מאמר שיטה

הרכבה ותפעול של מכשיר אצוטופלואידי לאספקה משופרת של תרכובות מולקולריות לתאים

DOI:

10.3791/62035

⸱

21 בינואר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Louisville, 2School of Medicine, University of Louisville, 3Department of Biology, University of Louisville

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של מכשיר אצוטופלואידי בעלות נמוכה עבור משלוח מולקולרי מהיר לתאים באמצעות sonoporation המושרה על ידי סוכני ניגוד אולטרסאונד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אספקה תאית יעילה של ביומולקולים נדרשת למגוון רחב של מחקר ביו-רפואי ויישומים טיפוליים מבוססי תאים. sonoporation בתיווך אולטראסאונד היא טכניקה מתפתחת עבור משלוח תאי מהיר של biomolecules. Sonoporation מתרחשת כאשר cavitation של microbubbles מלא גז יוצר נקבוביות חולפות בקרומי התא הסמוכים, המאפשר ספיגה מהירה של biomolecules מהנוזל שמסביב. הטכניקות הנוכחיות עבור in vitro sonoporation של תאים בהשעיה מוגבלים על ידי תפוקה איטית, שונות בתנאי החשיפה אולטרסאונד עבור כל תא, ועלות גבוהה. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מכשיר acoustofluidic בעלות נמוכה פותח אשר משלב מתמר אולטרסאונד במכשיר נוזלים מבוסס PDMS כדי לגרום sonoporation עקבי של תאים כפי שהם זורמים דרך הערוצים בשילוב עם סוכני ניגוד אולטרסאונד. המכשיר מפוברק בטכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות כדי לייצר את השבב הנוזלי מבוסס PDMS. מתמר דיסק פיזו אולטרסאונד מחובר למכשיר ומונע על ידי מיקרו-בקר. ניתן לשלב את ההרכבה בתוך מארז מודפס בתלת-ממד להגנה נוספת. תאים ומיקרו-חלוקים נדחפים דרך המכשיר באמצעות משאבת מזרק או משאבה פרייסטלטית המחוברת לצינורות PVC. משלוח משופר של biomolecules לתאי T אנושיים ותאי סרטן ריאות הוא הודגם עם מערכת אצוטופלואידית זו. בהשוואה לגישות טיפול בתפזורת, מערכת אצוטופלוידית זו מגדילה את התפוקה ומפחיתה את השונות, אשר יכול לשפר את שיטות עיבוד התא עבור יישומי מחקר ביו-רפואי וייצור של טיפולים מבוססי תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלטפורמות ויראליות ולא ויראליות נוצלו כדי לשפר את המסירה המולקולרית לתאים. משלוח ויראלי (transduction) היא טכניקה נפוצה המשמשת 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 מגבלות עם משלוח ויראלי כוללות mutagenesis החדרה פוטנציאלית, יכולת מהונדסת מוגבלת, ריבוי לא רצוי של זיהום1,2. לכן, טכניקות משלוח מולקולרי לא ויראליות נמצאות בפיתוח עבור מגוון רחב של יישומי ביו-רפואה ומחקר. טכניקות נפוצות כוללות מכני, חשמלי, הידרודינמי, או שימוש באנרגיה מבוססת לייזר כדי לשפר את ספיגת הביומולקולים לתאים 3. Electroporation היא פלטפורמת משלוח מולקולרית לא ויראלית נפוצה אשר יש את היכולת לגרום ניקוב חולף בקרום הפלזמה עבור משלוח תאי שלתרכובות מולקולריות 4,5,6,7,8,9. עם זאת, ניקוב חולף של קרום הפלזמה הוא תהליך סטוכסטי וספיגה מולקולרית באמצעות אלקטרופורציה תלויה בדרך כלל דיפוזיה פסיבית על פני נקבוביות הממברנה החולפת4,7,8.

