להודות לאנה דוביאס ואנטג'ה שייפר (המחלקה לרפואת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) על התמיכה הטכנית המצוינת, ולבנק הקרנית של אאכן (המחלקה לרפואת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) על מתן עיני התורם האנושי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בידוד של תאי RPE אנושיים ראשוניים
24-Well Cell Culture PlateEppendorf, המבורג, גרמניה0030722019
Amphotericin B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, דרמשטאדט, גרמניהA2942
Colibri ForcepsGeuder , היידלברג, גרמניהG-18950
מלקחיים מעוקלים של איריס Geuder, היידלברג, גרמניהG-18856
אזמל חד פעמי (מס' 11)נוצה, אוסקה, יפן
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני/חזיר' s F-12 תערובת נוטריאנטים (DMEM/F12)PAN-Biotech, איידנבך, גרמניהP04-41150
מספריים עיניים מחודדים עדינים במיוחד Geuder, היידלברג, גרמניהG-19405
סרום בקר עוברי [0.2 µ m מסנן סטרילי] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, גרמניהP40-37500
מותג פיפטות פסטר מזכוכיתורטהיים, גרמניה747715
פניצילין [10,000 יחידות/מ"ל] וסטרפטומיצין [10 מ"ג/מ"ל] (עט/סטרפטוקוק)Merck, דרמשטדט, גרמניהP0781
קצות פיפטות (1000 ומיקרו; L)Starlab, המבורג, גרמניה
פיפטה חד-ערוצית (100-1000 ומיקרו; L)Eppendorf, המבורג, גרמניה
וילון סטריליLohmann & Rauscher, Rengsdorf, גרמניה
קומפרס גזה סטרילי פינק-וולטר, מרצ'וויילר, גרמניה321063
כפפות סטריליותSempermed, וינה, אוסטריה
צלחת פטרי סטרילית (פלקון 60 מ"מ x 15 מ"מ)קורנינג, קורנינג, ניו יורק351007
שמלת כירורגית סטריליתHalyard Health, Alpharetta, GA
מלקחיים ישרים של איריס Geuder, היידלברג, גרמניהG-18855
אלקטרופורציה של תאי RPE אנושיים ראשוניים
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell CulturePlate Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
24-WellCell Culture Plate Eppendorf, המבורג, גרמניה
אמפוטריצין B [250 ומיקרו; g/mL] (AmphoB)Merck, דרמשטאדט, גרמניהA2942
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני/חזיר' s F-12 תערובת נוטריאנטים (DMEM/F12)PAN-Biotech, איידנבאך, גרמניהP04-41150
צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה (1.5 מ"ל)אפנדורף, המבורג, גרמניה
סרום בקר עוברי [0.2 µ m מסנן סטרילי] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, גרמניהP40-37500
מיקרוסקופ הפוךLeica Mikrosysteme, Wetzlar, גרמניהLeica DMi8
ספקטרופוטומטר מיקרונפח (ספקטרופוטומטר NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
מערכת העברה נימית (מערכת טרנספקציה ניאון)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
MPK5000 מערכת טרנספקציה ניאון 10 ומיקרו; L KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)פול מרינפלד, Lauda-Kö nigshofen, גרמניה0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+Biochrom, ברלין, גרמניהL182-50
פניצילין [10,000 יחידות/מ"ל] וסטרפטומיצין [10 מ"ג/מ"ל] (עט/סטרפטוק)Merck, דרמשטדט, גרמניהP0781
קצות פיפטה (10 ומיקרו; L)Starlab, המבורג, גרמניה
טיפים לפיפטה (1000 ומיקרו; L)Starlab, המבורג, גרמניה
טיפים לפיפטה (200 ומיקרו; L)Starlab, המבורג, גרמניה
פלסמיד מקסי קיטQiagen, הילדן, גרמניה12163
פיפטה חד ערוצית (0.1-10 ומיקרו; L)Eppendorf, המבורג, גרמניה
פיפטה חד ערוצית (100-1000 ומיקרו; L)Eppendorf, המבורג, גרמניה
פיפטה חד ערוצית (10-200 ומיקרו; L)Eppendorf, המבורג, גרמניה
Trypan Blue SolutionMerck, דרמשטדט, גרמניהT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
אנליזות של תאי RPE אנושיים ראשוניים שעברו טרנספקטציה
10% SDS-Polyacrylamide ג'ל
1x מאגר דגירה (50 מ"מ NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS מאגר
