בידוד והדמיה חיה, אזורי קוצב לב שלמים של אגן כליות העכבר על ידי חלוקת ויברטום

Nathan Grainger; Kenton M. Sanders; Bernard T. Drumm

doi:10.3791/62040

מאמר שיטה

בידוד והדמיה חיה, אזורי קוצב לב שלמים של אגן כליות העכבר על ידי חלוקת ויברטום

DOI:

10.3791/62040

⸱

30 באפריל 2021

Nathan Grainger¹^,² , Kenton M. Sanders¹ , Bernard T. Drumm¹^,³

¹Department of Physiology & Cell Biology, University of Nevada, Reno School of Medicine, ²Department of Physiology & Membrane Biology, University of California School of Medicine, ³Department of Life & Health Sciences, Dundalk Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא לבודד אזורי קוצב לב שלמים של אגן כליות העכבר באמצעות חלוקת רטט. לאחר מכן ניתן להשתמש במקטעים אלה בהדמיה של מקום Ca²⁺ כדי לפרט תכונות חולפות Ca²⁺ של תאי קוצב לב ותאים ביניים אחרים בפרוסות ויברטום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אגן הכליות (RP) הוא מבנה שרירים חלק בצורת משפך המאפשר הובלת שתן תקינה מהכליה לשופך על ידי התכווצויות רגילות והנעה. התכווצויות RP רגילות מסתמכות על פעילות קוצב לב, שמקורה באזור הפרוקסימלי ביותר של ה- RP בצומת האגן-כליות (PKJ). בשל הקושי לגשת לשימור הכנות שלמות של PKJ, רוב החקירות על קצב RP התמקדו אלקטרופיזיולוגיה של תאים בודדים וניסויי הדמיה Ca²⁺ . למרות גילויים חשובים על RP קצב יצא מעבודה כזו, ניסויים אלה יש כמה מגבלות מהותיות, כולל חוסר היכולת לקבוע במדויק את הזהות התאית בהשעיות מעורבות וחוסר הדמיה במקום של פעילות קוצב לב RP. גורמים אלה הביאו להבנה מוגבלת של המנגנונים העומדים בבסיס התכווצויות RP קצביות רגילות. במאמר זה, פרוטוקול מתואר להכין מקטעים שלמים של PKJ העכבר באמצעות טכניקת חתך ויברטום. על ידי שילוב גישה זו עם עכברים המבטאים כתבים ספציפיים לתא ואינדיקטורים Ca²⁺ מקודדים גנטית, החוקרים עשויים להיות מסוגלים ללמוד בצורה מדויקת יותר את סוגי התאים והמנגנונים הספציפיים האחראים על התכווצויות RP פרייסטלטיות החיוניות להובלת שתן תקינה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אגן הכליות (RP) הוא מבנה שרירים חלק בצורת משפך המעביר שתן מהכליה לשופך. ה- RP מעביר שתן על ידי יצירת התכווצויות קצביות קבועות (פריסטלזיס)¹^,²^,³^,⁴^,⁵, אשר דוחף בולוס של שתן מהכליה דיסט לשופכן ובסופו של דבר לשלפוחית השתן, שם הוא מאוחסן עד מיקרופון מתרחש⁶^,⁷. אובדן פעילות סדירה זו יש השלכות חמורות, כולל הידרונפרוזיס ואי ספיקת כליות^1,³^,⁸; לפיכך, יש צורך קריטי ללמוד את המנגנונים שבביד התכווצויות RP קבועות וקצביות. הצירים הנאיסטרליים מקורם באזור הפרוקסימלי ביותר של RP-in צומת האגן-כליות (PKJ)⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵ (איור 1A-C) ומתפשטים בצורה דיסטית כדי לדחוף שתן מהפפילה ל- RP ( איור1B). פעילות קוצב לב חשמלית נרשמת PKJ כמו depolarizations חולף ספונטני¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, אשר נחשבים לנבוע מתאי קוצב לב מיוחדים. תאי קוצב לב אלה, שנקראו בעבר תאי שריר חלקים לא טיפוסיים (ASMCs), נחשבים כדי ליצור או לתאם פעילות קוצב לב ולהניע את הצירים של תאי שריר חלקים "טיפוסיים" (SMCs)^9,¹⁰^,¹¹^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³.

ASMCs הם הנפוצים ביותר ב- RP הפרוקסימלי, ב- PKJ (איור 1A-C), שם התכווצויות פרייסטליות ופעילות קוצב לב חשמלית מקורן⁵^,⁷^,⁸^,⁹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹ ^,²². מחקר שפורסם לאחרונה על ידי קבוצה זו זיהה קולטן-אלפא גורם גדילה נגזר טסיות דם (PDGFRα), בשילוב עם שרשרת כבדה שריר חלקה (smMHC), כסמן ביולוגי ייחודי עבור תאים ביניים אלה (ICs)²⁴, ממצא כי אומת על ידי קבוצות אחרות²⁵. בהתבסס על המורפולוגיה שלהם ודפוס ביטוי החלבון, תאים אלה נקראו PDGFRα⁺ IC type 1 (PIC1)²⁴^,²⁶. PIC1s מתגוררים בשכבת השריר של PKJ שבו הם מציגים תדר גבוה, קצר משך Ca^{2 +} ארעי, חשב שבבסיס הדור של פוטנציאל קוצב לב²⁴. עם זאת, סוגי תאים אחרים קיימים ב- PKJ, כולל PDGFRα⁺ ICs שאינם smMHC בשכבה ההרפתקנית. דיווחים קודמים הראו כי ICs שאינם smMHC עשויים להשתתף ברגולציה של פעילות קוצב לב¹⁹. עם זאת, מחקר נוסף של קרנות ICs שאינן smMHC מופרע על ידי הבחנה לקויה במהלך Ca^{2 +} מחקרי הדמיה. בדרך כלל, סוגי תאים הטרוגניים בתוך תכשירי RP נטענים ללא הבחנה עם Ca^{2 +}- צבעים רגישים (למשל, Fluo-4). כדי להתגבר על אתגרים אלה וללמוד מגוון סוגי תאים ב- RP, ניתן להשתמש באינדיקטורים Ca²⁺ מקודדים גנטית (GECIs) כדי לבטא באופן סלקטיבי פלואורופורים רגישים Ca^{2 +}בסוגי תאים של עניין.

