הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

Natasja G. J. Costermans; Enrico M. Daldello; Ria J. Marathe; Marco Conti

doi:10.3791/62041

מאמר שיטה

הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

DOI:

10.3791/62041

⸱

16 ביוני 2021

Natasja G. J. Costermans¹^,² , Enrico M. Daldello¹^,²^,³ , Ria J. Marathe¹^,² , Marco Conti¹^,²

¹Center for Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, ²Department of Obstetrics Gynecology and Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, ³Present affiliation: Laboratoire de Biologie du Développement-Institut de Biologie Paris Seine, LBD-IBPS, Sorbonne Université

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית כדי ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNA ביציות בודדות במהלך התבגרות במבחנה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אירועים הקשורים התבגרות גרעינית ביצית תוארו היטב. עם זאת, הרבה פחות ידוע על המסלולים המולקולריים והתהליכים המתרחשים בציטופלסמה כהכנה להפריה ורכישה של totipotency. במהלך התבגרות ביצית, שינויים בביטוי גנים תלויים אך ורק בתרגום והשפלה של RNAs שליח אימהי (mRNAs) ולא על שעתוק. ביצוע תוכנית התרגום, אם כן, ממלא תפקיד מפתח בביסוס יכולת התפתחותית ביצית לקיים התפתחות עובר. מאמר זה הוא חלק מהתמקדות בהגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי המתרחשת במהלך התבגרות מיוטית ובמעבר ביצית לזיגוטה. במאמר שיטה זו, מוצגת אסטרטגיה ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNAs היעד במהלך התבגרות ביצית במבחנה. כאן, כתב Ypet הוא התמזגו לאזור 3' לא מתורגם (UTR) של הגן של עניין ולאחר מכן מיקרו מוזרק לתוך ביציות יחד עם קידוד mRNA polyadenylated עבור mCherry לשלוט עבור נפח מוזרק. על ידי שימוש במיקרוסקופיה של זמן לשגות כדי למדוד הצטברות כתב, שיעורי התרגום מחושבים במעברים שונים במהלך התבגרות מיוטית ביצית. כאן תוארו הפרוטוקולים לבידוד והזרקה של ביציות, הקלטת זמן לשגות וניתוח נתונים, באמצעות כתב UTR Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' כדוגמה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצית יונקים בוגרת עוברת שינויים מהירים כהכנה להפריה ורכישה של טוטיפופוטנציה. שינויים אלה חיוניים כדי לקיים התפתחות עוברית לאחר ההפריה. למרות האירועים הקשורים התבגרות גרעינית מתוארים היטב יחסית, הרבה פחות ידוע על התהליכים המולקולריים ואת המסלולים בציטופלסמה ביצית. במהלך השלבים הסופיים של התבגרות ביצית, ביציות שקטות שעתוק, וביטוי גנים תלוי לחלוטין בתרגום mRNA והשפלה¹^,². הסינתזה של חלבונים קריטיים ליכולת התפתחותית, אם כן, מסתמכת על תוכנית של תרגום מתוזמן של mRNAs ארוכי טווח שעברו סינתזה מוקדם יותר במהלך צמיחת ביצית¹^,³. כחלק מהתמקדות בהגדרת תוכנית זו של תרגום mRNA אימהי שבוצע במהלך התבגרות מיוטית ובמעבר ביצית לזיגוטה, מאמר זה מציג אסטרטגיה ללמוד את ההפעלה והדיכוי של התרגום של mRNAs אימהי היעד ביציות בודדות במהלך אימהות מיוטית במבחנה.

