פרוטוקול זה משתמש ב בדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM2.5בלבם הניתח של עוברים דגי זברה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש בחיסון כדי לזהות נזק לדנ"א2.5המושרה בלבבות העוברים של דגי הזברה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
חשיפה חלקיקית עדינה סביבתית (PM2.5)עלולה להוביל לרעילות התפתחותית של הלב, אך המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם ברורים. 8-הידרוקסי-2'deoxygenase (8-OHdG) הוא סמן של נזק DNA חמצוני ו γH2AX הוא סמן רגיש עבור שברי גדיל כפול DNA. במחקר זה, אנו שואפים לזהות PM2.5-המושרה 8-OHdG ו γH2AX שינויים בלב של עוברים דג זברה באמצעות בדיקת אימונופלואורסצנטיות. עוברים דגי זברה טופלו בעניינים אורגניים הניתנים לחילוץ (EOM) מ PM2.5 ב 5 מיקרוגרם / מ"ל בנוכחות או היעדר נוגד חמצון N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC, 0.25 מיקרומטר) ב 2 שעות לאחר ההפריה (hpf). DMSO שימש כפקד רכב. ב 72 כ"ס, לבבות נותחו מעוברים באמצעות מחט מזרק קבוע וחלחל. לאחר שנחסמו, דגימות נבדקו עם נוגדנים ראשוניים נגד 8-OHdG ו γH2AX. לאחר מכן נשטפו הדגימות ודגרו בנוגדנים משניים. התמונות שהתקבלו נצפו תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וכימותו באמצעות ImageJ. התוצאות מראות כי EOM מ PM2.5 משופר באופן משמעותי 8-OHdG ו γH2AX אותות בלב העוברים של דגי זברה. עם זאת, NAC, הפועל כנבלות חמצן תגובתי (ROS), נטרל חלקית את נזק ה- DNA שנגרם על ידי EOM. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אימונופלואורסצנטיות לחקירת תפקידו של נזק לדנ"א ב- PM 2.5 - מומים בלב הנגרמים על ידי PM2.5שניתן להחיל על גילוי שינויים בביטוי חלבון סביבתי המושרה כימי בלבם של עוברים דגי זברה.
מבוא
זיהום אוויר הוא כיום בעיה סביבתית חמורה העומדת בפני העולם. חומר חלקיקי הסביבה בסדר (PM2.5), שהוא אחד האינדיקטורים החשובים ביותר של איכות האוויר, יכול לשאת מספר רב של חומרים מזיקים ולהיכנס למערכת הדם, גרימת נזק חמור לבריאותהאדם 1. מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי חשיפה PM2.5 יכול להוביל לסיכון מוגבר של מומים מולדים בלב (CHDs)2,3. עדויות מניסויים בבעלי חיים הראו גם כי PM2.5 יכול לגרום להתפתחות לב חריגה בעוברי דגי זברה וצאצאים של עכברים, אבל המנגנונים המולקולריים של הרעילות ההתפתחותית הלבבית של PM2.5 עדיין לא ידוע במידה רבה4,<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגי זברה מסוג בר (AB) המשמשים במחקר זה התקבלו ממרכז המשאבים הלאומי לדגי זברה בווהאן, סין. כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן נבדקו ואושרו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה של אוניברסיטת סוכו.
1.2.5 דגימה ומיצוי תרכובות אורגניות
הערה: PM2.5 נאסף באזור עירוני בסוז'ואו, סין, 1-7 באוגוסט 2015, כפי שתואר קודם לכן5.
- אופים מסנני קרום קוורץ 47 מ"מ בכבשן עמעם של 500 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי להסיר את הרכיבים האורגניים.
- מקם מסנן בסמפלר PM2.5 למשך 24 שעות של דגימה ללא הפרעה.
- מוציאים את המסנן ומייבשים למשך 24 שעות בטמפרטורת ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בדיקה חיסונית זו היא שיטה רגישה וספציפית למדידת שינויים בביטוי חלבונים בליבם של עוברים דגי זברה החשופים לכימיקלים סביבתיים.
בניתוח מייצג זה, עוברים שנחשפו PM2.5 בהיעדר או נוכחות של NAC נוגד חמצון הוערכו לנוכחות של מומים בלב (איור 1). כפי שנצפו, EOM מ PM2.5 גרם לעלייה משמעותית טרטוגנזה לב, כגון בצקת קרום הלב, לולאה שונה, וירידה בגודל, לעומת לבבות שטופלו בקרה DMSO. קצב פעימות הלב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות דג זברה הוא מודל בעל חוליות מצוין לחקר הרעילות ההתפתחותית הלבבית של כימיקלים סביבתיים, בשל הגודל הקטן של הלב העובר, קשה להשיג מספיק חלבון לניתוח כתם מערבי. לכן, אנו מציגים שיטה חיסונית רגישה לכימות רמות ביטוי החלבון של סמנים ביולוגיים נזק DNA בלבם של עוברים דג זברה חשוף PM2.5.
במהלך הניתוח, חשוב לשמור על שלמות הלב ללא פגע. מניסיוננו, קל יחסית לבצע את הבידוד ב 72 כ"ס. בנוסף, יש להכניס את הלב לפתרון הקיבעון בהקדם האפשרי לאחר האיסוף. צעד קריטי נוסף הוא ייבוש הדגימות כדי לוודא שהל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספר מענק: 81870239, 81741005, 81972999) ופיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות ההשכלה הגבוהה בג'יאנגסו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 8-OHdG נוגדן | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"ב | sc-66036 | נוגדן ראשוני |
| איזון אנליטי | Sartorius, סין | BSA124S | |
| BSA | Solarbio, בייג'ינג, סין | SW3015 | לחסימת |
| DAPI | Abcam, ארה"ב | ab104139 | עבור כתם נגד גרעיני. |
| DMSO | Solarbio, בייג'ינג, סין | D8371 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | אולימפוס, יפן | IX73 | להדמיית אותות פלואורסצנטיים/ |
| עז נגד ארנב IgG Cy3 | קרלסבד, ארה"ב | CW0159 | נוגדן עז |
| משני נגד ארנב IgG FITC | קרלסבד, ארה"ב | RS0003 | נוגדן משני |
| N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC) | אדמס-בטא, שנחאי, סין | 616-91-1 | |
| שייקר אורביטלי | QILINBEIER, סין | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma, סין | P6148 | הכינו 4% paraformaldehyde לקיבוע. |
| פוספט חוצץ | מלח HyClone, ארה" | SH30256.01 | הכן 0.1% טווין ב- PBS לכביסה. |
| דגימת PM2.5 | טיאן-הונג, ווהאן, סין | TH-150C | לדגימת PM2.5 ללא הפרעה של 24 שעות. |
| מערכת חקלאות ימית במחזור מחדש | HaiSheng, שנחאי, סין | דג הזברה נשמר בה. | |
| מחלץ Soxhlet | ZhengQiao, שנחאי, סין | BSXT-02 | למיצוי רכיבים אורגניים. |
| סטריאומיקרוסקופ | ניקון, קנדה | SMZ645 | לדיסקציה של לב מעוברי דג זברה. |
| טריקאין מתאנסולפונאט (MS222) | סיגמא, סין | E10521 | להרדמת עוברי דג זברה |
| Tween 20 | Sigma, סין | P1379 | |
| & gamma; נוגדן H2AX | Abcam, ארה"ב | ab26350 | נוגדן ראשוני |
מקורות
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C.,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