רוב המחקרים המבהרים Ca^{2 +} תכונות חולפות PIC1s / ASMCs הושגו על ידי הדמיה תכשירי רקמת RP שטוח יריעה^19,²¹^,²⁷. כמו PIC1s הם סוג התא היחיד ב- PKJ לבטא smMHC, ביטוי מותנה של GECI, GCaMP, ב smMHC⁺ תאים מתאים ללמוד PIC1s בתצורה זו. עם זאת, כמו PIC1s ו PIC2s שניהם מבטאים PDGFRα, ביטוי מותנה של וריאנטים GCaMP ב PDGFRα⁺ תאים לאסור על הבחנת תאים בתכשירים שטוחים. כדי לעקוף בעיה זו, נעשה שימוש בגישת חתך ויברטומה כדי להבחין PIC1s ו PIC2s על פני קיר הרקמה PKJ²⁴. כדי לחשוף אוכלוסיות תאיות נפרדות אלה, RP היה חתך קורונאלי, מה שמאפשר לזהות PIC2s ב adventitia ו PIC1s בקיר השריר מבוסס על תיוג אימונוהיסטוכימי ידוע דפוסי ביטוי GECI. כתוצאה מגישת הדמיה חדשנית זו של PKJ, נמצאו PIC1s ו- PIC2s להציג תכונות איתות ייחודיות של Ca^{2 +} ²⁴. יתר על כן, על ידי בידוד החלקים הפרוקסימליים ביותר של אזור PKJ (איור 2),אזור קוצב הלב של RP נשמר באופן שלא הושג בעבר. כאן, פרוטוקול מתואר כדי להראות כיצד לבודד תכשירי PKJ מכליות העכבר באמצעות חתך ויברטום, כיצד להגדיר את ההכנות האלה לניסויי הדמיה Ca²⁺ וכיצד להבחין בין סוגי התאים השונים על פני קיר PKJ.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל העכברים המשמשים והפרוטוקולים המתוארים במחקר זה היו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, ולוועדה המוסדית לשימוש בבעלי חיים ולטיפול באוניברסיטת נבאדה, רינו, NV. ניסויים ושימוש בבעלי חיים גם תאמו את העקרונות והתקנות כפי שתואר על ידי Grundy²⁸.

1. צור עכברי PDGFRα-GCaMP6f ו- SMCGCaMP3

קרוס GCaMP6f^lox/+ עכברים (B6; 129S-GT(ROSA)26Sor^{tm95.1 (CAG-GCaMP6f)Hze}/J) עם^עכברי PDGFRα Cre (C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J) כדי ליצור PDGFRα-GCaMP6f עכברים.
עכברי צלב GCaMP3^לקס/+ (B6.129S-GT(ROSA)26Sor^{tm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J) עם עכברי SMHC^CreERT2 זכרים (B6. FVB-Tg (Myh11-cre/ER^T2)1Soff/J) כדי ליצור עכברי SMC-GCaMP3.
הערה: רק עכברים זכרים של הצלב (GCaMP3^{lox /+} עכברים ועכברי smMHC^CreERT2) יכולים לשמש כביטוי Cre מונע מכרומוזום Y. עכברי smMHC^CreERT2 יכולים גם לחצות עם עכברי GCaMP6f^lox/+לקבלת יחס אות לרעש משופר של Ca²⁺ ומאפיינים זמניים מהירים יותר של Ca²⁺ אות.

2. להכין ולהזריק עכברים מהונדסים עם טמוקסיפן כדי לגרום ביטוי מותנה של GCaMP

הפעל רקומבינאז Cre לא ניתן לתמינה עבור ביטוי GCaMP ספציפי לתא בסוגי תאים ספציפיים, כפי שתואר בעבר²⁹.

3. הכנת פתרונות

הכן 1 ליטר של פתרון קרבס-רינגר ביקרבונט (KRB) המכיל 120.35 מ"מ NaCl, 5.9 מ"מ KCl, 15.5 מ"מ NaHCO₃, 1.2 מ"מ_{Na 2}HPO 4,1.2 מ"מ MgCl₂, 11.5 מ"מ גלוקוז, ו 2.5 מ"מ CaCl₂. ביום השימוש, לשמור על פתרון KRB על קרח.
הערה: KRB יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (7 °F) עד שבוע אחד ויש לבעבע מראש עם תערובת של 97% O₂ ו 3% CO₂ לפחות 10 דקות לפני השימוש.

4. הכינו מנות הדמיה ומיקרוסקופ מצופות אלסטומר מצופות סיליקון

מערבבים רכיבי אלסטומר סיליקון בהתאם להוראות היצרן. מלאו צלחת פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ וצלחת פטרי 60 מ"מ x 15 מ"מ כרבע מלא אלסטומר סיליקון נוזלי לניסויים וניתח הדמיה, בהתאמה. פולימר אלסטומר סיליקון ב 37 °C (5 °F) במשך יום אחד לפני השימוש.
הערה: כדי לשפר את הניגודיות של מקטעי כליות דקות, יש למרוח עיגול נייר שחור וקטן על בסיס צלחת הפטרי ההדמיה לפני מילוי עם אלסטומר סיליקון.

5. ניתוח כליות

יש להרדמה עכברים על ידי שאיפת איזופלוראן של 3-4% במכסה המנוע המאוורר. לאשר את האינדוקציה של הרדמה עמוקה על ידי אובדן של בוהן ו /או רפלקס צביטת זנב, ולאחר מכן להרדים את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם.
יש למרוח 70% אתנול על החזה כדי לעמעם את הפרווה. באמצעות מספריים חיצוניים, פתחו את חלל הבטן באמצעות חתכוך אורך, עם להבי מספריים בזווית הרחק מהחיה כדי למנוע נזק לאיברים הפנימיים.
באמצעות מלקחיים פנימיים של רקמות ומספריים פנימיים, צובטים את המעיים ומרימים אותם מקיר הבטן. תוך הרמת המעיים, לחתוך את החלק התחתון של המעיים חופשי מהגוף בתריסריון הפרוקסימלי ואת המעי הגס דיסטלי כדי לקבל גישה למרחב retroperitoneal המכיל את הכליות.
ברגע שהכליות נחשפות, לחלץ אותם בנפרד. לצבוט בעדינות ולהרים את הקצה הדיסטלי של השופך (~ 4 מ"מ מן הכליה) עם מלקחיים רקמה. באמצעות מספריים ביתור, לחתוך מתחת השופך צבט לכיוון הכליה. ממשיכים לחתוך מתחת לכליה עד שהיא משתחררת מרקמת החיבור שמסביב.
הערה: כדי למקסם את שלמות הרקמה ואת עקביות חיתוך במהלך חתך ויברטום, הכליה חייבת להיות שלמה ככל האפשר. כדי להבטיח זאת, הימנע צביטה או חיתוך של הכליה עם מלקחיים ומספריים ביתחות.
מניחים את הכליה עם השופך המצורף בתמיסת KRB קרה כקרח. חזור על שלבים 5.4 ו 5.5 עם הכליה contralateral. לשמור על הכליות בתמיסת KRB על קרח.
הערה: המשך מיד לסעיף הבא של הפרוטוקול כדי לשמר את הכדאיות של רקמת PKJ. בגלל מיקומו האנטומי עמוק בפרנצ'ימה של הכליות, PKJ נשלל ממגע עם פתרון KRB.