שיטה חלופית היא ניצול של אולטרסאונד עבור משלוח מולקולרי תאי משופר באמצעות cavitation של סוכני ניגוד אולטרסאונד (כלומר, microbubbles מלא גז). cavitation microbubble גורם אפקטים microstreaming במדיה שמסביב אשר יכול לגרום ניקוב חולף של ממברנות פלזמה סמוכות ("sonoporation") המאפשר ספיגה תאית מהירה של biomolecules באמצעות מנגנוני תחבורה פסיביים או פעילים10,11,12. Sonoporation היא טכניקה יעילה עבור משלוח מולקולרי מהיר לתאים, אבל גישה זו דורשת לעתים קרובות ציוד יקר ושיטות טיפול בתפזורת אשר מוגבלים על ידי תפוקה נמוכה יותר ושונות גבוהה יותר בתנאיחשיפה אולטרסאונד 13. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, התקנים acoustofluidic, המאפשרים sonoporation עקבי של תאים בהשעיה, נמצאים כעת בפיתוח.

Acoustofluidics הוא תחום מתרחב המשלב אולטרסאונד וטכנולוגיות microfluidic עבור מגוון רחב של יישומים. גישה זו שימשה בעבר להפרדת חלקיקים על ידי החלת אנרגיית אולטרסאונד רציפה כדי לגרום לגלים אקוסטיים עומדים בתוך הערוצים הנוזליים14,15,16,17. חלקיקים ממוינים לחלקים שונים של המכשיר בהתבסס על מגוון מאפיינים כגון גודל החלקיקים, צפיפות ודחיסה ביחס למדיום16. טכנולוגיות Acoustofluidic נמצאים גם בפיתוח כדי לאפשר אספקה מולקולרית מהירה למגוון סוגי תאים עבור יישומי מחקר וייצור של שירותי תאים18. לאחרונה, הדגמנו משלוח מולקולרי משופר לאריתרוציטים באמצעות מכשיר אצוטופלואידי מבוסס PDMS19. בפלטפורמה האקוסטופולידית, ניתן לתמרן את הדינמיקה של התא והמיקרו-יבלים כדי לגרום לאינטראקציות פיזיות המאפשרות אספקה משופרת של ביומולקולים. היעילות והעקביות של אספקה מולקולרית תאית יכולות להיות מוגברות על ידי אופטימיזציה של המרחק בין תאים ומיקרו-יבלים.

יישום חשוב אחד עבור sonoporation בתיווך אצוטופלואידי כרוך הובלה של biomolecules לתוך תאי T אנושיים ראשוניים. אימונותרפיות המבוססות על העברת תאי T מאמצת, כגון טיפול בתא T קולטן אנטיגן כימרי (CAR T), מתעוררות במהירות לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן ווירוסים כגון HIV20. טיפול CAR T היה יעיל במיוחד בחולי לוקמיה לימפובלסטית חריפה בילדים (ALL), עם שיעורי הפוגה מלאה של 70-90%21. עם זאת, ייצור תאי T לטיפולים אלה תלוי בדרך כלל בהתמרות ויראלית המוגבלת על ידי מוטגנזה פוטנציאלית, זמני עיבוד ארוכים ואתגרים של אספקת ביומולקולות לא גנטיות כגון חלבונים או מולקולות קטנות1. שיטות אספקה מולקולריות בתיווך אצטופולי יכול להתגבר על מגבלות אלה ולשפר את הייצור של טיפולים בתאי T.

יישום חשוב נוסף עבור sonoporation בתיווך אצוטופלואידי כרוך משלוח תאי של תרכובות משמרות, כגון trehalose, אשר להגן על תאים במהלך הקפאה וייבוש. Trehalose מיוצר על ידי כמה אורגניזמים בטבע ומסייע להם לסבול הקפאה וייבוש על ידי הגנה על הממברנות התאיות שלהם22,23. עם זאת, trehalose אינו מיוצר על ידי תאים יונקים והוא אטום קרום התא יונקים. לכן, טכניקות משלוח מולקולרי יעיל, כגון sonoporation, נחוצים על מנת להשיג רמות טרהלוז תאיות מספיק הנדרש כדי להגן על ממברנות תאיות פנימיות. גישה זו נמצאת כעת בפיתוח לשימור יבש של סוגי תאים שונים.

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של ההרכבה וההפעלה של מערכת אקוסטופלואידית בעלות נמוכה יחסית המונעת על ידי מיקרו-בקר. סוכני ניגודיות אולטראסאונד מנוצלים כדי לגרום sonoporation בתוך הערוצים הנוזליים ולאפשר משלוח מולקולרי מהיר לסוגי תאים שונים, כולל תאי T ותאים סרטניים. מערכת אצוטופלוידית זו יכולה לשמש עבור מגוון יישומי מחקר, עשוי גם להיות שימושי כמערכת אב טיפוס להערכת שיטות sonoporation עבור תהליכי ייצור טיפול בתאים משופרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרומות דם שלמות נאספו מתורמים בריאים בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית באוניברסיטת לואיוויל.

1. ייצור של מכשיר אצוטופלואידי

  1. להשיג מסכת פוטו עם עיצוב ספירלה קונצנטרי המכיל ערוצים עם קוטר של 500 מיקרומטר. קובץ CAD מסופק בקבצים המשלימים כדוגמה. ניתן להזמין מסכת צילום מותאמת אישית מספק מסחרי או בדוגמת תבנית באמצעות כותב מסיכות.
  2. הכן תבנית של העיצוב הספירלי הקונצנטרי על רקיק סיליקון מצופה פוטוארסיסט בטכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות.
    1. יש להוסיף כ-2 כפות (כ-30 מ"ל) של SU-8 2100 לופל סיליקון 100 מ"מ.
    2. ספין-מצופה את הוופל על ספינר במהירות של 150 סל"ד עבור 30 s כדי לפזר את photoresist, ולאחר מכן להגדיל את המהירות ל 1,200 סל"ד עבור 60 s כדי להניב עובי של 200 מיקרומטר.
    3. רפאו את הוופל מצופה הפוטורסיסט בתנור ואקום פולימיד עם רמפה של 30 דקות למעלה ו-30 דקות התעכבו ב-115 מעלות צלזיוס, ואז רמפה במשך 30 דקות.
    4. חשוף את הוופל מצופה הצילום במשך 130 s באמצעות מיישר מסיכה עם מסכת הצילום מהשלב 1.1.
    5. אופים את הוופל לאחר החשיפה לאחר אותו תהליך המתואר בשלב 1.2.3.
    6. לפתח את photoresist בפתרון מפתח SU-8 במשך כ 8 דקות.
      אזהרה: השתמש בתמיסת מפתח רק במכסה אדים כימי מאוורר היטב.
  3. סילאניזציה התבנית כדי להפוך את פני השטח הידרופובי יותר. מניחים את הוופל מצופה הפוטורסיסט לתוך חיטוי ומוסיפים טיפה של 20 μL של כלורוסילן (C8H4Cl3F13Si). יש למרוח ואקום על התא למשך 30, ואז לאטום את התא ולהשאיר למשך הלילה.
    זהירות: כלורוסילאן מסוכן מאוד ודליק. חשיפה גורמת לכוויות קשות ולנזק לעיניים.
  4. שלבו 54 גרם של בסיס פולידימתסילוקסן (PDMS) ו-6 גרם של חומר ריפוי בכוס וערבבו במרץ וביסודיות עם מרית למשך דקה אחת לפחות.
  5. מניחים את הכוס המכילה את פתרון PDMS לתוך חיטוי במשך כ -30 דקות או עד בועות אוויר שריד מוסרים מהפתרון.
  6. מניחים רקיק מצופה פוטוארסיסט עם התבניות הפונות כלפי מעלה בצלחת פטרי 150 מ"מ.
  7. יוצקים את תמסת PDMS על התבנית בתוך צלחת פטרי 150 מ"מ.
  8. במידת הצורך, מניחים את צלחת הפטרי 150 מ"מ בתוך חיטוי ולהחיל ואקום עד בועות אוויר שריד להיעלם.
  9. מעבירים את צלחת הפטרי 150 מ"מ לתנור מעבדה ואופים במשך 2 שעות ב 60 °C (60 °F) כדי לרפא את PDMS.
  10. לאחר הריפוי, יש להסיר בזהירות את ה-PDMS מצלחת הפטרי על ידי חיתוך בשולי הוופל באמצעות סכין גילוח.
  11. חותכים כל מכשיר בודד באמצעות סכין או סכין גילוח.
  12. ניקוב חורים דרך יציאות המפרצון והשקע של כל מכשיר באמצעות אגרוף ביופסיה 2.5 מ"מ.
  13. מקם כל התקן PDMS באשר פלזמה עם ערוצים חשופים (עם הפנים כלפי מעלה). החל טיפול פלזמה חמצן (100 W עבור 45 s, 500 mbar O2) ולאחר מכן מיד למקם כל מכשיר PDMS על שקופית מיקרוסקופ זכוכית סודה ליים נקי (75 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ) עם ערוצים מול פני הזכוכית.
  14. אפשרו למכשירים להתחבר למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  15. יש למרוח בעדינות סיליקון על פני השטח של מתמר פיזו בקוטר 1 ס"מ בעובי של ~ 1-2 מ"מ, ולאחר מכן ליישר בזהירות את המתמר עם הספירלה הקונצנטרית ולחץ עליו בעדינות על החלק התחתון של שקופית מיקרוסקופ הזכוכית (הצד הנגדי מהתקן PDMS).

2. הרכבה ותפעול של מערכת אצוטופלוידית

  1. חבר מיקרו-בקר למחשב באמצעות כבל USB A עד B. מחוון LED בהספק ירוק (שכותרתו PWR) אמור להאיר.
  2. השתמש בתוכנית המשויכת במחשב כדי להעלות תוכנית היוצרת אות 8 MHz. תוכנית לדוגמה מסופקת ב- Files המשלים . לאחר העלאת התוכנית, הוא יאוחסן בזיכרון מיקרו מעבד ולא יהיה צורך להעלות אותו שוב.
  3. הלחמה חוט 1"22G עד סוף כל חוט על מתמר PZT.
  4. חבר את חוט המסוף השלילי (השחור) של מתמר PZT לפין GND באמצעות החוט המולחם.
  5. חבר את חוט המסוף החיובי (האדום) של מתמר PZT לפין הפלט (#9 בתוכנית הדוגמה שסופקה) באמצעות החוט המולחם.
  6. לחלופין, התקן את ההתקן האצוטופלואידי ואת המיקרו-בקר במארז מודפס בתלת-ממד. קבצי CAD מסופקים ב-Splemental Files כדוגמאות. חוטים נוספים יכולים להיות מחוברים לפינים מיקרו-בקר אחרים כדי לשלוט מחוון LED חיצוני וכפתור הפעלה / כיבוי אם תרצה.
  7. חותכים קטעים בגודל 3-6 אינץ' של צינורות פלסטיק רכים מסוג Tygon PVC (מזהה בגודל 1/16 אינץ', מנת יתר של 1/8 אינץ') ודוחפים את הצינורות לתוך יציאות הכניסה והשקע. ייתכן שיהיה צורך לסובב את הצינורות תוך הפעלת לחץ עד שהוא מתאים לפתיחה. לחלופין, לאחר הכנסת הצינורות לכל יציאה, ניתן להחיל דבק בצומת כדי לחבר את ה- PDMS והצינורות יחד.
  8. להרכיב את המאגר microfluidic על פי הוראות היצרן.
  9. חותכים קטע בגודל 3-6 אינץ' של צינורות פלסטיק רכים מסוג Tygon PVC (מזהה בגודל 1/16 אינץ', מנת יתר של 1/8 אינץ') ודוחפים את הצינורות מעל צינורות הזיהוי בגודל 1/32 אינץ' מצינורות תפוקת המאגר המיקרופלואידי. לחלופין, לעטוף את הצומת עם סרט פרפין כדי למנוע דליפה.
  10. מלא מזרק בגודל 60 מ"ל באוויר הסביבה (אופציונלי, סנן את האוויר עם מסנן 0.2 מיקרומטר) וחבר אותו לצינורות PVC מסוג טייגון (מזהה 1/16 אינץ', מנת יתר של 1/8 אינץ') בצד המאגר המיקרופלואידי.
  11. הגדר את משאבת המזרק לקצב של 200 מ"ל / שעה כדי לדחוף את פתרונות סוכן ניגודיות התא / אולטרסאונד באמצעות המכשיר acoustofluidic בקצב זרימה נפחית של 50 מ"ל / שעה ולאסוף את הדגימות מן הפלט של המכשיר acoustofluidic לתוך צינור צנטריפוגה 50mL. לחלופינית, יש לשטוף את הערוץ לפני הטיפול האקוסטופולידי עם 15 מ"ל של 70% תמיסת אתנול כדי להגביר את הסטריליות של תעלות נוזלים. בנוסף, ערוצים ניתן לשטוף עם 15 מ"ל של מים deionized כדי להסיר אתנול שיורית במכשיר לפני שאיבת תאים דרך המערכת.

3. הכנת סוכני ניגודיות אולטרסאונד

הערה: סוכני ניגודיות אולטראסאונד לשפר באופן משמעותי את המסירה האצוטופלואידית של תרכובות מולקולריות על ידי הגדלה חולפת של רמבנות הסלולר הסמוכות19. משלוח מולקולרי מוגבל מאוד ללא סוכני ניגוד אולטרסאונד במערכת זו.

  1. הכן פתרון פוספוליפיד ב 20mL בווינאל נוצץ המכיל את התערובת הבאה:
    1. הוסיפו 25 מ"ג של 1,2-דיסטרויל-סן-גליצרי-3-פוספוזולין (DSPC).
    2. הוסיפו 11.6 מ"ג של 1,2-דיסטרויל-סן-גליצרי-3-אתילפוסכולין (DSEPC).
    3. הוסיפו 0.26 מ"ג של 1,2-דיסטרויל-סן-גליצרי-3-פוספוגליצרל (DSPG).
    4. יש להוסיף 0.88 מ"ג פוליאוקסיאתילן40 סטארט.
  2. מוסיפים כלורופורם עד שכל הפוספוליפידים מומסים (למשל, 3 מ"ל של כלורופורם).
  3. לאדות כלורופורם בייבוש במשך 48 שעות כדי ליצור סרט שומנים יבש (אידוי תחת ארגון או עם מאייד סיבובי יכול לשמש כדי להאיץ את תהליך הייבוש).
  4. Rehydrate סרט השומנים עם 10 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית חוצץ פוספט (PBS).
  5. Sonicate פתרון השומנים במשך 3 דקות ב 40% משרעת כדי ליצור פתרון מיצלר קטי.
  6. לאחר sonication לאחסן את פתרון פוספוליפיד ב 2-6 °C (6 °F) עד חודש אחד.
  7. כדי להכין סוכני ניגודיות אולטרסאונד, להוסיף 200 μL של פתרון מיסלר קטי ו 600 μL של PBS סטרילי בקבוקון מחיצת זכוכית 2 מ"ל.
  8. אוטמים את הקרבון על ידי קיצור הכובע.
  9. השתמש מחט 1.5 " 20G כדי למלא את שטח ראש הוויאלי עם גז decafluorobutane עבור 30 s.
  10. Amalgamate את הנקיל עבור 45 s ב 4,350 סל"ד כדי ליצור סוכני ניגודיות אולטרסאונד מלא גז perfluorobutane.
  11. הוסף 25 μL של פתרון סוכן ניגודיות אולטרסאונד לכל 1 מ"ל של פתרון התא מיד לפני שאיבת סוכן ניגודיות משולבת / תערובת תא באמצעות המכשיר acoustofluidic. פתרון התא יכול להשתנות כרצונו על ידי המשתמש, אבל במחקרים שלנו הפתרון התא כלל תאי T ראשוניים בשלב 4.21, ותאי סרטן ריאות A549 בשלב 5.7, בהתאמה.

4. הכנת Tcells עיקרי

  1. לבודד תאים מונונוקלאריים בדם היקפי (PBMCs) מפתרונות דם שלמים ולאחסן ב -150 °C (50 °F). הפרדת הדרגתית בצפיפות המכילה מצע משמשת בדרך כלל להפרדת מחשבים אישיים מדם שלם24,25,26.
  2. להפשיר את הנקניקיון הקפוא באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  3. לדלל PBMCs מופשר 1: 10 עם PBS בצינור צנטריפוגה 15mL. כל בקבוקון 1mL מכיל כ -10 מיליון PBMCs.
  4. מחשבי PBMCs מדוללים צנטריפוגה ב 580 x גרם במשך 11 דקות ב 4 °C (70 °F).
  5. שאף את supernatant ולהוסיף 13 מ"ל של MACs פועל חוצץ כדי resuspend התאים.
  6. ספר את מחשבי ה-PBMCs עם מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר אוטומטי.
  7. צנטריפוגות PBMCs שוב ב 580 x g במשך 11 דקות ב 4 °C (70 °F) ושאף את supernatant.
  8. הוסף 40 μL של מאגר ריצה צונן לכל 10 מיליון מחשבים אישיים.
  9. כדי לבודד תאי T, להוסיף 10 μL של קוקטייל נוגדן ביוטין תא Pan לכל 10 מיליון PBMCs.
  10. בעדינות להסעיר את PBMCs ולאחסן את הפתרון ב 4 °C (5 דקות לכל 10 מיליון תאים.
  11. הוסף 30 μL של חוצץ פועל ו 20 μL של קוקטייל חיידקים תא T פאן לכל 10 מיליון PBMCs.
  12. מערבבים היטב את מחשבי ה-PBMCs והחרוזים ודגר במשך 15 דקות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס.
  13. הוסף מאגר פועל כדי להגיע לאמצעי אחסון כולל של 500 μL.
  14. הפרד תאי T ראשיים עם מכשיר מיון מגנטי זמין מסחרית באמצעות ההגדרה "מרוקן הפרדה" בהתאם לפרוטוקול היצרן. שלב זה אמור להניב בין 5-10 מיליון תאי T לאחר מיון תאים.
  15. ספירת תאי T באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר.
  16. לדלל תאי T ב 10 מ"ל של PBS סטרילי וצנטריפוגה ב 580 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F) כדי כדורי התאים.
  17. שאפו את תאי ה-T הסופר-טבעיים והמתנדפים מחדש ב-1 מ"ל של PBS.
  18. ספירת תאי T באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר ו aliquot 1 מיליון / מ"ל לניסויים.
  19. הכן פתרון פלואורסצ'ין 1 מ"ג /מ"ל ב- PBS.
  20. הוסף 100 μL של פתרון פלואורסצאין 1 מ"ג / מ"ל לכל 1 מ"ל של פתרון תא T (ריכוז פלואורסצ'ין סופי = 100 מיקרוגרם / מ"ל) מיד לפני העיבוד.
  21. הוסף 25 μL של פתרון סוכן ניגודיות אולטרסאונד כפי שתואר בעבר בשלב 3.11.
  22. תהליך aliquots 1mL של תאים באמצעות המערכת האצוטופלוידית (ראה שלבים 2.10-2.11). שלב זה משפר את המסירה של פלואורסצ'ין לתאי T ראשוניים.
  23. מיד לאחר הטיפול, לשטוף תאים שלוש פעמים באמצעות צנטריפוגה ב 580 x גרם במשך 10 דקות עם 500 μL של PBS כדי להסיר פלואורסצין חוץ תאי. תאים צריכים להיות שטף בתוך 10 דקות לאחר הוספת פתרון פלואורסצ'ין.
  24. לאחר שלב הכביסה הסופי, resuspend תאים ב 250 μL של PBS ולמדוד פלואורסצנטיות על cytometer זרימה.

5. הכנת תאי סרטן ריאות A549

  1. תרבות A549 (אפיתל מבסאלי אנושי אדנו-קרצינומי) בתאים במדיה DMEM מלאה (סרום בקר עוברי 10%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין) ב-37 °C (5% CO2 בבקבוק תרבית רקמות שטוחה.
  2. קציר תאי A549 כאשר הם מגיעים 70-90% השפעה. שאפו מדיה מהבקבוק ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS כדי להסיר חלבונים בסרום.
  3. הוסף טריפסין (0.25%) EDTA לבקבוקון ודגרה במשך 5 דקות ב 37 °C (57 °F). טריפסין הוא אנזים עיכול שגורם לתאים להתנתק מפני השטח התחתונים של בקבוקון תרבית הרקמה.
  4. העבר פתרון טריפסין לצינור צנטריפוגה 15mL ולנטרל אותו על ידי הוספת מדיה DMEM מלאה ביחס של 1:3.
  5. גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
  6. שאפו את supernatant ו resuspend הכדור בריכוז של 100,000 /mL בתמיסת PBS המכיל 200 mM trehalose ב 15 מ"ל בפלה חרוטית 15 מ"ל.
  7. הוסף 25 μL של פתרון סוכן ניגודיות אולטרסאונד כפי שתואר בעבר בשלב 3.11.
  8. תהליך aliquots 1mL של תאים באמצעות המערכת האצוטופלוידית (ראה שלבים 2.10-2.11). שלב זה משפר את המסירה של trehalose לתוך תאי סרטן ריאות A549.
  9. מיד לאחר הטיפול, לשטוף תאים שלוש פעמים באמצעות צנטריפוגה עם 500 μL של PBS כדי להסיר trehalose חוץ תאי. תאים יש לשטוף בתוך 10 דקות לאחר הוספת פתרון trehalose.
  10. לאחר שלב הכביסה הסופי, respend תאים ב 100 μL של PBS.
  11. הוסף 11 μL של פתרון Triton X-100 1% לתאי ליזה ולשחרר trehalose תאי.
  12. מערבולת ל-15 מעלות, ואז דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  13. מערבולת שוב עבור 15 s, ולאחר מכן למדוד ריכוז trehalose באמצעות בדיקת trehalose זמין מסחרית בעקבות המלצת היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמונה של המערכת האקוסטופולידית המורכבת בתוך מארז מודפס בתלת-ממד מוצגת באיור 1. פרוטוקול זה מייצר מערכת acoustofluidic שניתן להשתמש בה כדי לשפר את המסירה המולקולרית התאית בקווי תאים מרובים באמצעות סוכני ניגודיות אולטרסאונד.

איור 2   מדגים משלוח תאי משופר של תרכובת פלואורסצנטית, פלואורסצ'ין, לתאי T אנושיים ראשוניים עם טיפול אצוטופלואידי בהשוואה לקבוצת ביקורת לא מטופלת (p<0.05, n = 3/group). תאי T הושעו בריכו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של מערכת אצוטופלוידית בעלות נמוכה אשר משפרת את המסירה התאית של biomolecules עבור יישומי מחקר. ישנם מספר גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת הרכבה והפעלה של מערכת זו. המכשיר acoustofluidic הוא מפוברק PDMS, שהוא חומר תואם ביולוגית שניתן לעצב בקלות עם מידות ערוץעקביות 27. ערוצי המכשיר ניתן לשטוף עם 15 מ"ל של 70% פתרון אתנול לפני עיבוד אצוטופלואידי על מנת להגביר את הסטריליות בעת עבודה עם תאים בתרבית. לאחר ניקוי אתנול, 15 מ"ל של מים deionized יכול לשמש לשטוף את המכשיר כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברים שותפים MAM ו JAK להחזיק בעלות DesiCorp אשר עשוי להפיק תועלת כספית ממוצרים הקשורים למחקר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה במימון הקרן הלאומית למדע (#1827521, #1827521, #1450370) ומכוני הבריאות הלאומיים (U01HL127518). שירותי פוטוליתוגרפיה ניתנו על ידי המרכז הטכנולוגי מיקרו / ננו של אוניברסיטת לואיוויל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ייצור של מכשיר אקוסטופלואידי
DOW SYLGARD 184 סיליקון אנקפסולנט שקוף 0.5 ק"ג ערכתדבקי אלסוורת'4019862 (מק"ט)https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2.5 מ"מ)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית69039-25
מאגר מיקרופלואידיקה לצינור פלקון 15 מ"ל - S (2/4 יציאה)דרווין מיקרופלואידיקסLVF-KPT-S-2 (מק"ט)https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
שקופית מיקרוסקופVWR16004-430https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
טריכלורוסילןג'לסט105732-02-3 (מס' קאס)כלורוסילן הוא מאוד דליק ודליק. חשיפה גורמת לכוויות קשות ולנזק לעיניים.
צינורות פלסטיק רכים של Tygon PVC (1/16 אינץ' ID, 1/8 אינץ' OD)McMaster-Carr5233K51 (חלק #)
https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/<חזק>הרכבה של מערכת אקוסטופלואידית
Arduino UnoArduino7630049200050 (ברקוד)https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
<הכנה חזקה>הכנת חומרי ניגוד אולטרסאונד
1,2-דיסטארויל-sn-גליצרו-3-אתילפוספוכולין (DSEPC)אוונטי ליפידים890703P-25 מ"ג (מק"ט)https://avantilipids.com/product/890703
1,2-דיסטארויל-sn-גליצרו-3-פוספוכולין (DSPC)אוונטי ליפידים850365P-25 מ"ג (מק"ט)https://avantilipids.com/product/850365
1,2- דיסטארויל-SN-גליצרו-3-פוספוגליצרול (DSPG)אוונטי ליפידים840465P-25 מ"ג (מק"ט)https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (גז דקפלואורובוטאט)FlouroMed355-25-9 (מס' Cas)http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 ממזגים COXOhttps://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
פוליאוקסיאתילן 40 סטארט סיגמא-אולדריץ'P3440-250G (מק"ט)https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid=
Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj
Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS
vID64X-1KbO3LUKGjVUwb
PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 SonicatorQsonicaQ125-110 (Ref.)https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
<חזק>הכנת תאי T Primarty
autoMACs הפועליםMiltenyi Biotec130-091-221 (מס' הזמנה)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
ערכת בידוד תאי Pan T, אנושית (קוקטייל נוגדנים לביוטין Pan T Cell & קוקטייל Pan T-Cell MicroBead) Miltenyi Biotec130-096-535 (מס' הזמנה)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
סדרן תאים מגנטיים (מפריד autoMACS Pro)Miltenyi Biotec130-092-545 (מס' הזמנה)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
<הכנה חזקה > של תאי סרטן ריאה A549
ערכת בדיקת טרהלוז MegazymeK-TREH (Cat. לא.)https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
טריפן כחול (0.4% בתמיסה מימית מוכנה לשימוש, סטרילית)VWR97063-702 (Cat. לא.)https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
  2. Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
  3. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27(2012).
  4. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
  5. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
  6. Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
  7. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
  8. Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
  9. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315(2015).
  10. Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
  11. Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
  12. Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
  13. Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
  14. Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
  15. Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
  16. Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
  17. Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861(2016).
  18. Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
  19. Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114(2020).
  20. Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361(2020).
  21. Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
  22. Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
  23. Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198(2017).
  24. Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
  25. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  26. Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
  27. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  28. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  29. Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  30. Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
  31. Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
  32. Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
  33. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  34. Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDMSTMicrocontroller

מאמרים קשורים