מאמר שיטה

שימוש בחיסון כדי לזהות נזק לדנ"א2.5המושרה בלבבות העוברים של דגי הזברה

DOI:

10.3791/62021

⸱

15 בפברואר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Soochow University, 2Toxicology, Risk Assessment and Research Division, Texas Commission on Environmental Quality

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש ב בדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM2.5בלבם הניתח של עוברים דגי זברה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חשיפה חלקיקית עדינה סביבתית (PM2.5)עלולה להוביל לרעילות התפתחותית של הלב, אך המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם ברורים. 8-הידרוקסי-2'deoxygenase (8-OHdG) הוא סמן של נזק DNA חמצוני ו γH2AX הוא סמן רגיש עבור שברי גדיל כפול DNA. במחקר זה, אנו שואפים לזהות PM2.5-המושרה 8-OHdG ו γH2AX שינויים בלב של עוברים דג זברה באמצעות בדיקת אימונופלואורסצנטיות. עוברים דגי זברה טופלו בעניינים אורגניים הניתנים לחילוץ (EOM) מ PM2.5 ב 5 מיקרוגרם / מ"ל בנוכחות או היעדר נוגד חמצון N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC, 0.25 מיקרומטר) ב 2 שעות לאחר ההפריה (hpf). DMSO שימש כפקד רכב. ב 72 כ"ס, לבבות נותחו מעוברים באמצעות מחט מזרק קבוע וחלחל. לאחר שנחסמו, דגימות נבדקו עם נוגדנים ראשוניים נגד 8-OHdG ו γH2AX. לאחר מכן נשטפו הדגימות ודגרו בנוגדנים משניים. התמונות שהתקבלו נצפו תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וכימותו באמצעות ImageJ. התוצאות מראות כי EOM מ PM2.5 משופר באופן משמעותי 8-OHdG ו γH2AX אותות בלב העוברים של דגי זברה. עם זאת, NAC, הפועל כנבלות חמצן תגובתי (ROS), נטרל חלקית את נזק ה- DNA שנגרם על ידי EOM. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אימונופלואורסצנטיות לחקירת תפקידו של נזק לדנ"א ב- PM 2.5 - מומים בלב הנגרמים על ידי PM2.5שניתן להחיל על גילוי שינויים בביטוי חלבון סביבתי המושרה כימי בלבם של עוברים דגי זברה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום אוויר הוא כיום בעיה סביבתית חמורה העומדת בפני העולם. חומר חלקיקי הסביבה בסדר (PM2.5), שהוא אחד האינדיקטורים החשובים ביותר של איכות האוויר, יכול לשאת מספר רב של חומרים מזיקים ולהיכנס למערכת הדם, גרימת נזק חמור לבריאותהאדם 1. מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי חשיפה PM2.5 יכול להוביל לסיכון מוגבר של מומים מולדים בלב (CHDs)2,3. עדויות מניסויים בבעלי חיים הראו גם כי PM2.5 יכול לגרום להתפתחות לב חריגה בעוברי דגי זברה וצאצאים של עכברים, אבל המנגנונים המולקולריים של הרעילות ההתפתחותית הלבבית של PM2.5 עדיין לא ידוע במידה רבה4,5,6.

נזק לדנ"א יכול לגרום למעצר מחזור התא ולגרום לאפופטוזיס, אשר עלול להרוס בהרחבה את הפוטנציאל של תאים אבות, וכתוצאה מכך, לפגוע בהתפתחות הלב7). זה כבר מתועד היטב כי מזהמים סביבתיים, כולל PM2.5, יש פוטנציאל לתקוף DNA באמצעות מנגנוני עקה חמצונית8,9. הן התפתחות הלב האנושי והן של דג הזברה רגישים ללחץ חמצוני10,11,12. 8-OHdG הוא סמן נזק DNA חמצוני, ואות γH2AX הוא סמן של שברי גדיל כפול DNA. N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC), מבשר סינתטי של ציסטאין תאי וגלוטתיון, נמצא בשימוש נרחב כתרכובת נוגד חמצון. במחקר זה, אנו משתמשים NAC כדי לחקור את התפקיד של עקה חמצונית PM2.5- נזק DNA המושרה13.

דגי זברה כעליית חוליות מודל שימשו באופן נרחב לחקר התפתחות הלב ומחלות לב וכלי דם אנושיים מכיוון שמנגנונים של התפתחות הלב נשמרים מאוד בקרב בעלי חוליות14,15. היתרונות של שימוש בדגי זברה כמודל כוללים את גודלם הקטן, יכולת הרבייה החזקה ועלות האכלה נמוכה. עניין מיוחד במחקרים אלה, עוברים דג זברה אינם תלויים במערכת הדם במהלך ההתפתחות המוקדמת ויכולים לשרוד מום לב חמור14. יתר על כן, השקיפות שלהם מאפשרת את כל הגוף להיות נצפה ישירות תחת מיקרוסקופ. לכן, עוברים דגי זברה מספקים הזדמנות יוצאת דופן להערכת המנגנונים המולקולריים המעורבים בגיוס רעילות התפתחותית לבבית כתוצאה מחשיפה לכימיקלים סביבתיים שונים5,16,17. דיווחנו בעבר כי PM2.5- סטרס חמצוני המושרה מוביל לנזק DNA אפופטוזיס, וכתוצאה מכך מומים בלב דג זברה18. במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחקירת נזק DNA המושרה PM2.5בלב העוברים של דגי זברה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגי זברה מסוג בר (AB) המשמשים במחקר זה התקבלו ממרכז המשאבים הלאומי לדגי זברה בווהאן, סין. כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן נבדקו ואושרו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה של אוניברסיטת סוכו.