6. הכן את הכליה לקטע ויברטום

מעבירים את הכליה לצלחת ניתוח מצופה אלסטומר סיליקון (60 מ"מ x 15 מ"מ), וממלאים אותה בתמיסת KRB קרה כקרח עד שהכליה שקועה לחלוטין.
תחת מיקרוסקופ ניתוח, לעגן את הכליה לבסיס של המנה על ידי החדרת סיכות minutien לתוך השופך הפרוקסימלי ודרך כמוסת הכליה דקה קהורית או רקמת השומן שמסביב.
הערה: יש להקפיד לא לנקב את רקמת הפרנצ'ימה בכליות.
השתמש מספריים קפיץ דק ומלקחיים פנימיים כדי להסיר רקמת שומן מבסיס הכליה כדי לחשוף את RP דיסטלי ושופך פרוקסימלי.
הסר את השופך הפרוקסימלי וחלק של RP דיסטלי מבסיס RP באמצעות מספריים קפיציים עדינים.
הערה: יש להקפיד לא לחתוך את פרנצ'ימה הכליות שמסביב. הקו המקווקו השחור באיור 1A מציין את המיקום המשוער של חיתוך זה. חתך זה יוצר בסיס שטוח על הכליה לחיתוך רקמות אחיד יותר. בעת ניתוח הכליה, יש להיות מודעים למיקום האנטומי של אזור PKJ. איור 1B מראה שניתן לחתוך את הכליה השלמה לאורך מישור קשתי כדי לחשוף את המדולה, הפפילה (מדולה דיסטלית שבה מתכנסות צינורות איסוף) ו-RP פרוקסימלי ודיסטלי. אם הפפילה תיחשף לחלוטין, כמו באיור 1C, ניתן לדמיין את ה-PKJ ואת ה-RP הפרוקסימלי (prox RP). עם זאת, זה לא צריך להיעשות עבור טכניקת ויברטום; תיאור זה נועד לכוון את הקורא למיקום PKJ באופן כללי, המודגש בהבדל האנטומי המוצג בתמונות האור המשודרות של אזור PKJ ואזור אמצע RP באיור 1D,E.
לנקב את כמוסת הכליה החיצונית עם מלקחיים עדינים, angling את הטיפים הרחק מגוף הכליה. באמצעות מלקחיים עם כל יד, לצבוט את הקצוות הרופפים של הקפסולה לקלף אותם לגזרים. ממשיכים לקלף בחזרה את קרום כמוסת הכליה הנותרת עד שהוא מוסר לחלוטין.
הערה: כמוסת הכליה היא שכבה קשוחה וסיבית המקיפה את הכליה. יש להסיר אותו לפני חיתוך ויברטום לחיתוך אופטימלי.

7. הכינו וכיילו את מכשיר הוויברטום

הכנס סכין גילוח למחזיק הלהב של מכשיר הוויברטום, והתאם את זווית הסיווג של הלהב ל- ~18°.
הערה: כצעד אופציונלי לחיתוך באיכות גבוהה יותר, יש להשתמש בלוק כיול (המסופק עם כמה מכשירי רטט) כדי להתאים את מיקום הלהב עבור כל להב חדש המשמש בהתאם להוראות היצרן. פעולה זו תבטיח מיקום אופטימלי של הלהב ותמזער רטט אנכי.
כוונן את מהירות התקדמות הלהב ל-0.2 מ"מ/ש', את הרטט האופקי/שופר הלהב למשרעת של 2.00 מ"מ ואת גודל ה-Z-step של הלהב ל-100-150 מיקרומטר. ודא כי עובי סעיף הכליות אינו עולה על 150 מיקרומטר כמו זה ישפיע לרעה Ca^{2 +} ניסויי הדמיה (כי קיר PKJ לעתים קרובות להתגלגל לקפל על עצמו אם זה עבה מדי).
הערה: המשתמש צריך לכוונן את הפרמטרים חיתוך אלה כי ההגדרות ישתנו בין תכשירי כליות בודדים ומכשירי רטט. כוונון עדין צריך להתבצע במהלך חתך כאשר המשתמש יכול לבדוק חזותית מקטעים תחת מיקרוסקופ, כמתואר בשלב 7.2.
התקן אמבט קרח ומגש חיץ על מכשיר הוויברטום. ממלאים את אמבט הקרח בקרח כתוש, וממלאים את אזור הבמה הפנימית בתמיסת KRB קרה כקרח (מלאו עד כחצי מלא). במהלך חתך ויברטום, לפקח ולהחליף את הקרח כתוש כי נמס.