דגימה 4x מאגר דגירה (200 מ"מ NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 מ"מ אימידזול, pH 8.0)
אמרשם פרוטראן נתמך 0.2 ומיקרו; מ  ניטרוצלולוז ממברנהCytiva, מרלבורו, MA10600015
אמפוטריצין B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, דרמשטדט, גרמניהA2942
נוגדנים נגד PEDF (ארנב פוליקלונלי)BioProducts, Middletown, MDAB-PEDF1
נוגדנים נגד Penta-His (עכבר מונוקלונלי)Qiagen, הילדן, גרמניה34660
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני/חזיר' s F-12 תערובת נוטריינטים (DMEM/F12)PAN-Biotech, איידנבאך, גרמניהP04-41150
מאגר אלוטיון (50 מ"מ NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) 
סרום בקר עוברי [0.2 µ m מסנן סטרילי] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, גרמניהP40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, גרמניה0640110
נוגדנים נגד עכברים מצומדים פרוקסידאז (ארנב פוליקלונלי)Agilent Dako, סנטה קלרה, קליפורניהP0260
חזרת פרוקסידאז נוגדנים מצומדים נגד ארנב (עז פוליקלונל)Abcam, קיימברידג', בריטניהab6721
ערכת PEDF ELISA אנושית BioProducts, Middletown, MDPED613
LAS-3000 מערכת הדמיהפוג'יפילם, מינאטו, יפן
LightCycler 1.2 InstrumentRoche Life Science, פנצברג, גרמניה
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green IRoche Life Science, פנצברג, גרמניה12239264001
LightCycler  נימים (20 μ l)Roche Life Science, פנצברג, גרמניה4929292001
ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח (ספקטרופוטומטר NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN  מודול יציקת תאים טטרהמעבדות ביו-ראד, פלדקירכן, גרמניה1658015
Mini-PROTEAN  תא אלקטרופורזה אנכי של טטרה לג'לים טרומיים מיני,מעבדות ביו-ראד 4 ג'ל, פלדקירכן, גרמניה1658004
Ni-NTA SuperflowQiagen, הילדן, גרמניה30410
PageRuler סולם חלבון צבוע מראשThermo Fisher Scientific, Waltham, MA26616
פניצילין [10,000 יחידות/מ"ל] וסטרפטומיצין [10 מ"ג/מ"ל] (עט/סטרפטוקוקוק)Merck, דרמשטדט, גרמניהP0781
קצות פיפטה (10 ומיקרו; L)Starlab, המבורג, גרמניה
טיפים לפיפטה (1000 ומיקרו; L)Starlab, המבורג, גרמניה
טיפים לפיפטה (200 ומיקרו; L)Starlab, המבורג, גרמניה
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad Laboratories, פלדקירכן, גרמניה1645050
QIAamp DNA Mini KitQiagen, הילדן, גרמניה51304
מערכת שעתוק הפוך Promega, Madison, WIA3500
RNase DNase SetQiagen, הילדן, גרמניה79254
RNeasy Mini Kit Qiagen, הילדן, גרמניה74104
Rocking ShakerCole-Parmer, סטפורדשייר, בריטניהSSM3
צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה (1.5 מ"ל)Eppendorf, המבורג, גרמניה
צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה (2.0 מ"ל)Eppendorf, המבורג, גרמניה
פיפטה חד ערוצית (0.1-10 ומיקרו; L)Eppendorf, המבורג, גרמניה
פיפטה חד ערוצית (100-1000 ומיקרו; L)Eppendorf, המבורג, גרמניה
פיפטה חד ערוצית (10-200 ומיקרו; L)Eppendorf, המבורג, גרמניה
Trans-Blot TurboTransfer System Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, גרמניה1704150
Trypan Blue SolutionMerck, דרמשטדט, גרמניהT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
, 0030722019

מקורות

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850(2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049(2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845(2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביטוי הגן PEDFאלקטרופורציה נימיתהכנת DNA פלסמיאנליזת Western Blotכימות באמצעות ELISAטיהור בניקל NTAשילוב יציב של טרנסגן
שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.