בשיטה זו, מסגרת הקריאה הפתוחה של YPet משובטת במעלה הזרם של UTR 3 ' של תמליל העניין. לאחר מכן, mRNAs קידוד כתב זה מוזרק מיקרו לתוך ביציות יחד עם mRNAs polyadenylated קידוד mCherry כדי לשלוט על נפח מוזרק. הצטברות הכתב נמדדת במהלך התבגרות מיוטית במבחנה באמצעות מיקרוסקופיה של זמן לשגות. הצטברות של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- mCherry נרשמת ביציות בודדות, ואותות YFP מתוקנים על ידי הרמה של mCherry מוזרק במשותף. לאחר רכישת נתונים, שיעורי תרגום מחושבים עבור מרווחי זמן שונים במהלך התבגרות מיוטית ביצית במבחנה על ידי חישוב השיפוע של העקומה המתקבל על ידי התאמת עקומה.

גישה זו מספקת כלי לאישור ניסיוני של שינויים בתרגום של mRNAs אנדוגני נבחרים. בנוסף, שיטה זו מקלה על אפיון של אלמנטים רגולטוריים השולטים בתרגום במהלך התבגרות מיוטית ביצית על ידי מניפולציה של אלמנטים cis-תקינה של 3 ' UTR של mRNAs היעד⁴^,⁵^,⁶. מניפולציה של אורך הזנב פולי(A) גם מאפשר תובנה לתוך פעילות אדניאלאז / deadenylase ביציות⁵. Mutagenesis של אלמנטים cis-acting או immunoprecipitation RNA יכול לשמש כדי ללמוד אינטראקציות עם חלבונים מחייבים RNA קוגנט⁶^,⁷. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות רכיבים חיוניים של תוכנית התרגום כי הם קריטיים עבור יכולת התפתחותית ביצית על ידי מדידת יעד 3 ' תרגום UTR במודלים הקשורים לירידה באיכות ביצית ⁸^,⁹^,¹⁰. נייר שיטה זה מציג ניסוי מייצג שבו ביציות של עכברי C57/BL6 בני 21 יום הוזרקו במיקרו עם כתב Ypet מותך UTR 3 ' של IL-7. ההתקנה והפרוטוקול להזרקת ביצית, הקלטת זמן לשגות וניתוח נתונים תוארו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליכים הניסיוניים שבהם מעורבים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (פרוטוקול AN182026).

1. הכנת אמצעי תקשורת

הוסף את כל הרכיבים, כמתואר בטבלה 1, כדי להפוך את אוסף ביציות הבסיסי בינוני בינוני התבגרות ביצית בינוני. עבור מדיום האוסף הבסיסי, הגדר את ה- pH ל- 7.4. עבור מדיום איסוף והתבגרות, להוסיף 3 מ"ג / מ"ל של אלבומין סרום שור (BSA) ו 1 μM cilostamide ביום השימוש.