8. ויברטום חתך את הכליה

השתמש במלקחיים קהים כדי לתפוס בעדינות ולהסיר את הכליה המוכנה מתמיסת KRB קרה כקרח. מניחים מיד את הכליה על נייר סופג למשך כ-2-4 ש' כדי להסיר לחות חיצונית עודפת. גלגלו בעדינות את הכליה על פני הנייר הסופג כדי להבטיח שכל צידי הפרנצ'ימה התייבשו כך שתהיה הידבקות אופטימלית של הכליה לשלב הוויברטום.
הערה: כמו RP ממוקם בתוך הכליה ולכן מוגן על ידי parenchyma החיצוני, תקופת ייבוש קצרה זו לא תהיה מזיקה שלמות הרקמה.
יש למרוח מיד שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט (כ-1 ס"מ²⁾על בסיס צלחת הדגימה של הוויברטום, ולהשתמש במלקחיים קהים כדי להניח את הכליה, בצד השופך כלפי מטה, על האזור המכוסה בדבק. יש למרוח בעדינות את הלחץ כלפי מטה על החלק העליון של הכליה עם הקצה השטוח של המלקחיים במשך כ 10-20 s כדי לייבש את הדבק.
הערה: כדי לייצב את הכליה במהלך הליך זה, השתמש זוג מלקחיים נוספים כדי לשמור על הכליה זקופה כמו הדבק מתייבש. זה קריטי כי הכליה דבקה בצלחת הדגימה במצב זקוף, כך חלקים נחתכים ישר. כדי להבטיח כי הכליה דבקה בהצלחה בצלחת הדגימה, בעדינות לדחוף את הצד של הכליה. אם הכליה דבקה בהצלחה בצלחת, בסיס הכליה צריך להישאר מאובטח לצלחת.
אבטחו היטב את צלחת הדגימה לתחתית מגש המאגר. התאם את רמת פתרון KRB כך שהחלק העליון של הכליה יהיה שקוע לחלוטין. במהלך שלבי החתך, כאשר להב הוויברטום נע עמוק יותר לתוך מגש המאגר, הסר את פתרון KRB כך שמחזיק הלהב לא יטבול בתמיסה.
הערה: אם הדבק לא התייבש לחלוטין לפני שהוא ממשיך בשלב זה, הדבק לעתים קרובות יעלה מהבסיס ומשם אל פרנצ'ימה הכליות. הדבק העודף הזה יהפוך את החתך למשתנה יותר. אם זה קורה, להסיר את הכליה מהצלחת ולהמשיך עם הכנת כליות טרי.
לחיתוך רטט אוטומטי, בחר את מיקומי ההתחלה והסיום של מחזור חיתוך להב הוויברטום. ודא עמדות אלה הם ~ 0.5-1 ס"מ ברור של הכליה כדי להבטיח כי עם כל התקדמות להב, כל מישור הכליות הוא חתך.
הכן צלחת רבת בארות (24 או 48-באר) על ידי מילוי בארות עם פתרון KRB ומניחים את הצלחת על קרח.
הערה: בעת יצירת, מקטעים בודדים צריכים להיות ממוקמים בבארות נפרדות כדי לעקוב אחר עומק המקטע.
התחל את תהליך החיתוך האוטומטי. במהלך המעבר הראשוני של הלהב, ודא כי הלהב יוצר קשר עם החלק העליון של הכליה. אם לא נוצר מגע, התאם את מיקום Z ההתחלתי של הלהב.
באמצעות מלקחיים, לאסוף חלקים המשוחררים מן הכליה. העבר מיד את הסעיפים לבארות בודדות, ושים לב לעומק Z של המקטעים כדי לאמוד את מיקום PKJ המשוער בתוך חלקי כליות.
הערה: בהתאם לפרמטרים לחתוך, חלקים מסוימים לא ניתן לחתוך חינם מן הבלוק הכליות. אם זה קורה, בזהירות להשתמש מספריים קפיץ עדין לחתוך חלקים מבלוק הכליות. משתמשים מוזמנים גם לדמיין באופן פעיל קטעים תחת מיקרוסקופ אור תוך צף חופשי בבארות בודדות כדי להבטיח הגדרות חיתוך אופטימליות ומיקום רקמות. חלקים המכילים PKJ יהיה נגזר בדרך כלל ~ 1000-1500 מיקרומטר מהחלק העליון של הכליה.
המשך בפרוטוקול הסעיף עד שאזורי PKJ יתבררו יותר. עיין בסעיף התוצאות הייצוגיות לקבלת תיאור אזורי PKJ כהמשך מקטע.
בשלב זה, לייעל את הפרמטרים חתך כדי להבטיח כי חלקים משוחררים מן בלוק הכליה באופן אחיד והם שלמים. בנוסף, ודא כי אזורי PKJ הם רציפים רצופים רצוף כי קירות PKJ שבורים לא יאפשר הדמיה נאותה של תאים בתוך הקיר עקב קריסה. אם הקירות נשברים, להקטין את מהירות החיתוך ולהגדיל את עובי המקטע, ולהמשיך להתבונן קטעים תחת מיקרוסקופ אור כדי לכוונן את פרמטרי החיתוך.
יש לאחסן מקטעים ב- 4°C בפתרון KRB עד לתחילת הניסויים.

9. פרוסת כליות Ca²⁺ רכישת תמונה

מעבירים פרוסת כליה בודדת לצלחת הדמיה מצופה אלסטומר סיליקון (35 מ"מ x 10 מ"מ), ומיד ממלאים את המנה בתמיסת KRB טרייה וקרה כקרח.
הכנס סיכות minutien סביב הפריפריה של פרוסת כליה כדי לאבטח את החלק לבסיס של צלחת ההדמיה.
הערה: שלב זה הוא קריטי כדי למנוע את החלק לנוע כאשר פתרונות פיזיולוגיים מנוטרלים על הפרוסה במהלך ההדמיה.
מניחים את צלחת ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב זקוף ומיד מתחילים להזדרז עם פתרון KRB.
הערה: בפרוטוקול זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ זקוף המצויד ביחידת סורק קונפוקלי של דיסק מסתובב של Nipkow במהירות גבוהה.
שמור על קצב זלוף ב 3 מ"ל / דקה וטמפרטורת פתרון KRB ב 36 ± 1 °C (50 °F). לפני ההדמיה, אפשר לפרוסה להתפרק במשך שעה אחת.
בחר את קוביית ההדמיה הדיכרואית המתאימה ולייזרים. רכשו תמונות באמצעות התקן מצמיד מטען (EMCCD) מתרבה אלקטרונים או מצלמת מוליך למחצה משלימה מדעית ממתכת.
הערה: מערכת הקונפוקלי בפרוטוקול זה מצוידת בלייזר 488 ננומטר כדי לרגש את GCaMP6f או GCaMP3. התמונות נרכשו באמצעות מצלמת EMCCD 512 פיקסלים x 512 פיקסלים.
השתמש עדשה אובייקטיבית הגדלה נמוכה, טבילה במים (4x או 10x) כדי לאתר את פרוסת הכליה. מרכז את שדה ההדמיה באזורים של הפרוסה שבהם PKJ קיים. זהה ציוני דרך, כפי שמתואר באיור 2D, כדי לאתר את ה-PKJ (כלומר, חצי מעגלים של רקמות שריריות התלויות בין רקמה א-צחיחית).
לאחר מיקום ה-PKJ, השתמש בעדשה אובייקטיבית גבוהה יותר של טבילת מים (20x, 40x או 60x) כדי להגדיל את תחום העניין.
הערה: בפרוטוקול זה, הצמצם המספרי האובייקטיבי 20x (NA) היה 1.0, NA האובייקטיבי 40x היה 0.8, ו- NA האובייקטיבי 60x היה 1.0.
להבחין תאים שונים של עניין בקיר PKJ באמצעות עכברים מהונדסים מבטאים GCaMP6f או GCaMP3 ב PDGFRα⁺ תאים או SMCs, בהתאמה. שים לב לסוגים השונים של שמשי זמן ארעיים Ca^{2 +} ב- PDGFRα⁺תאים בקיר PKJ ב PDGFRα⁺ GCaMP6f⁺ פרוסות כליה(איור 3C,ראה תוצאות מייצגות לתיאור) וב- GCaMP3⁺ SMCs ב- SMC GCaMP3⁺ פרוסות כליה(איור 3D,ראה תוצאות מייצגות לתיאור).
לאחר שזוהו תאים בעלי עניין בקיר PKJ, כווננו את עוצמת הלייזר כדי להניב יחס אות לרעש טוב. הקלט תמונות בתדר דגימה זמני בין 16 הרץ ל-32 הרץ באמצעות תוכנת רכישה מתאימה.
הערה: בהתאם לעוצמת הלייזר המשמשת במהלך ההדמיה, מומלץ להגביל את מספר ההקלטות בשל השפעות ההלבנה על פלואורופורים Ca²⁺ . המשתמש צריך לבחור אורך הקלטה בהתבסס על המטרות הניסיוניות הספציפיות.