1.2.5 דגימה ומיצוי תרכובות אורגניות

הערה: PM2.5 נאסף באזור עירוני בסוז'ואו, סין, 1-7 באוגוסט 2015, כפי שתואר קודם לכן5.

  1. אופים מסנני קרום קוורץ 47 מ"מ בכבשן עמעם של 500 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי להסיר את הרכיבים האורגניים.
  2. מקם מסנן בסמפלר PM2.5 למשך 24 שעות של דגימה ללא הפרעה.
  3. מוציאים את המסנן ומייבשים למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
  4. כימת את המסנן עם איזון אנליטי.
  5. לחלץ רכיבים אורגניים מהמסנן על ידי מיצוי Soxhlet באמצעות dichloromethane כמו ממס19.
  6. יבש את EOM על ידי אידוי סיבובי באמבט מים 60 °C וזרימת חנקן. להמיס EOM ב- DMSO ולאחסן ב -20 °C (70 °F).

2. איסוף וטיפול בעוברי דגי זברה

  1. שמור על דג הזברה ב 28.5 ± 0.5 °C (5 °F) במערכת חקלאות ימית במחזור מחדש עם מחזור פוטופריוד 14 שעות ו 10 שעות כהה photoperiod.
  2. הניחו דגי זברה בוגרים בריאים במיכל ביחס של 2:1 בין זכר לנקבה.
  3. למחרת, לאסוף את העוברים ולשטוף אותם עם מי מערכת (כלומר, מי רבייה של דגי זברה).
  4. בחר וחלק באופן אקראי עוברי דגי זברה המדגים התפתחות נורמלית (גודל אחיד, דגנים מלאים וללא קרישת ביצים) ל-4 קבוצות בצלחות פטרי מזכוכית בודדות בקוטר של 7 ס"מ (כ-50 עוברים למנה).
  5. לטפל בעוברים עם PM2.5 (5 מ"ג / ליטר) בנוכחות או היעדר NAC ב 0.25 מיקרומטר מ 2 כ"ס עד 72 כ"ס. השתמש ב- DMSO כפקד רכב לריכוז סופי של 0.1% (v/v).

3. תצפית מורפולוגית של עוברים דגי זברה ניתור לב

  1. ב 72 כ"ס, להעביר עוברים שקופיות זכוכית להתבונן תחת מיקרוסקופ סטריאו. הקלט מומים בלב, כגון בצורת קרום הלב, לולאה שונה, וירידה בגודל.
  2. חשב שיעורי מום (אחוז העוברים עם מומים בלב מתוך סך העוברים החיים) ולנתח הבדלים בין קבוצות באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של טורקיה (p < 0.05 = מובהק סטטיסטית).
  3. למרדים את העוברים עם 0.6 מ"ג / מ"ל MS-222 כדי לשתק אותם על מגלשות זכוכית.
  4. הקלט פעימות לב עבור 30 s ולכומת את קצב הלב באמצעות תוכנת ImageJ5,20.
  5. לנתח לבבות מעוברי דגי זברה עם מחט מזרק חד פעמית תחת מיקרוסקופ סטריאו. אזהרה: הימנעו מהריסת צורת הלב.