2. הכנת קידוד mRNA עבור UTR של Ypet-3' ו- mCherry

להשיג את 3′ רצפי UTR של mRNAs של עניין.
הערה: עבור מחקר זה, רצפים התקבלו בעבר מן העכבר ביצית cDNA.
עיצוב פריימרים כדי להגביר את היעד 3 ' UTRs מ oocyte cDNA וחלקים של pcDNA 3.1 וקטור המכיל רצף קידוד Ypet, תג V5-epitope, ו מקדם T7.
להגביר באמצעות ערכת פולימראז DNA נאמנות גבוהה. הפעל את מוצרי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) על ג'ל כדי לבדוק אם השברים יש את הגודל הנכון, לגזור את הרצועות, ולחלץ את ה- DNA מן הג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל על פי הוראות היצרן.
נתיך את שברי ה- PCR לווקטור באמצעות ערכת שיבוט PCR.
הערה: שברי PCR דגירו על קרח במשך 4 שעות כדי להקל על תהליך רקומבינציה יעיל יותר. זאת בניגוד להוראות היצרן, הממליצות על זמן דגירה של 45 דקות בלבד.
Transfect שברי PCR לתוך חיידקים מוסמכים 5-α Escherichia קולי.
1. מוסיפים את התערובת ואת plasmid לחיידקים, ואת הדגירה על הקרח במשך 30 דקות.
2. מחממים את התערובת ואת plasmid על ידי הצבת התערובת באמבט מים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 s, ומיד להתקרר על הקרח במשך 3 דקות.
3. הוסף 500 μL של מרק סופר אופטימלי עם דיכוי קטבוליט (SOC) בינוני דגירה עבור 1 שעה ב 37 °C (69 °F).
4. סובב למטה ב 7000 × g במשך 2 דקות, ולהסיר את רוב supernatant. Resuspend וצלחת על צלחת אגר מרק לוריא (LB) עם אנטיביוטיקה הבחירה המתאימה.
  הערה: Carbenicillin שימש במחקר זה.
5. דגירה לילה ב 37 °C (69 °F). לבודד את המושבות על ידי לחיצה קלה על קצה פיפטה על אחת המושבות והנחת אותו 3 מ"ל של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם / מ"ל של קרבניצילין. דגירה עבור 12-24 שעות ב 37 °C (69 °F).
6. לחלץ את ה-DNA של פלסמידים באמצעות ערכת בידוד DNA פלסמיד על פי הוראות היצרן ולאשר את הרצפים באמצעות ריצוף DNA.
עבור UTR 'Ypet/3':
1. הפק תבנית PCR ליניארית עבור שעתוק במבחנה. השתמש פריימר קדימה במעלה הזרם של רצף Ypet פריימר הפוך עם 20 שאריות thymine נוספות. ראה טבלה 2 עבור הרצף של UTR Ypet/IL-7 3' ואת הרצפים של פרייומרים קדימה והפוך.
  הערה: שאריות תימין נוספות אלה יוסיפו אוליגו(A) ל- mRNA הליניארי לאחר שעתוק במבחנה .
2. במבחנה לתמלל את מוצר PCR באמצעות ערכת תמלול T7 על פי הוראות היצרן.
3. לטהר את RNA משלים וכתוצאה מכך (cRNA) באמצעות ערכת ניקוי שעתוק על פי הוראות היצרן.
4. יש לרכך את ה-cRNA המטוהר במים נטולי RNAse, למדוד ריכוז ולהעריך את השלמות על ידי אלקטרופורזה אגרוזית. יש לאחסן ב-80°C.
עבור mCherry:
1. הפק תבנית PCR ליניארית עבור שעתוק במבחנה באמצעות אנזים הגבלת נאמנות גבוהה; השתמש באנזים ההגבלה mfEI-HF אם משכפל דוגמה זו. לעכל במאגר עיכול לילה ב 37 °C (60 °F).
2. הפעל ג'ל כדי לטהר את הדגימה, ולחלץ את ה- DNA הליניארי באמצעות ערכת מיצוי ג'ל על פי הוראות היצרן.
3. במבחנה לתמלל את מוצר PCR באמצעות ערכת תמלול T7 על פי הוראות היצרן.
4. פוליאדנילאט cRNA (150-200 נוקלאוטידים) באמצעות ערכת זנב פולי(A) על פי הוראות היצרן.
5. לטהר את cRNA וכתוצאה מכך באמצעות ערכת ניקוי שעתוק על פי הוראות היצרן.
6. יש לרכך את ה-cRNA המטוהר במים נטולי RNAse, למדוד ריכוזי mRNA ולהעריך את שלמות ההודעה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. יש לאחסן ב-80°C.

3. הליך ניסיוני

הערה: סקירה סכמטית של הזרקת מיקרו ביצית ומיקרוסקופיה של זמן לשגות לאחר מכן ניתנת באיור 1.