10. ניתוח הדמיה Ca²⁺

בצע ניתוח הדמיה Ca^{2 +} של סוגי תאים שונים באזורי קוצב לב PKJ על ידי מיפוי spatiotemporal כפי שתואר בעבר עבור תכשירים אחרים קוצב לב שלם במערכת העיכול²⁹^,³⁰.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במקום Ca^{2 +} הדמיה של PKJ יכול לחשוף פעילות תאית חשובה של תאי קוצב לב RP. על ידי שימוש בעכברים המבטאים אינדיקטורים Ca²⁺מקודדים גנטית (כגון GCaMP), המונעים על ידי מקדמים ספציפיים לתא, ניתן להשיג מידע על קצב RP בדיוק ופרטים שאינם אפשריים מניסויי הדמיה Ca²⁺ מהתכנות RP שטוחות. תחילתו של ה-PKJ נבדלת על ידי המראה הפתאומי של עיגולי שרירים למחצה המושעים בין רקמת פרנצ'ימל כליות(איור 2C;PKJ פרוקסימלי מוקף בקופסה מקווקות). במהלך סבבי החתך הבאים, המדולה הפנימית הופכת להיות בולטת מרקמת קליפת המוח שמסביב. תחת מיקרוסקופ אור, המדולה הפנימית נראית מפוספסת באזורים, בהירה יותר בצבעה בהשוואה לרקמת קליפת המוח והופסקת על צירה הארוך עם שאר הכליה(איור 2B,D). בשלב זה, אזורי PKJ נוספים יתחילו להופיע. דוגמאות לכך מוצגות באיור 2D (מלבנים מקווקו, H ו- G) שבהם 3 עיגולים למחצה של שרירים מושעים על ידי רקמה ארכימלית. רצועות שרירים אלה יוצבו מקרוב לפפילה הפנימית, ובדרך כלל ישכנו עורק כליות (איור 2D, מלבנים מקווקוים; איור 2F-H,ראשי חץ שחורים). ככל שיותר מקטעים דיסטליים ייגזרים, רצועות שריר אלה ישתלבו כדי ליצור מבנה שלם ומאוחד יותר, המציין את סופו של אזור PKJ (איור 2E).
איור 3A,B מציג קטע PKJ בהספק נמוך (4-10x) מעכבר המבטא GCaMP ב- PDGFRα⁺תאים (GCaMP6f המובע על ידי Cre-רקומבינאז מובל המונע על ידי Pdgfra). באמצעות ציוני דרך כגון עורק הכליה(איור 3A;כוכבית), הנסיינים צריכים להיות מסוגלים להבחין בקלות בין קיר PKJ דק התלוי בין רקמה ארכימלית (איור 3B; כוכביות). הביטוי של GCaMP6f ברקמה מהונדסת ספציפית זו מתפשט על פני כל רוחב ה- PKJ, הן על פני השריר והן על פני השכבות ההרפתקניות (איור 3C).

ב PDGFRα⁺ GCaMP6f⁺ פרוסות כליות, רשת של תאים המשתרעת בדרך כלל על רוחב קיר PKJ תהיה פלואורסצנטית (איור 3C) ולהציג מתנדנד Ca^{2 +} ארעי של משכי זמן ותדרים שונים. PDGFRα⁺תאים בקיר PKJ מציגים שני סוגים שונים של משכי זמן ארעיים Ca²⁺ . בשכבה ההרפתקנית (מכוונת קרוב יותר לקליפת המוח), PDGFRα⁺תאים הנמצאים כרשת של תאים ותהליכיהם מוגדרים. PDGFRα⁺תאים הרפתקאות מפגינים בתדר נמוך (4 ± 2.7 הרץ) ומשך זמן ארוך (1 ± 0.67 שניות) Ca²⁺ ארעי. השכבה השנייה של PDGFRα⁺תאים, הנמצאת בשכבת השריר (מכוונת קרוב יותר למדולה), מציגה תדרים ומשכי זמן ארעיים דומים של Ca²⁺ כמו SMC GCaMP3⁺ תאים (המתוארים להלן) מכיוון שהם מאותו סוג תא.

ב SMC GCaMP3⁺ פרוסות כליה, שכבה של GCaMP3⁺ תאים קיימת בשכבת השריר ( איור3D). בשכבה ההרפתקנית לא יהיה אות פלואורסצנטי (איור 3D;כוכבית). GCaMP3⁺ SMCs בשכבה השרירית מציגים בדרך כלל תדר גבוה (10 ± 4 הרץ) ומשך קצר (632 ± 74 שניות) Ca²⁺ ארעי. PDGFRα⁺תאים הממוקמים ב-PKJ adventitia מעוררים ארעי Ca²⁺ ארוכי טווח בתדר נמוך(איור 3E,וידאו 1). עם זאת, ניסויי הדמיה Ca²⁺ מרקמות המבטאות GCaMP3 המונעים על ידי מקדם Myh11 מוגבלים להיבט השרירי של PKJ (איור 3D). בהשוואה ל- PDGFRα⁺תאים בהרפתקאות, מחשבים נימיים ירו משך קצר יותר Ca^{2 +} ארעי בתדירות גבוהה יותר(איור 3F, וידאו 2).

