זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים

סיכום

רקמות מהונדסות מסתמכות במידה רבה על רשתות כלי דם נאותות כדי לספק חומרים מזינים וגזים חיוניים ולהסיר פסולת מטבולית. בעבודה זו, פרוטוקול זריעה צעד אחר צעד של תאי אנדותל ותאי תמיכה יוצר רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בפלטפורמת תפוקה גבוהה לחקר התנהגות כלי שיט מתפתחת בסביבה תלת-ממדית מבוקרת.

תקציר

מערכת הלב וכלי הדם היא שחקן מפתח בפיזיולוגיה האנושית, מתן הזנה לרוב הרקמות בגוף; כלי שיט נמצאים בגדלים שונים, מבנים, פנוטיפים וביצועים בהתאם לכל רקמה מפוזרת ספציפית. תחום הנדסת הרקמות, שמטרתו לתקן או להחליף רקמות גוף פגומות או חסרות, מסתמך על אנגיוגנזה מבוקרת כדי ליצור כלי דם נאות בתוך הרקמות המהונדסות. ללא מערכת כלי דם, מבנים מהונדסים עבים לא ניתן להזנה מספקת, אשר עלול לגרום למוות תאים, תחריט לקוי, ובסופו של דבר כישלון. לכן, הבנה ושליטה על ההתנהגות של כלי דם מהונדסים היא אתגר יוצא דופן בתחום. עבודה זו מציגה מערכת תפוקה גבוהה המאפשרת יצירת רשתות כלי שיט מאורגנות וחוזרות על עצמן לחקר התנהגות כלי שיט בסביבת פיגומים תלת-ממדית. פרוטוקול זריעה דו-שלבי זה מראה כי כלי שיט בתוך המערכת מגיבים לטופוגרפיית הפיגומים, ומציגים התנהגויות נבטים ייחודיות בהתאם לגיאומטריית התא שבה שוכנים כלי השיט. התוצאות המתקבלות והבנה ממערכת תפוקה גבוהה זו ניתן ליישם על מנת ליידע טוב יותר 3D ביו מודפס עיצובים מבנה פיגומים, שבו ייצור של גיאומטריות 3D שונות לא ניתן להעריך במהירות בעת שימוש בהדפסה 3D כבסיס לסביבות ביולוגיות תאיות. יתר על כן, ההבנה ממערכת תפוקה גבוהה זו עשויה להיות מנוצלת לשיפור סינון תרופות מהיר, ההתפתחות המהירה של מודלים של תרבויות משותפות, וחקירת גירויים מכניים על היווצרות כלי דם כדי להעמיק את הידע של מערכת כלי הדם.

מבוא

תחום הנדסת הרקמות מתקדם במהירות לקראת ייצור מבנים מהונדסים להחלפת איברים ורקמות חסרים או פגומים¹. עם זאת, מבנים מתפקדים במלואם טרם הושגו, בין השאר, שכן יצירת רשתות כלי דם תפעוליות להזנת רקמות נותרה אתגר יוצא מן הכלל. ללא כלי דם נאותים, רקמות מהונדסות מוגבלות להובלת דיפוזיה פסיבית של חמצן וחומרים מזינים, מה שמגביל את עובי הרקמה המקסימלית בת קיימא למגבלת הדיפוזיה, כ -200 מיקרומטר². עוביים כאלה אינם מתאימים לתיקון פגמים ברקמות גדולות או לייצור איברים מלא, מה שהופך את נוכחותה של רשת כלי דם תפקודית למאפיין חובה לרקמות פונקציונליות ומושתלות³.

מערכת כלי הדם מורכבת ממגוון רחב של כלי דם, בגדלים שונים, פנוטיפים וארגון, הקשורים קשר הדוק לרקמה המארחת. הבנת ההתנהגות, התגובה והחלטות ההגירה המתבצעות על ידי כלי השיט המתפתחים והנבטיים יכולה להורות על שילובם ברקמות מהונדסות⁴. נכון לעכשיו, הגישה הנפוצה ביותר ליצירת רשתות כלי דם במבחנה היא שילוב תאי אנדותל (ECs) עם תאי תמיכה (SCs, עם היכולת להבדיל לתאי ציור קיר), זרע בתוך מיקרו-סביבה תלת מימדית. סביבה זו מספקת רמזים כימיים ופיזיים כדי לאפשר לתאים לצרף, להתרבות ולהרכיב את עצמם לרשתות כלי^{שיט 2,5,6,7,8}. כאשר הם מתרבתים במשותף, SCs מפרישים חלבונים מטריצה חוץ-תאית (ECM) תוך מתן תמיכה מכנית למחשבים האלקטרוניים, היוצרים את המבנים הצינוריים. יתר על כן, אינטראקציה צולבת בין שני סוגי התאים לקדם tubulogenesis, כלי נבט והגירה, בנוסף התבגרות SCs ובידול לתוך α חלקה שריר actin-ביטוי (αSMA) תאים ציורי קיר⁴. פיתוח רשת כלי השיט נחקר בדרך כלל בסביבות תלת מימדיות שנוצרו באמצעות הידרוג'לים, פיגומים פולימריים נקבוביים, או שילוב שלהם. האפשרות השנייה מספקת באותה מידה סביבה ידידותית לתאים ואת התמיכה המכנית הנדרשת הן עבור התאים והן עבור ECM⁹.

כמות גדולה של עבודה בוצעה כדי לחקור את התפתחות כלי הדם, כולל שיתוף culturing התאים על הידרוג'לים¹⁰, הידרוג'לים-פיגומים שילובים^11,12, פלטפורמות 2D, והתקנים microfluidic¹³. עם זאת, הידרוג'לים יכולים להיות מעוותים בקלות על ידי הכוחות המופעלים על ידי התא¹⁴, בעוד מערכות דו-צדדיות ומיקרופלואידיות אינן מצליחות ליצור מחדש סביבה קרובה יותר לטבע כדי להשיג תגובה נוספת^15,16. הבנת האופן שבו כלי שיט יוצרים מגיבים לסביבתם יכולה לספק תובנה קריטית שעשויה לאפשר ייצור סביבות מהונדסות עם היכולת להדריך את פיתוח כלי השיט באופן צפוי. הבנת תופעות היווצרות כלי דם היא קריטית במיוחד כדי לשמור על קצב עם הופעתה המהירה של טכניקות ייצור בקנה מידה תת-מיקרון, כגון סטריאוליטוגרפיה, ליתוגרפיה הקרנה דיגיטלית, ייצור ממשק נוזלי מתמשך, 3D להמיס אלקטרו jetwriting, פתרון מבוסס 3D אלקטרו סילון כתיבה, וטכניקות bioprinting המתעוררים^{17,18,19,20,21}. יישור השליטה של טכניקות micromanufacturing אלה עם הבנה מעמיקה של ביולוגיה של כלי הדם הוא המפתח ליצירת כלי דם מהונדס מתאים עבור רקמת היעד.

כאן, אנו מציגים מערכת תלת מימדית כדי לחקור את התגובה של כלי להרכיב ונבטים חדשים לגיאומטריית הפיגומים שמסביב, תוך התבוננות במקור הנבטים שלהם ובנדידה^{הבאה 22}. על ידי שימוש בפיגומים תלת-ממדיים עם גיאומטריות תאים עם סלקציה, וטכניקת זריעה דו-שלבית, הצלחנו ליצור רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בצורה ברורה וקלה לניתוח. הגיאומטריות הממוקדות מספקות מערכת תפוקה גבוהה עם יחידות בודדות המכילות כלי שיט המגיבים לסביבתם המקומית. באמצעות מחשבים אלקטרוניים צבעוניים, עקבנו אחר מקורות היווצרות נבטים ודפוסי העברה עוקבים, בקורלציה לגיאומטריית התא ולמיקום SCs²².

למרות שהפרוטוקול המוצע הוכן לנתח את ההשפעות של רמזים גיאומטריים על התנהגות כלי הדם, ניתן להרחיב גישה זו וליישם אותה על מגוון יישומים חדשים. הפיגום המוצף והרשתות הניתנות להדפסה בקלות מאפשרים ניתוח פשוט של אינטראקציה בין ECs ו- SCs שונים, תוספת של תאי איברים ספציפיים והאינטראקציה שלהם עם רשתות כלי הדם, השפעת סמים על רשתות כלי דם ועוד. תוצאות המערכת המוצעות שלנו מאוד תכליתי של ייצור ועיבוד פשוטים.

פרוטוקול

1. ייצור פיגומים טסליים

הערה: פוטוליטוגרפיה היא טכניקה נפוצה הדורשת ציוד מיוחד השוכן בדרך כלל בתוך מתקן ננו-פשיעה / מעבדה. השיטה שנקבעה בפרוטוקול זה הוכללה ככל האפשר עבור הקהל; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בשינויים קלים בהליכים בהתאם לציוד הזמין לקורא. אנו ממליצים לבצע הליכים אלה בחדר נקי במתקן nanofabrication כדי להבטיח את איכות התהליך הגבוהה ביותר. לפני תחילת, לקבל גישה מיישר מסכה (או כמה UV-חשיפה להגדיר), מעיל ספין, צלחות חמות, תחנת כביסה ממס, photomask, מנקה פלזמה. הממסים והכימיקלים המשמשים בהליך הם מסוכנים, אז בבקשה לקחת את הטיפול העליון כדי למנוע כל חשיפה כימית. בעת עיצוב הפוטומסק, זהה אילו ופלים ופוטומסקים בגודל סיליקון תואמים למעיל הספין ומיושר המסכות. בנוסף, הפוטורסיסט הממוקם לכיוון הקצוות של רקיק הסיליקון הוא בדרך כלל מעוות מטיפול; לפיכך, להפוך את העיצובים לכיוון האזור המרכזי של הוופל.