יום 1
1. תוך-אופן להזריק עכברים בני 21 יום עם 5 IU של גונדוטרופין סרום של סוסה בהריון כדי לקדם את צמיחת זקיק לשלב^{antral 11}.
יום 3
1. אוסף ביציות
  1. להקריב עכברים 44-48 שעות לאחר priming כדי לאסוף את השחלות, ומניחים אותם בצלחת פטרי פלסטיק עם מדיום אוסף ביציות בסיסי.
  2. בזהירות לפתוח את זקיקי antral על ידי ביצוע חתך קטן בקיר הזקיק עם מחט 26 G. בודד ביציות (COCs) סגורות קומולוס שלמות עם מספר שכבות של תאי קומולוס באמצעות פיפטה זכוכית המופעלת בפה.
  3. השתמש פיפטה קטנה יותר (מעט גדול יותר מאשר הקוטר של ביצית), מכנית denude COCs על ידי pipetting חוזר.
    הערה: לחלופין, בצע מיקרו-הזרקה על COCs שלמים.
  4. באמצעות פיפטה גדולה יותר, לשאוף את ביציות denuded ומניחים אותם בצלחת פטרי עם מדיום התבגרות בתוספת 1 מיקרומטר של מעכב phosphodiesterase, cilostamide, כדי למנוע חידוש של התבגרות מיוטית¹². מניחים את המנה באינקובטור במשך 2 שעות כדי לאפשר את ביציות להתאושש מן הלחץ הנגרמת על ידי בידוד של ביציות מן הזקיקים.
2. הזרקת מיקרו ביצית
  1. הכן את מחטי ההזרקה על ידי הצבת צינור נימי זכוכית בורוסיליקט באורך 10 ס"מ במשיכה מכנית. להזרקה אופטימלית, כופפו את קצה המחט בזווית של 45° בעזרת חוט מחומם.
  2. מכינים מנות פוליסטירן עם 20 טיפות μL של מדיום אוסף ביציות בסיסי, ומכסים את הטיפות בשמן מינרלי קל.
  3. הכן תערובת כתבים על ידי הוספת 12.5 מיקרוגרם / μL Ypet-3 ' UTR ו 12.5 מיקרוגרם / μL mCherry. הכינו נפח גדול יותר ובצעו אליקוטים לניסויים עתידיים כדי להבטיח ריכוזי כתבים דומים. לאחסן aliquots אלה ב -80 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, צנטריפוגה הראשונה aliquot במשך 2 דקות ב 20,000 x g, ולהעביר צינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
    הערה: צנטריפוגה זו תמנע ממחט ההזרקה להיסתום על ידי אגרגטים פוטנציאליים בתמהיל הכתבים.
  4. לטעון את מחט ההזרקה על ידי נימי עם כ 0.5 μL של תערובת כתב.
  5. מניחים את פיפטה מחזיק מחט הזרקה טעונה לתוך המחזיקים, ומיקום טיפה של מדיום אוסף ביצית. לשאוף חלק מהמדיום לתוך פיפטה מחזיקה.
  6. פתח את מחט ההזרקה על ידי הקשה בעדינות על זה נגד פיפטה מחזיק.
  7. מניחים ביציות בטיפה של מדיום איסוף בסיסי, ומזריקים 5-10 pL של תערובת הכתבים.
  8. דגירה ביציות במדיום התבגרות עם 1 μM cilostamide עבור 16 שעות כדי לאפשר את אות mCherry לרמה.
  9. הכינו צלחת פטרי שתשמש למיקרוסקופיה של זמן לשגות עם לפחות שתי טיפות 20 μL של מדיום התבגרות לכל כתב מוזרק: טיפה אחת עם 1 μM cilostamide לשליטה פרופאז אני נעצר ביציות טיפה אחת ללא cilostamide עבור ביציות התבגרות. מכסים את הטיפות בשמן מינרלי קל ומניחים באינקובטור.
3. מיקרוסקופיה של זמן לשגות
  1. לאחר הדגירה המוקדמת, להסיר את ביציות מוזרק מן החממה, ולשטוף אותם ארבע פעמים במדיום התבגרות ללא cilostamide. שמור כמה ביציות במדיום התבגרות עם 1 μM cilostamide כקבוצת ביקורת oocyte 1-נעצר פציצות.
  2. מעבירים את ביציות מוזרק טיפות בהתאמה שלהם על צלחת מיקרוסקופ זמן לשגות שהוכן בעבר. Cluster את ביציות באמצעות פיפטה זכוכית סגורה (פיפטה סגורה ניתן להכין על ידי החזקת הקצה בלהבה במשך כמה שניות).
    הערה: קיבוץ באשכולות של ביציות מסייע במניעת תנועתן במהלך ההקלטה.
  3. מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ המצוידת במערכת תאורת דיודה פולטת אור ובמה ממונעת המצוידת בתא סביבתי המתוחזק ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO_2. כדי לשכפל מחקר זה, השתמש בפרמטרים הבאים: ערכת מסננים: שיקוף dichroic YFP / CFP / mCherry 69008BS; ערוץ YFP (עירור (לשעבר): S500/20 × 49057; פליטה (EM): D535/30 m 47281), mערוץ שרי (לשעבר: 580/25 × 49829; אם: 632/60 מטר).
  4. הזן את ההגדרות המתאימות לניסוי זמן לשגות (ראה טבלה של חומרים עבור התוכנה המשמשת במחקר זה): לחץ על יישומים | רכישה רב ממדית. בחר את הכרטיסיה הראשית הראשונה ובחר timelapse, מיקומי שלבים מרובים, ו אורכי גל מרובים.
  5. בחר את הכרטיסיה שמירה כדי להזין את המיקום שבו יש לשמור את הניסוי.
  6. בחר את הכרטיסיה Timelapse כדי להזין את מספר נקודות הזמן, משך הזמן ומרווח הזמן.
    הערה: משך הניסוי תלוי במינים החייתיים שנחקרו, שכן התזמון של התבגרות מיוטית ביצית שונה בין מינים. בניסוי זה עם ביציות עכבר, ביציות נרשמו כל 15 דקות במשך 16 שעות.
  7. בחר את שלבהכרטיסיה . הפעל את brightfield ואתר את מיקום ביציות על-ידי פתיחת חלון חדש על-ידי בחירה באפשרות רכוש | רכישת | הצג בשידור חי. לאחר איתור ביציות, חזור לחלון רכישה רב-ממדית והקש + כדי להגדיר את מיקום ביציות.
  8. בחר את אורכי הגלשל הכרטיסיה והגדר 3 אורכי גל שונים עבור brightfield (חשיפה 15 אלפיות השנייה), YFP (חשיפה של 150 אלפיות השנייה עבור UTR Ypet/IL7 3' ) ו- mCherry (חשיפה של 75 אלפיות השנייה עבור UTR Ypet/IL7 3').
    הערה: התאם את החשיפה עבור כל כתב UTR Ypet/3' בהתבסס על רמת הצטברות הכתבים ונפח ההזרקה. ודא שאות YFP נופל במרכז טווח הזיהוי בתחילת הניסוי כדי למנוע הערכת חסר או רוויה במקרה של הפעלת תרגום. עבור mCherry, להתאים את החשיפה עבור כל אצווה של mCherry כמו האות תלוי במספר נוקלאוטידים אדנין שנוספו במהלך הליך polyadenylation. בגלל השונות ביעילות פוליאדנילציה, להשתמש באותה אצווה של mCherry בניסויים שונים להשוואה טובה יותר בין ניסויים.
  9. התחל את ניסוי לשגות זמן על ידי לחיצה על לרכוש. ראו איור 2 והקובץ המשלים לקבלת דוגמה להקלטה של זמן לשגות ביצית אחת.
4. ניתוח תרגום UTR של Ypet-3'
  1. לניתוח זה (ראה טבלת חומרים עבור התוכנה המשמשת במחקר זה), בצע שתי מדידות אזור עבור כל ביצית: ביצית עצמה-לחץ על אזור אליפסה להקיף את ביצית- ואזור קטן קרוב ביצית לשמש חיסור רקע-לחץ על אזור מלבני.