4. אימונופלואורסצנטיות

  1. כדי להשתמש בבדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM2.5 בלב העוברים של דגי זברה, השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול בצד זכוכית נקי.
  2. הוסף 50 μL של 4% paraformaldehyde כדי 1.25 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי להפוך פתרון קבוע.
  3. מניחים 3 לבבות ניתחו לתוך מעגל עט מחסום הידרופובי אחד ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. דקת הפתרון מתחת למיקרוסקופ ולייבש את הדגימות בטמפרטורת החדר לפחות 5 דקות, כך הלבבות מחוברים לחלוטין שקופיות זכוכית.
  5. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS עם 0.1% Tween 20 (PBST) במשך 5 דקות לכביסה.
  6. הוסף 50 μL של אלבומין סרום בקר (BSA) כדי 1000 μL של PBST כדי להשיג פתרון 5% BSA ודגורת השקופיות בתא לח עבור 1 שעה כדי לחסום כריכת נוגדנים ספציפית.
  7. Decant הפתרון לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות לכל לשטוף.
  8. לדלל 2 μL של נוגדן חד שבטי עכבר נגד 8-OHdG ו 2 μL של נוגדן פוליקלונלי ארנב נגד γH2AX ב 296 μL של PBST כדי להשיג פתרון קוקטייל נוגדנים ראשוני עובד.
  9. לדגור את דגימות הלב עם 50 μL של פתרון קוקטייל הנוגדנים העיקרי נגד 8-OHdG ו γH2AX בתא לח לפחות שעה אחת בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (דגירה לילה יכול להגביר את עוצמת האות).
  10. Decant הפתרון לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות לכל לשטוף.
  11. לדלל 1 μL של נוגדן משני נגד עכבר עיזים תווית FITC ו 1 μL של נוגדן משני נגד ארנב עז cy3 ב 498 μL של PBST כדי להשיג פתרון קוקטייל נוגדנים משני עובד ודגורת הדגימות עם הנוגדנים המשניים (1:500 ב PBST) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
  12. פירוק הפתרון ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף מוגן מפני אור.
  13. הוסף 20 μL של DAPI (4',6-diamidino-2-פנילינדול) לדגימות עבור כתמים גרעיניים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  14. יש למרוח כיסוי על החלקה ולאטום עם לק כדי למנוע ייבוש ותנועה. לאחר מכן צלם את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכמת את אות הפלואורסצנטיות של אזור הלב באמצעות תוכנת ImageJ. חשב את השינויים היחסיים עם הממוצע של דגימות פקד DMSO. קבע את המשמעות הסטטיסטית של הנתונים כמו בשלב 3.2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקה חיסונית זו היא שיטה רגישה וספציפית למדידת שינויים בביטוי חלבונים בליבם של עוברים דגי זברה החשופים לכימיקלים סביבתיים.

בניתוח מייצג זה, עוברים שנחשפו PM2.5 בהיעדר או נוכחות של NAC נוגד חמצון הוערכו לנוכחות של מומים בלב (איור 1). כפי שנצפו, EOM מ PM2.5 גרם לעלייה משמעותית טרטוגנזה לב, כגון בצקת קרום הלב, לולאה שונה, וירידה בגודל, לעומת לבבות שטופלו בקרה DMSO. קצב פעימות הלב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות דג זברה הוא מודל בעל חוליות מצוין לחקר הרעילות ההתפתחותית הלבבית של כימיקלים סביבתיים, בשל הגודל הקטן של הלב העובר, קשה להשיג מספיק חלבון לניתוח כתם מערבי. לכן, אנו מציגים שיטה חיסונית רגישה לכימות רמות ביטוי החלבון של סמנים ביולוגיים נזק DNA בלבם של עוברים דג זברה חשוף PM2.5.

במהלך הניתוח, חשוב לשמור על שלמות הלב ללא פגע. מניסיוננו, קל יחסית לבצע את הבידוד ב 72 כ"ס. בנוסף, יש להכניס את הלב לפתרון הקיבעון בהקדם האפשרי לאחר האיסוף. צעד קריטי נוסף הוא ייבוש הדגימות כדי לוודא שהל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספר מענק: 81870239, 81741005, 81972999) ופיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות ההשכלה הגבוהה בג'יאנגסו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
8-OHdG נוגדןסנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"בsc-66036נוגדן ראשוני
איזון אנליטיSartorius, סיןBSA124S
BSASolarbio, בייג'ינג, סיןSW3015לחסימת
DAPIAbcam, ארה"בab104139עבור כתם נגד גרעיני.
DMSOSolarbio, בייג'ינג, סיןD8371
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוס, יפןIX73להדמיית אותות פלואורסצנטיים/
עז נגד ארנב IgG Cy3קרלסבד, ארה"בCW0159נוגדן עז
משני נגד ארנב IgG FITCקרלסבד, ארה"בRS0003נוגדן משני
N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC)אדמס-בטא, שנחאי, סין616-91-1
שייקר אורביטליQILINBEIER, סיןTS-1
ParaformaldehydeSigma, סיןP6148הכינו 4% paraformaldehyde לקיבוע.
פוספט חוצץמלח HyClone, ארה"SH30256.01הכן 0.1% טווין ב- PBS לכביסה.
דגימת PM2.5טיאן-הונג, ווהאן, סיןTH-150Cלדגימת PM2.5 ללא הפרעה של 24 שעות.
מערכת חקלאות ימית במחזור מחדשHaiSheng, שנחאי, סיןדג הזברה נשמר בה.
מחלץ SoxhletZhengQiao, שנחאי, סיןBSXT-02למיצוי רכיבים אורגניים.
סטריאומיקרוסקופניקון, קנדהSMZ645לדיסקציה של לב מעוברי דג זברה.
טריקאין מתאנסולפונאט (MS222)סיגמא, סיןE10521להרדמת עוברי דג זברה
Tween 20Sigma, סיןP1379
& gamma; נוגדן H2AXAbcam, ארה"בab26350נוגדן ראשוני
ב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
  2. Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).
  3. Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
  4. Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
  5. Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
  6. Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
  7. Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
  8. Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
  9. Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
  10. Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
  11. Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
  12. Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46(2014).
  13. Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
  14. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
  15. Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
  16. Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
  17. Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
  18. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).
  19. van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
  20. Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
  21. Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
  22. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  23. Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PM2 5DNA8 OHdGGamma H2AXNAC

מאמרים קשורים