1. הכינו פיגומים בטכניקת פוטוליטוגרפיה עם הגיאומטריה הנבחרת המעניינת.
   1. לפני ציפוי ספין, לנקות את רקיק סיליקון. זה יכול להיעשות עם ניקוי פלזמה או טכניקה מבוססת ממס. אם ניקוי פלזמה, בצע את נוהל הפעולה הסטנדרטי של המכשיר לקבלת פרטים תפעוליים. מרססים בגז חנקן דחוס ובודקים את הוופל כדי לוודא שהוא נקי מפסולת לפני ציפוי ספין. רקיק זה ישמש כמצע שעליו נוצרים הפיגומים.
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, התחל עם רקיק טרי. וופלים ניתן להשתמש מחדש אבל צריך להיות חופשי של photoresist הישן, פגמים פני השטח ופסולת. כדאי להשתמש בפינצטה לטיפול.
   2. מרכזים רקיק סיליקון על צ'אק מעיל הספין באמצעות מדריך. בקצרה לסובב את הוופל כדי להבטיח שהוא כבר מרוכז כראוי על צ'אק, להתאים לפי הצורך עד מרוכז כראוי. זה חייב להיעשות בכל פעם ופל ממוקם על מעיל ספין. לוותר 1-4 מ"ל של מגיב ההמראה על הוופל (זה יהיה תלוי בגודל של הוופל). כ 2 מ"ל של ריאגנט להרים עובד היטב עבור רקיק 4 אינץ '.
      1. הגדר מהירות התפשטות של ספין-קווילר במהירות של 500 סל"ד למשך 5 שניות, ואת מהירות הסיבוב ל- 1000 סל"ד למשך 30 שניות ולאחר מכן סובב את מגיב ההמראה. בדוק את הוופל כדי לוודא שיש לו ציפוי אחיד על פני הוופל. כל פסולת שנותרה על הוופל תהיה מאוד ברורה בשלב זה. כל הפיגומים באזור עם פסולת צפויים להיות בלתי שמיש. לאחר ציפוי ספין, מעבירים לצלחת חמה ואופים במשך דקה אחת ב-200 מעלות צלזיוס.
   3. חזור על השלב הקודם פעמיים נוספות עבור סך של שלושה ציפויים.
   4. ספין-ציפוי ריאגנט מצופה רקיק סיליקון עם SU-8 2050 photoresist עד קבלת עובי של כ 100 מיקרומטר.
      1. לוותר 1 מ"ל של התנגדות על כל 25 מ"מ של קוטר מצע.
         הערה: היזהר להימנע בועות תוך כדי לשפוך את ההתנגדות. עבור SU-8 2050, לשפוך בערך עיגול בקוטר 2 אינץ', בעת שימוש רקיק סיליקון 4 אינץ' עובד היטב.
      2. ספין מעיל SU-8 2050. להפיץ במהירות של 500 סל"ד במשך 5 שניות, ואחריו מהירות ספין בין 1700 ל 1800 סל"ד כדי להשיג כ 100 מיקרומטר עובי.
      3. אופציונלי: לאחר סיבוב, להשאיר את הוופלים מצופים ספין כדי de-gas לילה על משטח מפלס מוגן מפני אור לפני האפייה מראש. זה עשוי לעזור להיפטר להתנגד של כל בועות ולאפשר פגמים להתיישר.
         הערה: עובי ההתנגדות בפועל והפיגומים הנובעים מכך עשויים להשתנות בהתאם לשגיאת המשתמש ולפרמטרים של הציוד. לכן, יש לאמת את עובי הפיגומים מאוחר יותר, בשלב 1.6. לשנות נהלי ציפוי ספין בהתאם כדי להשיג את העובי הרצוי.
   5. לפני החשיפה, אופים מראש את הוופלים ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס במשך 40-50 דקות. לפני החשיפה, בדוק את פני השטח של ההתנגדות על ידי לחיצה על הקצה עם זוג פינצטה כדי לוודא שהוא כבר לא דביק / צמיג. זה מועיל למשוך את הוופל של הצלחת החמה ולאפשר לו להתקרר במשך 0.5-1 דקות לפני הערכת דביקות.
      הערה: זמני הרמפה בטמפרטורה איטית (חימום וקירור) עשויים לסייע במניעת עיוות הפיגומים.
2. לחשוף את photoresist לאור UV (350-400 ננומטר) באמצעות פוטומסק עם אנרגיית חשיפה של 215-240 mJ / cm² עבור עובי להתנגד של 85 - 110 מיקרומטר. עיין בהנחיות יצרן פוטורסיסטיות למתאמים מומלצים של עובי אנרגיה לחשיפה.
   1. ודא שהחשיפה מכוילת כראוי כך שהאנרגיה מאומתת. התאם את זמן החשיפה לפי הצורך כדי להשיג את אנרגיית החשיפה הרצויה. יתר על כן, מיישרי מסכות עשויים לאפשר מצבי חשיפה שונים: מגע ואקום, מגע קשה, מגע רך ומגע קרבה (מונחים ספציפיים עשויים להשתנות). בדרך כלל, אלה ישפיעו על הרזולוציה ועל יישור התכונות. המחברים השתמשו בדרך כלל במצב "מגע קשה".
   2. עבור תכונות קטנות או שכבות מרובות, כאשר היישור יהיה חשוב, שקול מצבי חשיפה והליכי יישור מסיכה בזהירות רבה יותר. הקפד לשקול את גובה ההתנגדות בעת התאמת ערך העובי. עיין בהליכי ההפעלה הרגילים של מיישר המסיכה לקבלת פרטי פעולה.
      הערה: עיצוב הפוטומסק יקבע את גודל הפיגומים, הגיאומטריה של התא ומספר הפיגומים המתקבלים לכל אצווה. השימוש בזכוכית קשה או פוטומסק קוורץ יניב את הרזולוציה הגבוהה ביותר; עם זאת, פוטומסק סרט שקוף פולימר רך בדרך כלל יכול לשמש עבור גדלי תכונות גדולים אלה (>10 מיקרומטר). השימוש בסרט פוטומסק עלול להוביל לתכונות טופוגרפיות לאורך ציר z של נקבוביות הפיגום כתוצאה מרזולוציה תכונה ירודה יותר. זה יכול להשפיע על התנהגות התא. ודא שהפתרון הרצוי מתייעץ עם מי שמייצר את הפוטומסק כדי להבטיח שהרזולוציה הרצויה תושג.
3. אופים את הוופל מיד לאחר החשיפה UV ב 65 מעלות צלזיוס במשך 2-5 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך 8-10 דקות.
4. פתח את הפיגומים כדי להסיר התנגדות לא מפותחת.
   1. לטבול את הפיגומים באמצעות נפח נמוך של פתרון מפתחים SU-8 במשך 7-10 דקות כדי להמיס כל התנגדות מפותחת.
   2. יש לשטוף עם אלכוהול איזופרופיל (IPA).
   3. רקיק יבש עם חנקן דחוס.
      הערה: היזהר במהלך שלב 1.4 לא לגרום לשחרור מוקדם של הפיגומים. כמויות נמוכות של מפתחים וטיפול עדין נחוצים כדי להשיג זאת.
5. לאחר הפיתוח, קשה לאפות את הוופלים ב 150 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
   הערה: לאחר אפייה קשה, כיבוי הלוחית כדי לאפשר לוופלים להתקרר לאט מאוד עשוי להיות יתרון במניעת עיוות / קרלינג של הפיגומים הסופיים.
6. אופציונלי: בעקבות האפייה הקשה ולפני ההמראה, להעריך את עובי הפיגומים מאז הפיגומים עדיין צריך להיות דבק בעדינות על פני השטח של הוופל. עבור הליך זה, פרופיל מגע עובד היטב; עם זאת, ניתן היה צורך בכל שיטה מתאימה.
7. הרם את הפיגומים מהוופל.
   1. הטביעו את הפיגומים במפתח SU-8 כדי לגרום להם להרים מיד את הוופל. אם הפיגומים אינם מורמים, דחפו בעדינות את הפיגומים עם זוג פינצטה.
   2. הסר מפתח עודף.
   3. מעבירים את הפיגומים למיכל חדש ושקעים באלכוהול איזופרופיל. שטף ב- IPA למשך 6 פעמים לפחות כדי להבטיח שכל המפתחים הוסרו.
8. האוויר מייבש את הפיגומים למשך שבוע לפחות לפני השימוש.

2. ציפוי פיברונקטין פיגומים

1. לחיטוי, יש לטבול את הפיגומים ב-70% אתנול (v/v) למשך 15 דקות לפחות, ולשטוף פעמיים מלוחים עם אגירת פוספט (PBS) לפני השימוש.
   התראה: הפיגומים SU-8 הם שבריריים ויכולים להישבר בקלות. הטיפול מומלץ באמצעות מלקחיים קהים ומעוגלים, ויש לטפל בהם בזהירות מירבית. טיפול קל יותר יכול להיות מושגת על ידי שקיעת הפיגומים בנוזל, כדי למנוע אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין הפיגומים לבין פני השטח.
2. הכן דילול של 50 מיקרוגרם / מ"ל של פיברונקטין אנושי ב- PBS ולכסות את הפיגומים על ידי ספיגת חלבון.
   1. יש לערבב 1.5 מיקרו-ל' של תמיסת מלאי פיברונקטין (1 מ"ג/מ"ל) עם 28.5 מיקרו-μL של PBS לכל פיגום שיש לזרוע. רצוי, להכין רק דילול אחד fibronectin לשמש עבור כל הפיגומים, כדי למנוע שגיאות pipetting.
      1. עבור 10 פיגומים, לערבב 15 μL של פתרון פיברונקטין מלאי ב 285 μL של PBS, בהיקף כולל של 300 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל דילול פיברונקטין.
   2. מניחים את הפיגומים בדלילות על גבי משטח הידרופובי (כלומר, תרבות ללא רקמות (nonTC) 10 ס"מ צלחת) ומכסים כל פיגום עם 30 μL של דילול fibronectin מוכן בשלב 2.2.1.
      התראה: ודאו שאין בועות לכודות בתאי הפיגומים. אם בועות נמצאות, ניתן להסיר אותן על ידי טלטול עדין של הפיגום בתוך הטיפה או הצינור הקל.
   3. החלף את מכסה הצלחת והנח את הפיגומים המכוסים בפיברונקטין באינקובטור עם 37 מעלות צלזיוס ולחות של 100% למשך שעה לפחות.
   4. לאחר הדגירה, לשטוף קלות את הפיגומים PBS כדי להסיר שרידים fibronectin. ניתן לשמור את הפיגומים ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס עד שבוע לפני השימוש.

3. תאי אנדותל זורעים

1. הכן מדיום EC על ידי ערבוב המדיום הבסיסי עם רכיבי הערכה הבינונית כתב שלה, כולל פתרון אנטיביוטי (עט / סטרפטוקוקוס), סרום שור עוברי (FBS), ותוספי צמיחת תאי אנדותל, כפי שצוין על ידי היצרן.
2. הפוך תא אנדותל מיקרו-וסקולרי שומן אנושי (HAMEC) השעיה במדיום EC עם ריכוז של 4 x 10⁶ תאים / מ"ל.
   הערה: הדמיה בזמן אמת יכולה להתבצע אם תאי האנדותל המשמשים מודבקים בעבר כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי, או מוכתמים מראש באמצעות צבע קרום ציטופלסמי לא רעיל (המכונה עוד יותר ECs).
3. בעזרת מלקחיים, מניחים פיגום אחד מצופה פיברונקטין לבאר על צלחת 24 באר שאינהTC.
4. מכסים כל פיגום עם 25 טיפות μL של השעיית HAMEC. היזהר לא לתת את ההשעיה לזרום הרחק הפיגום, שכן הוא יכול לעכב הידבקות התא.
5. שים את המכסה על הצלחת ומניחים אותו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו 100% לחות. תן דגירה במשך מינימום של 60 דקות ומקסימום של 90 דקות.
   הערה: במהלך הדגירה, הנחת הצלחת על שייקר מסלולית בתוך החממה משפרת את חיבור התא על קירות הפיגום. שייקר מסלולית צריך להיות מוגדר לא יותר מ 5 סל"ד.
6. לאחר הדגירה, למלא כל באר עם 700 μL של מדיום EC באמצעות פיפטה.
   הערה: צפו לראות ECs בתחתית הבאר, שכן חלק מהתאים אינם מתחברים לפיגום ונופלים דרך חללי הפיגום.
7. דגירה פיגומים אנדותל עד מפגש EC ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית על קירות הפיגום (בעת שימוש ECs שכותרתו), או במשך 3 ימים (בעת שימוש ECs שאינם מסומנים), אשר מספק מספיק זמן כדי להשיג מפגש EC. לשנות את המדיום כל יומיים.

4. תמיכה בזריעת תאים ותרבות משותפת

1. הכן תאי גזע עיסת שיניים (DPSC) בינוני (DPSCm) על ידי ערבוב 500 מ"ל של בינוני הנשר שונה של Dulbecco גלוקוז נמוך (DMEM גלוקוז נמוך), 57.5 מ"ל של FBS, 5.75 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 5.75 מ"ל של גלוטמקס ו-5.75 מ"ל של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-ניסטטין.
2. העבר את הפיגומים שעברו אנדותל לצלחת חדשה שאינה 24 בארות של TC כדי להשליך ECs המחוברים לתחתית הבארות באמצעות מלקחיים.
   1. השלך את כל המדיה מהצלחת הנוכחית באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, או יניקת ואקום. היזהר לא להחיל ואקום ישר על הפיגום.
   2. מניחים פיגום אחד לבאר, רצוי במרכז הבאר, כדי למנוע ריצת נוזל לכיוון הקירות עקב השפעות מתח פני השטח. יבש את האזור המקיף את הפיגום עם ואקום קל אך הימנע ייבוש מלא של הפיגום.
3. הכינו השעיית DPSC בתמיסת פיברין טרום ג'ל.
   1. לדלל פתרונות מלאי תרומבין ופיברינוגן עם PBS עד להשגת ריכוז סופי של 5 U /mL ו 15 מ"ג / מ"ל, בהתאמה.
   2. הכן השעיה 8 x^{10 6} DPSC / mL בדילול תרומבין 5 U / mL ולהפיץ eppendorfs בודדים 12.5 μL של ההשעיה כאמור לכל פיגום להיות זרע.
   3. הגדר פיפטה μL 5-50 (או דומה) ל 12.5 μL ולמלא אותו עם 15 מ"ג / מ"ל פיברינוגן פתרון.
   4. מבלי להסיר את הקצה, הגדר את פיפטה ל 25 μL. החומר בקצה צריך לעלות ולהשאיר נפח ריק לכיוון פתיחת הקצה.
   5. לחץ לאט על כפתור הכועף עד שהנוזל מגיע לפתיחת הקצה אך אינו דולף החוצה. החזק את הוכנה במצב זה ולשים את הקצה לתוך אחד הצינורות microcentrifuge המכילים את התאים המתלים תרומבין, לוודא את הקצה הוא במגע עם הנוזל.
      התראה: הצלבת הפיברין תתחיל מיד לאחר שהטרומבין והפברינוגן יבואו במגע. השלב הבא צריך להיעשות במהירות.
   6. שחרר בעדינות את לחצן הכועף ומשוך את המתלה של התא לקצה. ביסודיות לערבב את שני החומרים, הימנעות היווצרות בועה.
4. מחלקים במהירות את החומרים המעורבים על גבי פיגום אנדותל. חזור על השלבים הקודמים עבור כל פיגום, הקפד תמיד לשנות טיפים בין שימושים כדי למנוע היווצרות ג'ל פיברין בלתי צפוי בתוך הקצה.
5. החלף את מכסה הצלחת ודגר את הפיגומים ב 37 °C (60 °F), 5% CO₂ ו 100% לחות במשך 30 דקות.
6. לאחר הדגירה, מלאו כל באר ב-1 מ"ל של 1:1 DPSC ובינוני EC.
   1. תרבות במשך שבוע, משתנה מדיום כל יומיים.
   2. במהלך התרבות, להסיר את המדיום מן הבאר תמונה המבנים באמצעות מיקרוסקופ confocal בזמן שונה מצביע ללמוד את התפתחות כלי הדם או כל פרמטר אחר של עניין.
      הערה: שלב זה יכול להתבצע רק אם הניסוי מבוצע באמצעות ECs שכותרתו. ראה שלב 6 - הערה לבירור נוסף.

5. כתמי כשל חיסוני לסמני כלי דם אופייניים

הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים באותן בארות שבהן המבנים היו תרבותיים. זה קריטי תמיד לוודא כי הפתרונות מכסים לחלוטין את הפיגומים. יתר על כן, כאשר הדבר אפשרי, מומלץ לבצע את השלבים על שייקר מסלולית, אם כי לא חובה.

1. ביום 7, להשליך את התקשורת מן הבארות ולשטוף את הפיגומים על ידי הוספת PBS לבארות, והסרת אותו באמצעות ואקום.
2. לתקן את הפיגומים על ידי הוספת 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות. יש לשטוף ב-PBS 3 פעמים, 5 דקות לכביסה.
3. לחלחל לתאים הקבועים באמצעות 0.3% טריטון-X ב PBS (v / v) במשך 15 דקות. יש לשטוף ב-PBS 3 פעמים, 5 דקות לכביסה.
4. הכינו 5% אלבומין סרום שור (BSA) בתמיסת חסימת PBS (w/v) וכיסוי הפיגומים. השאירו בטמפרטורת החדר למשך שעה.
   הערה: כל סכומי הפתרון הנדרשים יהיו תלויים במספר הפיגומים שיוכתמו. הכינו את הפתרונות לפי הצורך תוך שמירה על הריכוזים המוצהרים.
5. להכין וליישם את הנוגדנים העיקריים כתם פתרון .
   1. לדלל ארנב נגד פון Willebrand גורם (vWF) נוגדן 1:150 ועכבר נגד SMA נוגדן 1:50 בתמיסת חסימה טריים.
      הערה: ניתן להשתמש בסמנים אחרים של תאי אנדותל, כגון CD31 או VE-Cadherin.
   2. מכסים את הפיגומים בתמיסת הנוגדנים העיקרית ושומרים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף PBS שלוש פעמים, 5 דקות לכל לשטוף.
6. להכין וליישם את הנוגדנים המשניים כתם פתרון.
   1. לדלל עז נגד עכבר Cy3 נוגדן 1:150 ועז נגד ארנב אלקסה-פלואור 488 1:400 ב PBS.
   2. מכסים את הפיגומים בתמיסת הנוגדנים המשנית ומדגרים למשך 3 שעות לפחות בטמפרטורת החדר, או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. יש לשטוף 3 פעמים ב-PBS, 5 דקות לכביסה. שמור פיגום מוכתם ב 0.3% PFA ב PBS (v / v) עד חודש.

6. הדמיה קונפוקלית פיגומים וניתוח פיתוח כלי שיט

הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים על הפיגומים הקבועים והמוכתמים בנקודת הזמן הסופית שנבחרה או, אם נעשה שימוש בתאי פלואורסצנט, במהלך תקופת תרבות התא ללא צורך לסיים את הניסוי. עבור האחרון, מומלץ להגדיר נקודות זמן ספציפיות; עבודה זו מציגה את היום 0 (לפני זריעת SCs) ואת הימים 1, 3, 5 ו- 7 לאחר זריעת SCs (איור 3A).

1. צלם את הפיגומים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשת פי 5 וזום של 0.5 וטווח z המלא של הפיגום. זה יאפשר ללכוד 9 תאים נפרדים עבור הגיאומטריות המרובעות והמעגליות, או 8 תאים מלאים לגיאומטריה המשושה. צלם את אות הפלואורסצנט ואת האור המשודר, כדי לקבל הן את מבנה רשת כלי השיט והן את הגיאומטריה של התא (איור 3A).
2. באמצעות ImageJ (או כל תוכנה אחרת לעיבוד תמונה), חתוך כל תא בנפרד; עבור תהליך זה, רק סמני רשתות כלי הדם רלוונטיים. הסר כל כלי שאינו ממוקם בתוך אזור התא. צרו הקרנה בעוצמה מרבית ושמרו כל תא חתוך כתמונת TIFF.
   1. ב- ImageJ, הקש על קובץ > פתח ובחר את תמונת TIFF הרצויה המכילה מספר תאים. לתמונה צריכים להיות לפחות שני ערוצים, רשת כלי הפלואורסצנט ותמונת האור המשודרת.
   2. בסרגל הכלים, בחרו בכלי הבחירה 'מצולע'. בחר את ערוץ האור המשודר. לחץ על אחת הפינות של תא משושה, בממשק בין אזור התא לבין קיר הפיגום, זה יתחיל את הגדרת המסכה. המשך ללחוץ על הפינות הבאות בסדר רציף עד לבחירת הפינה ההתחלתית, וסגור את המסיכה.
      הערה: הסבר זה חל על תא משושה. כאשר התא בריבוע או באופן מעגלי, השתמש בכלי מלבן או אליפסה, בהתאמה, כדי ליצור מסיכה מתאימה. ללא קשר לצורה, תמיד להתאים את המסכה לעקוב אחר הקיר הפנימי של הפיגום.
   3. לחץ על ניתוח כלי > > מנהל ההחזר על ההשקעה. במנהל ההחזרים על ההשקעה (ROI, אזור עניין), לחץ על לחצן הוסף כדי לשמור את המסיכה שנוצרה. המסכה החדשה תופיע ברשימה השמאלית. שלב זה מאפשר לניתוח להיות עקבי בין תמונות שונות.
      הערה: במנהל ההחזר על ההשקעה, ניתן לשמור קובץ עם כל המסכות שנוצרו על ידי לחיצה על עוד > שמור. בחלון שמירת בחירה, בחר שם ומיקום ושמור את קובץ ה- .roi כדי לאחזר את המסכה, במנהל ההחזר על ההשקעה, לחץ על עוד > פתח ובחר את קובץ ה- .roi הרצוי.
   4. בחרו בתמונת רשת כלי השיט הפלואורסצנטית ולחצו על 'ערוך > נקה בחוץ. רק התמונה הכלולה במסכה תישאר, והשאר יבוטלו.
   5. כאשר תמונת הרשת המנוקה פתוחה, לחץ על תמונה > שכפל. בחלון הנפתח Duplicate, כתוב את שם התמונה. אם נבחרה האפשרות 'שכפול היפר-סטאק', בטלו את הבחירה בו ולחצו על הלחצן 'אשר'. תמונה חדשה המכילה רק את רשתות כלי הפלואורסצנט החתוכים תיווצר.
   6. שמור את התמונה שנחתכה על-ידי לחיצה על קובץ > שמור כ- Tiff >. בחרו בשם ובספריה ולחצו על הלחצן 'אשר'.
3. לנתח את התפתחות כלי הדם על התמונות שנחתכו.
   1. הורד והתקן את התוכנה החופשית האנליטית AngioTool, המספקת כלים כמותיים לכמת מגוון פרמטרים של כלי דם. ניתן להשיג את התוכנה מהכתובת הבאה https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
   2. קבעו את ערך קנה המידה של התמונות כדי להשיג תוצאות ביחידות מילימטר ולטעון תמונה.
      1. לחץ על הכרטיסיה הגדרה ומלא את המרחק בפיקסלים ומרחק במ"מ עם ערכים מייצגים מהתמונות שצולמו. באמצעות פרמטרי ההדמיה שהוזכרו לעיל, הערכים למילוי הם 400 פיקסלים לכל 1 מ"מ.
      2. לחצו על הלחצן 'פתח תמונה' ודנו את התמונה המעניינת.
   3. בחר את פרמטרי הניתוח כדי לכמת את התפתחות כלי השיט בכרטיסיה ניתוח.
      1. תחת השדה 'קוטר כלי קיבול' ו'אינטנסיביות', בטלו את הבחירה בכל סמן קיים מהבורר בטווח העליון, והפעילו את הסמן המייצג את המספר 3.
      2. תחת קוטר כלי השיט ושדה האינטנסיביות, בבורר הטווח התחתון, הזיזו את סמן הטווח התחתון ל-60, והשאירו את יצרנית הריינג'רים הגבוהה על 255.
      3. הפעל את התיבה הסר חלקיקים קטנים והגדר את הסמן ל- 100.
      4. תחת השדה העדפות שמירה, בחר את השם והמיקום של קובץ גליון הכפולות שבו יישמרו התוצאות ולחץ על לחצן הפעל ניתוח. אם התיבה שמור תמונת תוצאה נבחרה, אנגיטול תיצור ותשמור תמונת jpeg חדשה המציגה את הפרמטרים המכומתים של רשת כלי השיט.
         הערה: עבור כל ניתוח שבוצע מבלי לשנות את שם קובץ גליון הכפולות, שורה חדשה תתווסף בתחתית הקובץ, עם התוצאות החדשות שנרכשו.
4. ארגן את הנתונים והפעל ניתוח סטטיסטי.
   1. עבור כל התמונות המעובדות, בחרו בפרמטר העניין מגיליון הכפולה (למשל אורך כלי שיט ואזור כלי שיט)והזינו אותן לתוכנת ניתוח סטטיסטית כדי ללמוד כראוי את התוצאות שהתקבלו (איור 3C).

7. הדמיית זמן לשגות עבור נבט זיהוי מקור ומעקב הגירה

1. לחלופין, כדי culturing הפיגומים באינקובטור כמתואר בשלב 4.6, להגדיר תא תרבות מיקרוסקופ confocal ל 37 °C (69 °F), 5% CO₂ ו 100% לחות.
   1. שים את הצלחת המכילה את הפיגומים שנזרעו במלואם בתא המיקרוסקופ הקונפוקלי והגדר את פרמטרי ההדמיה לערכים הרצויים.
   2. הגדר את מרווח הזמן של התמונה ל- 30 דקות ואת זמן ההדמיה הכולל של 72 שעות. פעולה זו תאפשר להפעיל את הזמן לשגות לחלוטין ללא צורך בשינוי בינוני.
      התראה: במקרה של זמן רב יותר הדמיה לשגות רצוי, כיול מיקום זהיר צריך להתבצע כדי להיות מסוגל לאחזר את מיקום ההדמיה המקורי, שכן שינויים בינוניים דורשים הסרת הצלחת מן החממה confocal לתוך מכסה המנוע הביולוגי סטרילי.
      הערה: ניתוק מעגלים אלקטרוניים מקירות הפיגום וממבנה הצינור יתחיל בשעה הראשונה לאחר זריעת SCs (שלב 4) ועשוי להימשך עד 50 שעות. לאחר היווצרות הצינור הראשונית, נבטים חדשים יתחילו לנדוד לתוך התא מכלי הדם שמסביב. הנבטים ושיפוץ הרשת הבאים יימשכו לאורך כל הניסוי בערך עד יום 10, כאשר רשתות כלי השיט יהפכו ליציבות²². השתמש במידע זה כדי לבחור את נקודת ההתחלה ואת שלב הזמן בהתאם.
2. שמור את קובץ הסרט לשגות זמן מלא כרצף TIFF.
3. פתחו את ImageJ ולחצו על 'קובץ' > 'ייבוא > רצף תמונה' ובחרו את הקבצים שלכם. פעולה זו תפתח את רצף TIFF שלך כסרט.
4. פתח את תוסף המעקב הידני על ידי לחיצה על תוספים > מעקב ידני. פעולה זו תפתח את החלון מעקב.
5. התבונן בסרט ובחר את הכלי למעקב. שים לב למקורו ולנדידתו.
6. הפעל את התיבה הצג פרמטרים והזן את 30 הדקות עבור מרווח זמן. כיול x/y יהיה תלוי בכמות הפיקסלים שנבחרה במהלך ההדמיה.
7. המשך לעקוב ידנית אחר כלי הנבטים מקווי המתאר של הפיגומים.
   1. לחץ על לחצן הוסף רצועה. על המסגרת הראשונה של הסרט, לחץ על המיקום של כלי השיט כדי להיות במעקב. לאחר מכן, הסרט ישתנה למסגרת הבאה באופן אוטומטי.
   2. לחץ על התמונה של המסגרת השנייה שבה כלי השיט ממוקם. שוב, הסרט ישתנה למסגרת הבאה באופן אוטומטי.
   3. המשך עם אותה ספינה עד להשלמת מעקב ההעברה המלא.
   4. בחלון מעקב, לחץ על נקודות כיסוי & קווים כדי להטביע נתיב חזותי של העברת כלי השיט בסרט. פעולה זו תפתח עותק של הסרט עם נקודה המייצגת את המיקום הנוכחי של הגשש וקו המציג את הנתיב הקודם.
   5. לחץ על כפתור רצועת סיום כדי לסיים את הקלטת תנועת כלי השיט הנוכחית.
   6. לחץ שוב על לחצן הוסף רצועה כדי להתחיל מחדש עם כלי חדש. כאשר עושים זאת, סמני הקו והנקודה ישנו באופן אוטומטי את צבעם עבור הכלי החדש. יש לחזור על הפעולה עד למעקב אחר כל כלי השיט הרצויים.
      הערה: ניתן לאחזר את מיקום x/y, מהירות כלי השיט והמרחק המוזז מהחלון המוקפץ תוצאות. כל חללית תזוהה לפי מספר המסלול שלה בעמודה השמאלית ביותר. ניתן להעתיק ולהדביק נתונים אלה בגליון כפולות כדי לבצע ניתוח נוסף.

תוצאות

הפרוטוקול המוצג, בטכניקות סטריאוליטוגרפיה, מאפשר ייצור של פיגומים עם טסלה העשויים מפוטורסיסט SU-8. הושגו פיגומים עם גיאומטריות תא נפרדות (ריבועים, משושים ועיגולים) ותכונות מדויקות וחוזרות על עצמן ביותר (איור 1).

איור 1: סריקת תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים מייצגות של הגיאומטריות ...

דיון

הצורך בכלי דם עשיר בתוך מוטבע ברקמות מהונדסות הוא קריטי לבניית הישרדות ותפקוד תקין¹. למרות הנדסת מערכת כלי הדם כבר המוקד של כמות עצומה של מחקר, הרבה נשאר לחקור ולהבין²⁴. בפרט, בעת יצירה מחדש של רקמה ספציפית, microvasculature צריך להתנהג ולארגן בהתאם¹². הגישה הנפוצה ביותר ליצירת מיקרו-סלבסלים היא תאי אנדותל ותמיכה בזריעת תאים בתוך סביבה תלת-ממדית מתאימה התואמת לחיבור לתאים, התפשטות והיווצרות כלי^{שיט 25}. מתודולוגיה זו גורמת לעתים...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוכנה חינמית של Angiotool	NIH-CCR		להורדה בחינם ב
https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home סרום אלבומין בקר Probumin	Millipore	82-045-1
תאי גזע של מוך שיניים	Lonza	PT-5025
ECM מדיה + ערכת כדורים	Sciencell	#1001
אתנול 96%	גדות-קבוצה	64-17-5
איטום פיברין Evicel	Johnson& ג'ונסון	EVB05IL	מספק גם תמיסות תרומבין וגם פיברינוגן (BAC2)
GlutaMAX	Gibco	35050061
נוגדן עיזים נגד עכבר Cy3	ג'קסון	115-166-072
עיזים נגד ארנב Alexa-Fluor 488	Thermo- Fisher Scientific	A11034
תאי מיקרו-וסקולריים של שומן אנושי	Sciencell	#7200
אנושי פיברונקטין	סיגמא	F0895-5MG	ריכוז מלאי: 1 מ"ג/מ"ל
ImageJ	NIH		להורדה בחינם ב https://imagej.nih.gov/ij/download.html
איזופרופיל אלכוהול	גדות-גרופ	67-63-0
מגיב הרמה	Kayaku Advanced Materials, Inc	G112850	שם מסחרי Omnicoat
Low-glucose DMEM	תעשיות ביולוגיות	01-050-1A
נוגדן נגד SMA עכבר	Dako	M0851
NEAA	Gibco	11140068
תמיסת פרפורמלדהיד 4% ב-PBS	ChemCruz	SC-281692
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-ניסטטין	תעשיות ביולוגיות	03-032-1B
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)	Sigma	P5368-10PAK
ארנב אנטי-vWF נוגדן	Abcam	ab9378
פרוסת סיליקון	עמק הסיליקון מיקרואלקטרוניקה (SVM)		פרוסות 4 אינץ', סוג N-1-10, עובי 500-550 מיקרון
SU-8 2050 photoresist	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y11058
SU-8 מפתח	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y020100
Tryton-X 100	BioLab LTD	תסמונת 57836