    הערה: ודא כי ביציות לא לצאת מהאזור שנבחר במהלך הקלטת זמן לשגות. שים לב במיוחד למיקום מדידת האזור סביב שחול גוף הקוטב, שכן הדבר גורם לתנועה ביצית ועלול לעוות את ההקלטה.
  2. יצא את נתוני מדידת האזור לגיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה תחילה על פתח יומן רישום ולאחר מכן על רשום נתונים כדי לייצא את תוכנת ניתוח הנתונים.
  3. עבור כל ביצית בודדת ועבור כל נקודות הזמן הנמדדות, הפחת את מדידת אזור הרקע ממדידת אזור ביצית. עשה זאת עבור אורכי גל של YFP ו- mCherry בנפרד.
  4. רשום את התזמון של התמוטטות ורידים נביטיים (GVBD) והבלטת גוף הקוטב (PBE) לעיון מאוחר יותר.
    הערה: אל תכלול ביציות עכבר מתבגרות כאשר GVBD עולה על 2 שעות.
  5. התווה ביטוי YFP ו- mCherry לאורך זמן עבור כל ביצית כדי לבדוק חריגים.
    הערה: זו צריכה להיות עקומה חלקה, אם זה לא זה עשוי להצביע על כך ביצית זז במהלך ההקלטה.
  6. עבור כל ביצית בודדת, חשב ביטוי mCherry ממוצע עבור עשר נקודות הזמן האחרונות של ההקלטה. עבור כל נקודת זמן, חלק את ביטוי YFP בביטוי mCherry הממוצע לביטוי mCherry לתיקון עבור אמצעי אחסון מוזרק כדי להשיג יחס YFP/mCherry בכל נקודת זמן עבור כל ביצית בודדת.
  7. חשב שיעורי תרגום עבור מרווח זמן מסוים על-ידי התאמת שיפוע העקומה על-ידי רגרסיה ליניארית. להעריך את ההבדלים בשיעורי התרגום באמצעות מסקנה סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Denuded prophase אני נעצר ביציות של עכברי C57/BL6 בן 21 יום הוזרקו עם תערובת כתב המכיל mRNA קידוד כתב Ypet התמזגו 3 ' UTR של IL-7 ו mRNA קידוד mCherry. YFP ו- mCherry expression נרשמו ב-39 ביציות, מתוכן 30 התבגרו, ו-9 נעצרו בהפצה I כשליטה שלילית. שלושה ביציות התבגרות לא נכללו לניתוח כי הם גם היו GVBD מעוכב (N = 2) או הועבר בצלחת במהלך ההקלטה (N = 1). איור 3 מציג את ביטוי mCherry ו- YFP בפרופאז I וביצית התבגרות. איור 4 מציג ביטוי YFP של ביציות התבגרות מתוקן עבור ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המוצגת מתארת אסטרטגיה ללמוד הפעלה והדחקה של תרגום mRNA היעד במעברים שונים במהלך התבגרות מיוטית במבחנה ביצית. IL-7, ציטוקינים שפורסמו על ידי ביצית שעשויים להיות מעורבים בתקשורת תא ביצית⁸^,¹³, נבחר לצורך תיאור שיטה זו. IL-7 ידוע להיות מתורגם יותר ויותר במהלך התבגרות ביצית⁸ ומאפשר הדמיה טובה של הפעלה תרגום בשיטה זו. עם זאת, אם התרגום מתרחש בקצב קבוע לאורך כל הניסוי, הצטברות של כתב תעקוב אחר דפוס ליניארי, ושיעורי התרגום בתחילת הנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM097165, GM116926 ו יוניס קנדי שרייבר NICHD המרכזים הלאומיים למחקר תרגום רבייה ועקרות P50 HD055764 למרקו קונטי. אנריקו מ. דלדלו נתמך על ידי מלגת קרן לור ונטסיה ג'יי קוסטרמן נתמכה על ידי מלגת רוביקון מארגון המחקר המדעי של הולנד (NWO).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>הכנת מדיה