בנוסף להבנת תכונות איתות PKJ PDGFRα⁺ ICs, היישום של טכניקה זו כדי ללמוד סוגי תאים אחרים בכליה בחתך רטט הודגם במאמר זה. לאחר בדיקה מדוקדקת של מדולה הכלייתי (בעכברים המבטאים GCaMP6f ב PDGFRα⁺ תאים), נצפה מערך של אותות Ca^{2 +} פלואורסצנטי בתוך והסביבה איסוף צינורות(וידאו 3)נצפה. Medullary PDGFRα⁺תאים ירו ספונטני Ca^{2 +} ארעי של תדירות משתנה ומשך. מחקרי הדמיה אלה של Ca²⁺ של מקטעי רטט כליות יכולים להיות מורחבים גם לחקר עורקי כליות (קוטר ~ 50-80 מ"מ) שלעתים קרובות שכנים מקטעי שריר PKJ(איור 2F,G; חצים לבנים). Ca²⁺ הדמיה של עורקי כליות (מרקמה המבטאת GCaMP בתאי שריר חלקים) מדגים Ca^{2 +} ארעיים מתנדנדים ב- SMCs(וידאו 4).

figure-results-1
איור 1: אנטומיה בסיסית של הכליות והמיקום של אזור קוצב הלב PKJ. (A)תרשים של הכליה השלמה המציגה את הכיוון של ה- RP והשופכן. עורק הכליה וריד הכליות מוצגים באדום וכחול, בהתאמה. (B)ניתן לחתוך את הכליה השלמה לאורך מישור קשת כדי לחשוף את ההיבט הפנימי של הכליה, כולל המדולה, פפילה (מדולה דיסטלית שבה מתכנסות צינורות איסוף), ו- RP פרוקסימלי ודיסטלי. (C)ניתן לסלק את המדולה והפפילה כדי לחשוף לחלוטין את ה- PKJ ואת ה- RP של הפרוקס. (D ו- E) מייצגים תמונות אור משודרות מאזור קוצב הלב PKJ ו- RP דיסטלי, בהתאמה. חתך רציף לקראת הקצה הדיסטלי של האגן גורם לחצי העיגולים של השריר באזור PKJ (Di) בשילוב לתוך טבעת שרירית אחת, עבה יותר (Ei) כי מקיף את הפפילה כולה. מלבנים שחורים, מקווקוים בדי ואי מראים אזורים משוערים בחלקי כליות קורונל שבהם נרכשו תמונות אור מועברות. התמצאות של תמונות D ו- E הן 90° נגד כיוון השעון ל- insets בהתאמה (Di ו- Ei). סרגלי קנה מידה ב- D ו- E = 20 מיקרומטר. קיצורים: RP = אגן הכליות; פרוקס RP = אגן כליות פרוקסימלי; PKJ = צומת אגן-כליות; פקעת דם = קולטן קולטן-אלפא-חיובי קולטן-אלפא-חיובי תאים; SMC = תא שריר חלק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: חתך ויברטום של כליות שלמות כדי ליצור חלקים דקים. (A)הכליות מותקנות בצד השופך עד לבסיס הכלי הוויברטום, ולהב סטנדרטי (המחובר לראש הוויברטום) משמש לחיתוך קטעים רציפים מהקצה הפרוקסימלי לקצה הדיסטלי של הכליה. (ב)ייצוג דיאגרמתי של קטע דק שנחתך מכליה עם ציוני דרך מובאים. מקטעי שריר PKJ (מלבן מקווקו שחור) נמצאים לעתים קרובות תלויים בין רקמה א-צחית. (C)תמונה מיקרוסקופית בהירה של קטע כליות פרוקסימלי. המראה של רצועות שרירים תלויות בין רקמה א-צחית מצביע על תחילת התחזיות הפרוקסימליות PKJ (המצוין בתוך מלבן מקווקו לבן). (D)תמונה מיקרוסקופית בהירה המייצגת את האזור האופטימלי שבו ניתן למצוא מקטעי PKJ מרובים (2-3) (אזורים בתוך מלבנים מקווקו לבן). רצועות שריר PKJ דקות תלויות בין פרנצ'ימה הכליות ומתיישרות היטב עם עורקי כליות ומדולה. (ה)תמונה מיקרוסקופית בהירה של קטע כליות דיסטלי. מקטעי שריר בודדים התמזגו כדי ליצור רצועת שריר אחת ורציפה (מלבן מקווקו לבן) המקיף את הפפילה הפנימית (לא קיים בתמונה זו). סרגלי קנה מידה C-E = 500 מיקרומטר. F-H Zoomed (20x) אזורים מלוח D מציינים את המיקום של PKJ (ראשי חץ שחורים), עורקי כליות (ראשי חץ לבנים) ואתרים לחתוך לבידוד PKJ (קווים לבנים מקווקו). סרגלי קנה מידה F-H = 100 מיקרומטר. קיצור: PKJ = צומת אגן-כליות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: Ca²⁺ הדמיה של מקטעי ויברטום. (A)תמונה ייצוגית בהספק נמוך (4x) של מקטע רטט המציינת את המיקום של עורק הכליה (כוכבית). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B)תמונה מייצגת זום (20x) של PKJ (מסומן) תלוי בין רקמה parenchymal כליות המציין מיקומים של שריר PKJ (ראש חץ לבן), עורק כליות (כוכבית). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) עוצמה גבוהה (40x) תמונה של PKJ מבטא GCaMP ב PDGFRα⁺תאים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (D)עוצמה גבוהה (20x) תמונה של PKJ מבטא GCaMP בתאי שריר חלקים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (E) מפת Spatiotemporal של Ca^{2 +} ארעי שנדגמו מ- GCaMP⁺ PDGFRα⁺ תא המצוין בלוח C. חפש טבלה המקודדת עבור F/F₀. (F)מפת Spatiotemporal של Ca^{2 +} ארעי נדגמו מ GCaMP⁺ PDGFRα⁺ תא המצוין בלוח D. חפש טבלה המקודדת עבור F/F₀. (G)נתונים מייצגים עבור Ca^{2 +} תדר ארעי (Hz) עבור GCaMP⁺ PDGFRα⁺ תאים ותאי GCaMP⁺ smMHC. (H)נתונים מייצגים עבור Ca^{2 +} משך ארעי (ים) עבור GCaMP⁺ PDGFRα⁺ תאים ותאי GCaMP⁺ smMHC. קיצורים: PKJ = צומת אגן-כליות; PDGFRα^{+ =} קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם-אלפא-חיובי; smMHC = שרשרת שרירים שרירים חלקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: ספונטני Ca²⁺ ארעי ב- GCaMP⁺ PDGFRα⁺ תאים בחלקים של ויברטום PKJ. קיצורים: PKJ = צומת אגן-כליות; PDGFRα⁺ = קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם-אלפא-חיובי. נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)

וידאו 2: ספונטני Ca²⁺ ארעי GCaMP⁺ תאי שריר חלקים בחלקים רטט צומת האגן-כליות. נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)

וידאו 3: ספונטני Ca²⁺ ארעי ב- GCaMP⁺ PDGFRα⁺ תאים בקטעי רטט כליות medullary. קיצור: PDGFRα⁺ = קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם-אלפא-חיובי. נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)

וידאו 4: משרעת נמוכה Ca^{2 +} פעילות חולפת בחלקים של רטט של עורק הכליה. נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ה- RP מורכב מאוכלוסייה הטרוגנית של תאים עם צפיפות תאים דיפרנציאלית שנצפו באזורי RP שונים. PIC1s (המכונה בעבר ASMCs) הם הנפוצים ביותר PKJ, שבו פעילות קוצב הלב מקורה²⁴. הפרוטוקול, המתואר כאן, מאפשר לחוקרים לבודד את אזור קוצב הלב משאר כליות העכבר. על ידי חיתוך קטעים של PKJ באמצעות ויברטום, אזורי קוצב הלב של RP (מזוהה כמו רצועות שריר המחוברות parenchyma) נשמרים שלמים, ובכך להרשות לעצמם את השימוש בהדמיה במקום כדי ללמוד במדויק תאי קוצב לב RP בשילוב עם כתבים פלואורסצנטי ספציפי לתא.

בעוד שגישה זו יכולה לספק תובנות חדשות על קצב RP, ישנם כמה שיקולים שהנסיינים צריכים להכיר כדי לשפר את תוצאות ההדמיה ואת יעילות החתך. עבור משתמש לא מאומן, שיטה זו של בידוד PKJ והדמיה קל יותר ללמוד מאשר ניתוח חד טיפוסי של תכשירי RP שטוחים. ניתוח חד של RP מכליות שלמות דורש שבועות של תרגול עקבי כדי לבודד בהצלחה רקמות קיימא לניסויים פיזיולוגיים. מכיוון שפרוטוקול חלוקת רטט זה דורש מעט ידע חד בניתוח, הוא נגיש למשתמשים שאין להם ניסיון בניתוח מבני שריר חלקים אחרים.

עם זאת, יש כמה נקודות קריטיות שיש לציין עבור פרוטוקול זה. דבקות מוצלחת בכליות לצלחת הדגימה של הוויברטום דורשת מיומנות וסבלנות. אם הכליה מכוונת באופן שגוי ונשענת על צד אחד, חלקים עקיפים ולא ישרים ייחתכו. בשל האופי העדין של PKJ, הזווית האלחונים יכולה לעתים קרובות להרוס את רצועות השרירים של אזור קוצב הלב. יתר על כן, הדמיה של מקטעים עקיפים גורמת לרכישת הדמיה לקויה מכיוון שרשתות סלולריות אינן נמצאות בדרך כלל באותו מישור מוקד. ההליך הוא גם זמן רב, עם חתך של כליה אחת לעתים קרובות לוקח עד שעה כדי להשלים, שבמהלכו ההתקנה דורשת ניטור.

בעוד התנועה של vibratome ניתן להאיץ, אם המהירות מוגברת יותר מדי (>20% ממה המומלץ בפרוטוקול), הלהב יהיה לגרוס ולא לחתוך את הכליה בצורה נקייה, וכתוצאה מכך אובדן של מבני PKJ עדינים. באופן דומה, מהירות חיתוך נמוכה מדי עלולה לגרום לסעיף להיות משונן. אופטימיזציה של מהירות חיתוך משרעת להב הוא חיוני. יש להסתפיד גם בטיפול בקטעי רטט. בשל אופיים העדין, שרירי PKJ משובשים בקלות במהלך הטיפול ויכולים לקרוע. משתמש מאומן היטב יוכל לקצור כ 1-2 אזורי PKJ לכל 4 פרוסות כליות המתאימות לניסויי הדמיה Ca²⁺ . בדרך כלל, מקטעי PKJ שאינם עומדים בקריטריוני הדמיה Ca²⁺ יש: 1) ביטוי GCaMP גרוע, 2) קיר PKJ מעוות, או 3) קיר PKJ שבור. עבור ניתוח נתונים, ניתן לדגום כ- 3-4 תאים לכל שדה תצוגה (FOV).

בעוד ישנם תאים רבים ב- FOV של PDGFRα-GCaMP6f ו- SMC-GCaMP3 PKJ, תנועות רקמות קטנות לעתים קרובות לא כוללות תאים מניתוח. בדרך כלל ניתן לפתור זאת על-ידי החלת פרוטוקול ייצוב על תמונות. בתנאים שבהם ההכנות אינן זזות, ניתן לדגום לפחות 3-5 תאים ממקטעי PDGFRα-GCaMP6f ו-5-6 תאים ממקטעי SMC-GCaMP3. בדרך כלל, הזמן שנדרש מהקרבת בעלי חיים (הגיל האופטימלי לעכברים הוא 8-16 שבועות) לביצוע ניסויי הדמיה Ca²⁺ הוא 2-3 שעות, וזה מספיק כדי להבטיח שלמות הרקמה, אם רקמות מודלגות בתפתרונות קרים כקרח לאורך כל ההליך בעת הצורך. לסיכום, פרוטוקול חיתוך ויברטום תואר כאן כדי ליצור הכנות שלמות של אזורי PKJ RP מכליות העכבר. טכניקה זו מאפשרת שימור של אזורי קוצב לב RP עבור inu Ca^{2 +} מחקרי הדמיה לחקור מנגנוני קוצב לב RP.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט זה מומן על ידי R01 DK124509 מ- NIDDK.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית 24 בארות	ThermoFisher Scientific	142485	לאחסון פרוסות כליה בכלי
פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ	Sigma Aldrich	CLS430165	צלחת הדמיית סידן פרוסת כליה
48 בארות	ThermoFisher Scientific	152640	לאחסון פרוסות כליה
בצלחת פטרי 60 מ"מ x 15 מ"מ	Sigma Aldrich	P5481	צלחת חיתוך כליה חדה
נייר סופג	פישר סיינטיפיק	06-666A	לייבוש הכליה לפני מריחת דבק
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	מעבדת ג'קסון	13148	עכברי GCaMP3
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	מעבדת ג'קסון	24105	עכברי GCaMP6f
B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	מעבדת ג'קסון	19079	עכברי smMHC-CRE
C57BL/6-TG(Pdgfra-cre)1Clc/J	מעבדת ג'קסון	13148	PDGFRa-CRE עכברים
דבק ציאנואקרילט אמזון		B001PILFVY	להדבקת הכליה לצלחת הדגימה
אתנול	Phamco-Aaper	SDA 2B-6	לדיסקציה
מספריים בון עדינים במיוחד	Fine Science Tools	14083-08	משמש למספריים לחיתוך פנימי
מספריים עדינים	Fine Science Tools	14060-09	משמש למספריים לחיתוך חיצוני
מלקחיים עדינים	Fine Science Tools	11254-20	משמש לדיסקציה עדינה של הכליות
Gillette Silver Blue להבים דו-צדדיים אמזון		B009XHQGYO	להכנסה למחזיק להב של ויברטום
ImageJ	NIH		לניתוח הדמיית סידן
Isoflurane	Baxter	NDC 1001936060	להרדמה
סיכות Minutien	פישר סיינטיפיק	NC9677548	סיכות נחתכו לשניים כדי להקטין את אורכן
אלסטומר סיליקון	פישר סיינטיפיק	סילגארד	184
סטודנט אדסון מלקחיים	כלים מדעיים	עדינים91106-12	לאחיזה והזזה עדינה של הכליה
סטודנט דומונט מלקחיים	Fine Science Tools	91150-20	משמש למלקחיים לניתוח פנימי
מספריים קפיציים Vannas	Fine Science Tools	15000-03	לחיתוך חד וניקוי של כליה מבודדת
Vibrocheck	Leica	14048142075	רכיב אופציונלי לכיול תנועת הלהב במהלך החיתוך
VT1200 S להב רוטט Microtome	Leica	14912000001	תצורה 1 משמשת בפרוטוקול שלנו

NC9285739

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Constantinou, C. E., Djurhuus, J. C. Pyeloureteral dynamics in the intact and chronically obstructed multicalyceal kidney. The American Journal of Physiology. 241 (5), 398-411 (1981).
Constantinou, C. E., Yamaguchi, O. Multiple-coupled pacemaker system in renal pelvis of the unicalyceal kidney. TheAmerican Journal of Physiology. 241 (5), 412-418 (1981).
Constantinou, C. E., Hrynczuk, J. R. Urodynamics of the upper urinary tract. Investigative Urology. 14 (3), 233-240 (1976).
Schmidt-Nielsen, B., Schmidt-Nielsen, B. On the function of the mammalian renal papilla and the peristalsis of the surrounding pelvis. Acta Physiologica. 202 (3), Oxford, England. 379-385 (2011).
Dwyer, T. M., Schmidt-Nielsen, B. The renal pelvis: machinery that concentrates urine in the papilla. Physiology. 18 (1), 1-6 (2003).
Hill, W. G. Control of urinary drainage and voiding. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 10 (3), 480-492 (2015).
Brading, A. F. The physiology of the mammalian urinary outflow tract. Experimental Physiology. 84 (1), 215-221 (1999).
Dixon, J. S., Gosling, J. A. The musculature of the human renal calices, pelvis and upper ureter. Journal of Anatomy. 135, Pt 1 129-137 (1982).
Lang, R. J., et al. Pyeloureteric peristalsis: role of atypical smooth muscle cells and interstitial cells of Cajal-like cells as pacemakers. The Journal of Physiology. 576, 695-705 (2006).
Lang, R. J., Takano, H., Davidson, M. E., Suzuki, H., Klemm, M. F. Characterization of the spontaneous electrical and contractile activity of smooth muscle cells in the rat upper urinary tract. Journal of Urology. 166 (1), 329-334 (2001).
Lang, R. J., Exintaris, B., Teele, M. E., Harvey, J., Klemm, M. F. Electrical basis of peristalsis in the mammalian upper urinary tract. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 25 (5), 310-321 (1998).
Morita, T., Ishizuka, G., Tsuchida, S. Initiation and propagation of stimulus from the renal pelvic pacemaker in pig kidney. Investigative Urology. 19 (3), 157-160 (1981).
Tsuchida, S., Morita, T., Harada, T., Kimura, Y. Initiation and propagation of canine renal pelvic peristalsis. Urologia Internationalis. 36 (5), 307-314 (1981).
Yamaguchi, O. A., Constantinou, C. E. Renal calyceal and pelvic contraction rhythms. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 257 (4), 788-795 (1989).
Klemm, M. F., Exintaris, B., Lang, R. J. Identification of the cells underlying pacemaker activity in the guinea-pig upper urinary tract. Journal of Physiology. 519 (3), 867-884 (1999).
Lang, R. J., et al. Spontaneous electrical and Ca2+ signals in the mouse renal pelvis that drive pyeloureteric peristalsis. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 37 (4), 509-515 (2010).
Lutzeyer, W. Pacemaker process of ureteral peristalsis in multicalyceal kidneys. Urologia Internationalis. 37 (4), 240-246 (1982).
Lang, R. J., Hashitani, H. Pacemaker mechanisms driving pyeloureteric peristalsis: modulatory role of interstitial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 77-101 (2019).
Hashitani, H., et al. Interstitial cell modulation of pyeloureteric peristalsis in the mouse renal pelvis examined using FIBSEM tomography and calcium indicators. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (5-6), 797-813 (2017).
Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).
Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Parkington, H. C., Suzuki, H. Spontaneous electrical and Ca2+ signals in typical and atypical smooth muscle cells and interstitial cell of Cajal-like cells of mouse renal pelvis. The Journal of Physiology. 583, 1049-1068 (2007).
Hashitani, H., Lang, R. J., Mitsui, R., Mabuchi, Y., Suzuki, H. Distinct effects of CGRP on typical and atypical smooth muscle cells involved in generating spontaneous contractions in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 158 (8), 2030-2045 (2009).
Iqbal, J., et al. Potassium and ANO1/ TMEM16A chloride channel profiles distinguish atypical and typical smooth muscle cells from interstitial cells in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 165 (7), 2389-2408 (2012).
Grainger, N., et al. Identification and classification of interstitial cells in the mouse renal pelvis. Journal of Physiology. 598 (15), 3283-3307 (2020).
Hashitani, H., Mitsui, R., Lang, R. Functional heterogeneity of PDGFRα (+) cells in spontaneously active urogenital tissues. Neurourology and Urodynamics. 39 (6), 1667-1678 (2020).
Hashitani, H., Lang, R. J. ATYPICAL or INTERSTITIAL, take your PIC. Journal of Physiology. 598 (15), 3061-3062 (2020).
Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).
Grundy, D. Principles and standards for reporting animal experiments in The Journal of Physiology and Experimental Physiology. Experimental Physiology. 100 (7), 755-758 (2015).
Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular Ca 2+ signaling in situ. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-13 (2019).
Leigh, W. A., et al. A high throughput machine-learning driven analysis of Ca2+ spatio-temporal maps. Cell Calcium. 91, 102260(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDGFR Alpha

בידוד והדמיה חיה, אזורי קוצב לב שלמים של אגן כליות העכבר על ידי חלוקת ויברטום

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים