פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית כדי ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNA ביציות בודדות במהלך התבגרות במבחנה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד
במאמר זה
סיכום
תקציר
אירועים הקשורים התבגרות גרעינית ביצית תוארו היטב. עם זאת, הרבה פחות ידוע על המסלולים המולקולריים והתהליכים המתרחשים בציטופלסמה כהכנה להפריה ורכישה של totipotency. במהלך התבגרות ביצית, שינויים בביטוי גנים תלויים אך ורק בתרגום והשפלה של RNAs שליח אימהי (mRNAs) ולא על שעתוק. ביצוע תוכנית התרגום, אם כן, ממלא תפקיד מפתח בביסוס יכולת התפתחותית ביצית לקיים התפתחות עובר. מאמר זה הוא חלק מהתמקדות בהגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי המתרחשת במהלך התבגרות מיוטית ובמעבר ביצית לזיגוטה. במאמר שיטה זו, מוצגת אסטרטגיה ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNAs היעד במהלך התבגרות ביצית במבחנה. כאן, כתב Ypet הוא התמזגו לאזור 3' לא מתורגם (UTR) של הגן של עניין ולאחר מכן מיקרו מוזרק לתוך ביציות יחד עם קידוד mRNA polyadenylated עבור mCherry לשלוט עבור נפח מוזרק. על ידי שימוש במיקרוסקופיה של זמן לשגות כדי למדוד הצטברות כתב, שיעורי התרגום מחושבים במעברים שונים במהלך התבגרות מיוטית ביצית. כאן תוארו הפרוטוקולים לבידוד והזרקה של ביציות, הקלטת זמן לשגות וניתוח נתונים, באמצעות כתב UTR Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' כדוגמה.
מבוא
ביצית יונקים בוגרת עוברת שינויים מהירים כהכנה להפריה ורכישה של טוטיפופוטנציה. שינויים אלה חיוניים כדי לקיים התפתחות עוברית לאחר ההפריה. למרות האירועים הקשורים התבגרות גרעינית מתוארים היטב יחסית, הרבה פחות ידוע על התהליכים המולקולריים ואת המסלולים בציטופלסמה ביצית. במהלך השלבים הסופיים של התבגרות ביצית, ביציות שקטות שעתוק, וביטוי גנים תלוי לחלוטין בתרגום mRNA והשפלה1,2. הסינתזה של חלבונים קריטיים ליכולת התפתחותית, אם כן, מסתמכת על תוכנית של תרגום מתוזמן של mRNAs ארוכי טווח שעברו סינתזה מוקדם יותר במהלך צמיחת ביצית1,3. כחלק מהתמקדות בהגדרת תוכנית זו של ת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ההליכים הניסיוניים שבהם מעורבים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (פרוטוקול AN182026).
1. הכנת אמצעי תקשורת
- הוסף את כל הרכיבים, כמתואר בטבלה 1, כדי להפוך את אוסף ביציות הבסיסי בינוני בינוני התבגרות ביצית בינוני. עבור מדיום האוסף הבסיסי, הגדר את ה- pH ל- 7.4. עבור מדיום איסוף והתבגרות, להוסיף 3 מ"ג / מ"ל של אלבומין סרום שור (BSA) ו 1 μM cilostamide ביום השימוש.
2. הכנת קידוד mRNA עבור UTR של Ypet-3' ו- mCherry
- להשיג את 3′ רצפי UTR של mRNAs של עניין.
הערה: עבור מחקר זה, רצפים התקבלו בעבר מן העכבר ביצית cD....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Denuded prophase אני נעצר ביציות של עכברי C57/BL6 בן 21 יום הוזרקו עם תערובת כתב המכיל mRNA קידוד כתב Ypet התמזגו 3 ' UTR של IL-7 ו mRNA קידוד mCherry. YFP ו- mCherry expression נרשמו ב-39 ביציות, מתוכן 30 התבגרו, ו-9 נעצרו בהפצה I כשליטה שלילית. שלושה ביציות התבגרות לא נכללו לניתוח כי הם גם היו GVBD מעוכב (N = 2) או הועבר בצלחת במהלך ההקלטה (N = 1). איור 3 מציג את ביטוי mCherry ו- YFP בפרופאז I וביצית התבגרות. איור 4 מציג ביטוי YFP של ביציות התבגרות מתוקן עבור .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה המוצגת מתארת אסטרטגיה ללמוד הפעלה והדחקה של תרגום mRNA היעד במעברים שונים במהלך התבגרות מיוטית במבחנה ביצית. IL-7, ציטוקינים שפורסמו על ידי ביצית שעשויים להיות מעורבים בתקשורת תא ביצית8,13, נבחר לצורך תיאור שיטה זו. IL-7 ידוע להיות מתורגם יותר ויותר במהלך התבגרות ביצית8 ומאפשר הדמיה טובה של הפעלה תרגום בשיטה זו. עם זאת, אם התרגום מתרחש בקצב קבוע לאורך כל הניסוי, הצטברות של כתב תעקוב אחר דפוס ליניארי, ושיעורי התרגום בתחילת הנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM097165, GM116926 ו יוניס קנדי שרייבר NICHD המרכזים הלאומיים למחקר תרגום רבייה ועקרות P50 HD055764 למרקו קונטי. אנריקו מ. דלדלו נתמך על ידי מלגת קרן לור ונטסיה ג'יי קוסטרמן נתמכה על ידי מלגת רוביקון מארגון המחקר המדעי של הולנד (NWO).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>הכנת מדיה | |||
| אבקת אלבומין סרום בקר Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | תמיסת Sigma-Aldrich | M2645 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין 100x, מסוננת סטרילית | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| נתרן ביקרבונט | JT-Baker | 3506-1 | |
| נתרן פירובט | Gibco | 11360-070 | |
| מים מזוקקים אולטרה-טהורים | Invitrogen | 10977-015 | |
| <חזק>הכנת mRNA המקודד YFP/3' UTR ו-mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| מלח דיסודיום קרבניצילין | סיגמא-אולדריץ' | C1389-1G | |
| ערכת שיבוט צ'ו-צ'ו | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | ניו אינגלנד Biolabs | B7204 | |
| צבע טעינת DNA (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP פתרון | ניו אינגלנד Biolabs | N0447S | |
| DpnI | ניו אינגלנד Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb סולם DNA | תרמו פישר | SM1333 | |
| LB צלחות אגר עם 100 ומיקרו; גרם/מ"ל קרבניצילין, טקנובה | Teknova | L1010 | |
| LB בינוני (כמוסות) | MP ביומדיקל | 3002-021 | |
| MEGAclear ערכת ניקוי תמלול | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF אנזים הגבלת | ניו אינגלנד Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 ערכת תמלול | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion DNA בנאמנות גבוהה פולימראז | ניו אינגלנד ביולאבס | M0530 | |
| פולי (A) ערכת זנב | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick ערכת מיצוי ג'ל | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. | בינוני תרמו פישר | 15544034 | |
| מאגר TAE | אייפקס ביומדיקל | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| <חזק>אוסף ביציות | |||
| מכלול צינור שואב למיקרו-פיפטות מכוילות | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| מיקרו-פיפטות מכוילות | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| מחט PrecisionGlide 26 גרם x 1/2 | BD | מזרק 305111 | |
| 1 מ"ל | BD | 309659 | |
| <חזק>הזרקת ביצית מיקרו | |||
| 35 מ"מ | כיסוי מס' 0 | קוטר זכוכית 20 מ"מ | לא מצופה | MatTek | P35G-0-20-C | למיקרוסקופיה זמן-lapse |
| זכוכית בורוסיליקט עם נימה | מכשיר סאטר | BF100-78-10 | |
| שמן לתרבית עוברים | Irvine Scientific | 9305 | |
| פטרי | צלחת פלקון | 351006 | למיקרו-הזרקה |
| צלחת תרבית רקמות | פלקון | 353001 | לדגירת ביציות |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | הכנת | |
| 1S MetaMorph, גרסה 7.8.13.0 | התקנים מולקולריים | למיקרוסקופ זמן-lapse, ניתוח של תרגום UTR 3' |
מקורות
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigati....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