אבקת אלבומין סרום בקר Bioxtra	Sigma-Aldrich	SIAL-A3311
Cilostamide	EMD Millipore	231085
MEM alpha	Gibco	12561-056
Minimum Essential Medium Eagle	תמיסת Sigma-Aldrich	M2645
פניצילין-סטרפטומיצין 100x, מסוננת סטרילית	Genesee Scientific Corporation (GenClone)	25-512
נתרן ביקרבונט	JT-Baker	3506-1
נתרן פירובט	Gibco	11360-070
מים מזוקקים אולטרה-טהורים	Invitrogen	10977-015
<חזק>הכנת mRNA המקודד YFP/3' UTR ו-mCherry
Agarose	Apex Biomedical	20-102QD
מלח דיסודיום קרבניצילין	סיגמא-אולדריץ'	C1389-1G
ערכת שיבוט צ'ו-צ'ו	McLab	CCK-20
CutSmart Buffer (10x)	ניו אינגלנד Biolabs	B7204
צבע טעינת DNA (6x)	Thermo Scientific	R0611
dNTP פתרון	ניו אינגלנד Biolabs	N0447S
DpnI	ניו אינגלנד Biolabs	R0176
GeneRuler 1 kb סולם DNA	תרמו פישר	SM1333
LB צלחות אגר עם 100 ומיקרו; גרם/מ"ל קרבניצילין, טקנובה	Teknova	L1010
LB בינוני (כמוסות)	MP ביומדיקל	3002-021
MEGAclear ערכת ניקוי תמלול	Life Technologies	AM1908
MfeI-HF אנזים הגבלת	ניו אינגלנד Biolabs	R3589
mMESSAGE mMACHINE T7 ערכת תמלול	Invitrogen	AM1344
Phusion DNA בנאמנות גבוהה פולימראז	ניו אינגלנד ביולאבס	M0530
פולי (A) ערכת זנב	Invitrogen	AM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick ערכת מיצוי ג'ל	Qiagen	28704
S.O.C.	בינוני תרמו פישר	15544034
מאגר TAE	אייפקס ביומדיקל	20-193
Ultrapure Ethidium Bromide Solution	Life Technologies	15585011
<חזק>אוסף ביציות
מכלול צינור שואב למיקרו-פיפטות מכוילות	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
מיקרו-פיפטות מכוילות	Drummond Scientific Company	2-000-025
PMSG- 5000	Mybiosource	MBS142665
מחט PrecisionGlide 26 גרם x 1/2	BD	מזרק 305111
1 מ"ל	BD	309659
<חזק>הזרקת ביצית מיקרו
35 מ"מ \| כיסוי מס' 0 \| קוטר זכוכית 20 מ"מ \| לא מצופה	MatTek	P35G-0-20-C	למיקרוסקופיה זמן-lapse
זכוכית בורוסיליקט עם נימה	מכשיר סאטר	BF100-78-10
שמן לתרבית עוברים	Irvine Scientific	9305
פטרי	צלחת פלקון	351006	למיקרו-הזרקה
צלחת תרבית רקמות	פלקון	353001	לדגירת ביציות
VacuTip Holding Capillary	Eppendorf	5195000036
Software
Biorender	BioRender		הכנת
1S MetaMorph, גרסה 7.8.13.0	התקנים מולקולריים		למיקרוסקופ זמן-lapse, ניתוח של תרגום UTR 3'

איור

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399(2020).
Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333(2018).
Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302(2013).
Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Oocyte Maturation Single Oocyte Assay Reporter Accumulation Time Lapse Microscopy Oocyte Injection Cumulus Oocyte Complex Translation Regulation YFP mCherry Ratio

הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים