הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקירת הסתיידות שסתום אבי העורקים באמצעות בידוד ותרבות של לימפוציטים T באמצעות תאי מאכיל ממעיל באפי מוקרן

3.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62059

⸱

4 בפברואר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Campus Benjamin Franklin, Charité Universitätsmedizin Berlin and German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), 2Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Berlin Institute of Health, 4Department of Cardiology, German Heart Centre Berlin (DHZB), 5Sod of Interdisciplinary Internal Medicine, Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi (AOUC), 6Department of General and Interventional Cardiology, Helios Klinikum Erfurt

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

במחקר זה, אנו מתארים את התהליך של בידוד לימפוציטים T מדגימות טריות של שסתומי אבי העורקים מסוידים ואת השלבים האנליטיים של שיבוט תאי T לאפיון של תת קבוצות לויקוציטים אדפטיביים באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה.

תקציר

מחלת שסתום אבי העורקים מסוידת (CAVD), תהליך מחלה פעיל החל עיבוי קל של השסתום להסתיידות חמורה, קשורה לתמותה גבוהה, למרות אפשרויות טיפוליות חדשות כגון החלפת שסתום אבי העורקים transcatheter (TAVR).

המסלולים המלאים שמתחילים בהסתיידות שסתום ומובילים לה היצרות אבי העורקים חמורה נשארים מובנים רק חלקית. על ידי מתן ייצוג הדוק של תאי שסתום אבי העורקים ב vivo, בדיקת לימפוציטים T מרקמת שסתום סטנוטית יכולה להיות דרך יעילה להבהיר את תפקידם בהתפתחות של הסתיידות. לאחר כריתה כירורגית, דגימת שסתום אבי העורקים הטרי מנותחת בחתיכות קטנות ואת לימפוציטים T הם מתורבתים, משובטים ואז מנותחים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS).

הליך הכתמים הוא פשוט ואת צינורות מוכתמים ניתן גם לתקן באמצעות 0.5% של paraformaldehyde וניתח עד 15 ימים מאוחר יותר. התוצאות שנוצרו מלוח הכתמים ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר שינויים בריכוזים תאי T לאורך זמן ביחס להתערבות, יכול בקלות להיות מפותח עוד יותר כדי להעריך מצבי הפעלה של תת סוגים ספציפיים של תא T של עניין. במחקר זה, אנו מראים את הבידוד של תאי T, המבוצע על דגימות שסתום אבי העורקים מסויד טרי ואת השלבים של ניתוח שיבוטים תא T באמצעות cytometry זרימה כדי להבין עוד יותר את התפקיד של חסינות אדפטיבית בפתופיזיולוגיה CAVD.

מבוא

מחלת שסתום אבי העורקים קלציפי (CAVD) היא אחת ההפרעות הנפוצות ביותר שסתום הלב, עם השפעה כבדה על הבריאות. תדירות החלפת שסתום אבי העורקים בשנים האחרונות גדלה באופן דרמטי וצפויה לגדול עוד יותר, בשל הגידול באוכלוסיית הקשישים1.

הפתופיזיולוגיה הבסיסית של CAVD ידועה רק באופן חלקי והאסטרטגיות הטיפוליות הנוכחיות מוגבלות לצעדים שמרניים או להחלפת שסתום אבי העורקים, בין אם באמצעות הליכים כירורגיים או עוריים. עד כה, שום טיפול רפואי יעיל לא יכול לעכב או להפוך התקדמות CAVD ותמותה גבוהה קשורה עם הופעת סימפטום מוקדם, אלא אם כן החלפת שסתום אבי העורקים (AVR) מבוצעת2. בחולים עם היצרות חמורה של כאבי העורקים, הישרדות ללא תסמינים 3 שנים דווח נמוך כמו 20%3. החלפת שסתום אבי העורקים Transcatheter (TAVR) מייצגת אפשרות חדשה, מהפכה בטיפול בחולים בסיכון גבוה, במיוחד בקרב קשישים וצמצמה באופן דרמטי את התמותה, שהייתה גבוהה באופן מהותי באוכלוסייה זו4,5,6. למרות התוצאות המבטיחות של TAVR, דרוש מחקר נוסף כדי להבין פתופיזיולוגיה CAVD כדי לזהות מטרות טיפוליות מוקדמות חדשניות7,8,9.

בעבר נחשב תהליך פסיבי, ניווני, CAVD מוכר כעת כמחלה מתקדמת פעילה, המאופיינת על ידי מתג פנוטיפ osteoblastic של תאים interstitial שסתום אבי העורקים10. מחלה זו כרוכה מינרליזציה מתקדמת, שינויים פיברוקליפיים ותנועתיות מופחתת של עלוני שסתום אבי העורקים (טרשת), אשר בסופו של דבר לחסום את זרימת הדם המובילה היצרות (היצרות) של פתח שסתום אבי העורקים11.

דלקת נחשבת תהליך מפתח בפתופיזיולוגיה CAVD, בדומה לתהליך של טרשת עורקים וסקולרית. פגיעה אנדותל מאפשרת תצהיר והצטברות של מינים שומנים בדם, במיוחד ליפופרוטאינים מחומצנים בשסתום אבי העורקים12. ליפופרוטאינים מחומצנים אלה מעוררים תגובה דלקתית, שכן הם ציטוטוקסיים, עם הפעילות הדלקתית המובילה מינרליזציה. תפקידה של חסינות מולדת ומסתגלת בהתפתחות CAVD והתקדמות המחלה הודגש לאחרונה13. ההפעלה וההרחבה של תת-קבוצות ספציפיות של תאי T זיכרון תועדו בחולים עם CAVD ועלוני שסתום אבי העורקים מינרליזציה, כך שתהליכים דלקתיים מניחים להיות מעורבים לפחות בפיתוח של CAVD וככל הנראה בהתקדמות המחלה גם כן14. למעשה, למרות תאים אנטיגן מציג מקרופאגים נמצאים הן שסתום בריא ומחלות, נוכחות של לימפוציטים T מעידה על שסתום אבי העורקים מיושן וחולים. לימפוציטים זה לחדור יחד עם עלייה ניאווסקולריזציה מטאפלזיה אופייניים סימנים היסתולוגיים של CAVD15.

אנו משערים את קיומה של אינטראקציה בין תאי ביניים שסתום אבי העורקים ואת ההפעלה של המערכת החיסונית, אשר פוטנציאל מפעיל את תחילתו של תהליך דלקתי כרוני בשסתום אבי העורקים. בדיקת תאי T מרקמת שסתום אבי העורקים stenotic יכולה להיות דרך יעילה להבהיר את תפקידם בהתפתחות הסתיידות, שכן היא יכולה לספק ייצוג הדוק של תאי שסתום אבי העורקים ב vivo. בעבודה הנוכחית, באמצעות רקמת שסתום אבי העורקים, אנו מבודדים לימפוציטים T, תרבות לשכפל אותם, ולאחר מכן לאפיין אותם באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטית (FACS). דגימות שסתום אבי העורקים טריים נכרתו מחולי CAVD שקיבלו החלפת שסתום כירורגי להיפוך אבי העורקים החמור. לאחר כריתת הכירורגיה, דגימת השסתום הטרי נותחה בחתיכות קטנות ותאי ה- T היו בתרבית, שוכפלו ואז נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה. הליך הכתם הוא פשוט ואת הצינורות מוכתמים ניתן לתקן באמצעות 0.5% של paraformaldehyde וניתח עד 15 ימים מאוחר יותר. הנתונים שנוצרו מלוח הכתמים יכולים לשמש כדי לעקוב אחר שינויים בהתפלגות לימפוציטים T לאורך זמן ביחס להתערבות, ניתן לפתח בקלות עוד יותר כדי להעריך מצבי הפעלה של תת-קבוצות ספציפיות של תאי T של עניין.

מיצוי של רקמה מסוידת, בידוד של לויקוציטים מרקמה מסוידת ובמיוחד השימוש בציטומטריית זרימה על סוג זה של רקמה יכול להיות מאתגר, בשל בעיות כגון autofluorescence. פרסומים מעטים קיימים בפרוטוקולים למטרה ספציפית זו16,17,18. כאן אנו מציגים פרוטוקול שתוכנן במיוחד לבידוד ישיר ותרבות של לימפוציט T מדגימות שסתום אבי העורקים האנושי. הרחבת כלין של לימפוציטים היא סימן היכר של חסינות אדפטיבית. לימוד תהליך זה במבחנה מספק מידע תובנה על רמת הטרוגניות הלימפוציטים19. לאחר תקופת דגירה של שלושה שבועות, שיבוטי תאי T מוכנים להסבר, שכן הושגה כמות מספקת של תאי T מכל שיבוט, כדי לאפשר את המחקר הפנוטיפי והתפקודי. לאחר מכן הפנוטיפ של שיבוטי T נחקר על ידי ציטפלואורומטריה.

פרוטוקול אימונולוגי זה הוא התאמה של שיטה שפותחה בעבר על ידי Amedei et al. לבידוד תאי T ואפיון מרקמה אנושית, המיועדת במיוחד לרקמה אנושית מסוידת, כגון CAVD20,21,22. הפרוטוקול כאן לבידוד של PBMCs (תאים מונונוקלאריים בדם היקפי) באמצעות מעיל באפי מוקרן מתאר דרך יעילה להשיג תאי מאכילה (FC), המותאמים במיוחד לשלב השיבוט של לימפוציטים T מבודדים מתאי ביניים שסתום. שכבת המאכיל מורכבת מתאים עצורים בצמיחה, שעדיין הם בני קיימא וביואקטיביים. התפקיד של תאי מאכיל חשוב כדי לתמוך בהישרדות במבחנה וצמיחה של לימפוציטים T מבודדים תאים ביניים שסתום23. על מנת למנוע התפשטות תאי הזנה בתרבית, תאים אלה חייבים לעבור מעצר גדילה. זה יכול להיות מושגת בשתי דרכים: באמצעות שיטות פיזיות כגון הקרנה, או באמצעות טיפול עם כימיקלים ציטוטוקסיים, כגון mitomycin C (MMC), אנטיביוטיקה אנטיטומורלית שניתן ליישם ישירות על פני השטח התרבותיים24. כאן אנו מראים מעצר צמיחה תא מאכיל שהושג באמצעות הקרנת תאים.

שיטה זו מציגה דרך יעילה וחסכונית לבודד ולאפיין תאי T מרקמת שסתום אבי העורקים, התורמת להרחבת הספקטרום של שיטות אימונולוגיות לחקר פתופיזיולוגיה CAVD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר נערך על פי חוקת הצדקה להבטחת פרקטיקה מדעית טובה וכובדו ההנחיות וההוראות המשפטיות בנושא פרטיות ואתיקה. ועדת האתיקה אישרה את כל הניסויים בבני אדם והפרטיות והאנונימיות של המטופלים נשמרו בהתאם לכללים המדווחים בטופס האתי.

הערה: עבור הפרוטוקול המתואר להלן דגימות שסתום סטאוטי אנושי טרי שימשו.

1. הכנת ריאגנט

  1. הכן את RPMI מועשר מדיום מלא על ידי הוספת RPMI 1640 בינוני: חומצות אמינו לא חיוניות; נתרן פירובט, L- גלוטמין, ß-Mercaptoethanol ופניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטו אחרונים). סנן אותו לפני השימוש. יש לאחסן ב-+4 מעלות צלזיוס ולהשתמש תוך חודשיים.
  2. הכן את המדיום של תרבית התא (CCM) לשלב השיבוט באמצעות סרום בקר עוברי מועשר 1640 בינוני הוסיף חום (FBS), בינוני בזאלי HB, 50 U של Interleukin 2 (IL-2) וסרום אנושי (HS). סנן ולהשתמש בו בתוך יום. אל תאחסן.
  3. הכן את המדיום של תרבית התא לשלב ההזנה מחדש באמצעות המדיום המועשר RPMI 1640 עם תוספת FBS, בינוני בזאלי HB, 30 U של IL-2 ו- HS. סנן ולהשתמש בו בתוך יום. אל תאחסן.
  4. הכן את מאגר הכביסה המכיל 250 מ"ל של RPMI ו 5 מ"ל עט / סטרפטופון. יש לאחסן ב-+4 °C (7°F), יש להשתמש תוך חודשיים.

2. בידוד לימפוציטים T אנושי ותרבות לתוך T-25 צלוחיות

  1. מניחים את דגימת השסתום הסטאוטי לתוך צלחת פטרי סטרילית מלאה חוצץ לשטוף, להבטיח כי מדגם השסתום כולו מכוסה בו. תן לעמוד במשך 15 דקות.
  2. חותכים את השסתום הסטoטי לחתיכות קטנות באמצעות אזמל ולתת לו לעמוד שוב במשך 10 דקות.
  3. הכן את המדיום של תרבית התא עם 50 U של IL-2, כפי שתואר בעבר, וסנן אותו.
  4. מוסיפים את CCM בתוך צלוחיות T25 ושימוש צבת פלסטיק סטרילי, מניחים את חתיכות השסתום בתוך הבקבוקונים.
  5. לאחסן את הבקבוקונים במיקום אנכי בתוך אינקובטור CO2 במשך שבוע אחד, תוך כדי דאגה להתבונן במצב הבקבוקון מתחת למיקרוסקופ. שיבוטים של תאי T צריכים להיות גלויים כשלושה ימים לאחר שלב התרבות; לתצפית טובה יותר מומלץ למקם את הבקבוקונים במצב אופקי במשך 20 דקות לפני הניתוח המיקרוסקופי.
    הערה: כמות המדיום של תרבית התא תלויה בכמות המדגם הקיימת ובכמה צלוחיות T25 ישמשו. בהתחשב בכך שכל פיסת שסתום דורש 10 מ"ל של CCM בתוך בקבוקון, 25 מ"ל של CCM בבקבוק T25 מתאים 3 חתיכות של שסתום.

3. שלב השיבוט

הערה: עבור שלב השיבוט של תאי T, יש צורך להתחיל עם בידוד של תאי מאכיל ממעיל באפי מוקרן (BC), בעקבות פרוטוקול PBMCs.

  1. פתח את שקית BC מתחת למכסה המנוע זרימה למינאר באמצעות ספייק שקית עם שסתום ללא מחט ולהעביר 50 מ"ל של דם בבקבוק T150. הוסף 70 מ"ל של PBS כדי לדלל דם בתוך הבקבוקון.
  2. קח ארבעה צינורות חרוט 50 מ"ל ומניחים 20 מ"ל של צפיפות הדרגתית בינונית בכל שכבה בזהירות 30 מ"ל של דם על זה.
  3. צנטריפוגה למשך 25 דקות ב 800 x g ו 20 °C (70 °F) עם הבלם כבוי.
  4. שאפו בזהירות את הסופר-טבעי והשליכו אותו כפסולת. לאסוף את טבעת PBMCs בצינור חרוטי 50 מ"ל חדש הוספת בתוך פתרון PBS עד נפח של 50 מ"ל.
  5. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (50 °F).
  6. השלך את supernatant ולהשעות את הכדור על ידי הוספת בתוך פתרון PBS עד נפח של 50 מ"ל. חזור על שלב צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (70 °F).
  7. השלך את supernatant ולהשעות את FCs ב 10 מ"ל של תרבות התא בינוני.
  8. קח צינור אוסף חדש לדלל את FCs עם PBS 1:10 על ידי הוספת בתוך 9.9 מ"ל של PBS ו 100 μL מהצינור עם FCs ומדיום תרבית התא. לשטוף היטב עם pipette ולקחת 7 μL מן הדילול הזה ולספור את התאים מתחת למיקרוסקופ.
  9. הכן את המדיום תרבית התא לשלב השיבוט: 70 מ"ל עם 50 U של IL-2, ולאחר מכן לחלק אותו לשני צינורות חרוטיים 50 מ"ל, כל צינור יכיל 25 מ"ל של מדיום תרבית התא, כמתואר להלן:
    • צינור 1: 25 מ"ל של CCM + FCs + 0.6% של פיטוהמגלוטינין (PHA)
    • צינור 2: 25 מ"ל של לימפוציטים CCM + T
      הערה: המטרה של שיטת PMBCs היא להשיג 2 x 106 תאים עבור כל מ"ל, ולכן 25 מ"ל של CCM מוכן (Tube 1) צריך להיות מחושב בהתאם. הנוסחה הכללית בה נעשה שימוש היא: מספר התאים שנספרו x 106: 1 מ"ל = CCM x 106: X

4. תרבות לימפוציטים T בצלחות רב-ווליות

  1. באמצעות pipette אלקטרוני, לאסוף את כל המדיום תרבית התא בתוך הבקבוקונים ולהעביר אותו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. הבקבוקונים הריקים יכולים להיזרק.
  2. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (70 °F).
  3. להשליך את supernatant, להשעות את הכדור ב 50 מ"ל של PBS ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (70 °F). חזור על שלב זה פעמיים.
  4. להשליך את supernatant ולהשעות את הכדור ב 1 מ"ל של CCM. קח 7 μL מהדיקול הזה וספור את התאים מתחת למיקרוסקופ.
    הערה: יש להכפיל את מספר התאים שנספרו עבור נפח התא ולהחלת דילול.
  5. המשך לדלל את התאים שנספרו מ 105 ל 103 במדיום תרבית התא ולאחר מכן לקחת 500 μL מ 103 ולשים אותו בתוך Tube 2.
  6. יוצקים את המדיום תרבית התא 25 מ"ל של Tube 1 בתוך צלחת פטרי פלסטיק 100 מ"מ x 15 מ"מ.
  7. קח ארבע צלחות multiwell התחתון 96 U ושימוש pipette רב ערוצי להגדיר 100 μL זרע FCs בכל באר.
  8. קח את Tube 2 ויוצקים את מדיום תרבית התא בתוך צלחת פטרי. באמצעות פיפטה רב ערוצית להגדיר 100 μL, זרע תאי T בכל באר.
  9. אחסן את הצלחות הרב-ווליות בתוך חממת CO2 למשך שבוע.

5. שלב ההזנה מחדש הראשון

  1. באמצעות שקית מעיל באפי מוקרן, בצע את שיטת PBMCs כדי להשיג FC כמתואר בשיטה הקודמת.
  2. הכן את הכמות המתאימה של CCM ללא PHA וסנן אותו.
  3. באמצעות pipette רב ערוצי, להסיר 100 μL מכל באר, להבטיח לא לגעת בתחתית הבאר.
  4. הוסף 100 μL של FCs בכל הבארות כמו שכבת האכלה כדי לספק חומרים מזינים תרבית התא ולשנות את המדיום.
    הערה: עבור כל multiwell מומלץ לשקול 6 מ"ל של CCM, כך הכמות המומלצת עבור 4 multiwells הוא כ 30 מ"ל. PHA (0.4% מכמות CCM הכוללת) צריך להתווסף ל- CCM אחת לשבועיים.

6. שלב ההזנה מחדש השני

  1. חזור על שלב ההזנה מחדש לאחר הקטע המתואר לעיל. יש להוסיף 0.4% PHA למדיום תרבית התאים.

7. שלב הפיצול הראשון מ 1 טוב / מדגם ל 2 בארות / מדגם

  1. בדוק את כל ארבעת multiwells תחת המיקרוסקופ וללכת קדימה פיצול בארות אלה עם שיבוטים תא T (TCCs).
  2. פעלו לפי פרוטוקול ה-PBMCs כדי לבודד תאי מאכילה משקית מעיל באפי מוקרן.
  3. הכן את המדיום תרבית התא עם 30 U של IL-2. הוסף את ה- FCs וקח צלחת מולטיוול חדשה 96-well עם תחתית U.
  4. באמצעות פיפטה להגדיר 100 μL, לשטוף היטב בתוך בארות של הדגימות שנבחרו ולחלק את 200 μL של נפח הכלול בכל באר לתוך 2 בארות חדשות של צלחת multiwell החדש, על מנת לקבל 100 μL של נפח עבור כל אחת 2 בארות החדשות.
  5. הוסף 100 μL של FCs בתוך כל הבארות החדשות. כל באר חייבת להכיל נפח כולל של 200 μL.
  6. הגדר את הצינור ב 100 μL ולהוסיף 100 μL לתוך שתי בארות נוספות, המכיל רק FCs לשמש כפקד.
    הערה: השתמש במיקרוסקופיה קלה כדי לבחון את כל הלוחות הרב-ווליים כדי לקבוע אילו בארות גידלו בהצלחה TCC. כדי להקל על בחירת השיבוטים, ניתן לבצע השוואה לפקד (שתי הבארות המכילות רק FCs), כאשר השיבוט נראה כהה וגדול יותר בהשוואה לפקד. בארות להיבחר הם אלה עם שיבוט גדול, ברור, עגול, עם לימפוציטים ארוזים בצפיפות יחד. אם אין TCCs נוכחים לאחר שבועיים של הזנה מחדש, מומלץ לחכות עוד שבוע אחד ולבצע שלב הזנה מחדש נוסף.

8. שלב הפיצול השני מ-2 בארות/דגימה ל-4 בארות/דגימה

  1. הגדר את הפיפטה ל 100 μL, לשטוף היטב בתוך שתי בארות של כל מדגם לזרוע שתי בארות חדשות של 100 μL עבור כל אחד.
  2. הכן את המדיום של תרבית התא עם 30 U של IL-2 ופעל לפי טכניקת ה- PBMCs כדי לחלץ את ה- FCs מתיק המעילים של באפי ולהניח את ה- FCs בתוך ה- CCM.
  3. הגדר את הפיפטה ל 100 μL ולזרוע את FCs בכל הבארות. אחסן את multiwells בחממה CO2 במשך שבוע אחד.

9. שלב הפיצול השלישי מ-4 בארות/דגימה ל-8 בארות/דגימה:

  1. באמצעות פיפטה רב ערוצית להגדיר 100 μL, לשטוף היטב בתוך כל ארבע בארות של כל מדגם לזרוע 100 μL לתוך כל אחת מארבע בארות חדשות בצלחת חדשה 96 טוב.
  2. הכן את המדיום של תרבית התא ובצע את טכניקת ה- PBMCs כדי לחלץ את ה- FCs משקית מעיל באפי מוקרן.
  3. מקם את ה- FCs בתוך CCM. הגדר את הפיפטה ל 100 μL ולזרוע את FCs בכל הבארות. אחסן את multiwells בחממה CO2 במשך שבוע אחד

10. ניתוח ציטופלואורימטרי

  1. קח את צלחת multiwell עם התאריך העתיק ביותר מן החממה CO2 ולזהות את צינורות האיסוף עם מספרי המדגם לנתח.
  2. באמצעות פיפטה רב ערוצית להגדיר 200 μL עם 2 טיפים, לשטוף ביסודיות בתוך שתי בארות של אותה מדגם ולשים את שניהם בתוך אותו צינור אוסף. חזור על שלב זה עבור כל הדגימות.
    הערה: דגימות ה- FCs לא ינותחו, מכיוון שהן משמשות רק כפקדים.

11. הכנת לוח כתמי נוגדנים לניתוח ציטפלואורימטרי

  1. הוסף 1 מ"ל של פתרון PBS עבור כל צינור צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (70 °F).
  2. לאחר שלב הצנטריפוגה להשליך את supernatant.
    הערה: ניתן למצוא את לוח הכתמת הנוגדנים בטבלה 1. כל ריכוז נוגדנים יחיד מחושב הוא כ 2 μL / מדגם. מומלץ לסובב בקצרה את צינורות הנוגדנים לפני השימוש. כדי להגן על הנוגדנים המצומדים מפני פלואורופור מפני אור, כל השלבים צריכים להתבצע בחושך.
  3. הכן את תערובת הנוגדנים בתוך צינור 1.5 מ"ל ומערבולת זה.
  4. מוסיפים את הנוגדנים בתוך הדגימות ומשאירים דגימות לדגור בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
  5. הוסף 1 מ"ל של PBS בכל דגימה וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (70 °F).
  6. להשליך את supernatant ולהשעות את הכדור עם 500 μL של פתרון PBS.
  7. המשך בניתוח הציטופלואורימטרי (ניתוח FACS, טבלה 1).
    הערה: ניתן לתקן את הדגימות המוכתמות באמצעות 0.5% paraformaldehyde (PFA) מדולל בפתרון PBS וניתח עד 15 ימים מאוחר יותר.
    זהירות: PFA רעיל ויש לטפל בו בזהירות.
סמןפלואורופור
CD3PE/Cy7
CD4אלכסה פלור 488
CD8סגול מבריק 510
CD14סגול מבריק 421
CD25PE
CD45סגול מבריק 711

טבלה 1. לוח כתמי נוגדנים כדי לזהות את אוכלוסיית לימפוציטים T בהסתיידות מחלת שסתום אבי העורקים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השתמשנו בשיטה פשוטה וחסכונית כדי לאפיין את אוכלוסיית הלויקוציטים של דגימות שסתום אבי העורקים טריות שמקורן בחולים אנושיים עם היצרות שסתום אבי העורקים חמורה (עיין בפרוטוקול). השיטה לבידוד PBMCs היא צעד חיוני בהשגת תאי מאכילה, המשמשים בכל שלב של הניסוי (שיבוט, הזנה מחדש ופיצול שלבי) ומאפשרים זיהוי ואפיון של לויקוציטים חודרים בדגימות שסתום אבי העורקים. שלבי המפתח של שיטה זו מוצגים באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מציגים שיטה לאפיון תת-אוכלוסין של לימפוציטים מסוג T המבודדים מדגימות שסתום אבי העורקים, באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו דורשת שימוש במעיל באפי מוקרן כדי לבודד את מחשבי ה-PBMCs. תדירות הקרינה שאליה יש לחשוף את שקיות המעילים היא 9000 Rad/90 Gray (Gy) והיא מייצגת צעד מכריע לעצירת התפשטות תאי המאכיל. תפקידם של התאים המבודדים משקיות המעילים של באפי הוא לפעול רק כתאי מאכילים ולספק חומרים מזינים לתאי ה- T המבודדים מהשסתומים. השימוש בשקית מעיל באפי לא רשמית יקדם התפשטות של מחשבים אישיים בתרבות, כפי שצוין

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

כל שקיות המעילים של באפי ששימשו לפרוטוקול הזה הוקרנו הודות לזמינותם של ד"ר פיטר רוזנטל, ד"ר דירק בהמר וכל הצוות של מחלקת הרדיולוגיה של צ'רייט בנג'מין פרנקלין. בעל מלגה / מרי רוקסנה כריסטופר, עבודה זו נתמכת על ידי מלגה מאגודת הלב הגרמנית (DGK).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרקי פלסטיק 50 מ"לפישרברנד9000701
96- באר U- תחתית צלחות Multiwellגריינר ביו-וואן10638441
תיק ספייק (ללא מחטים)סיגמאP6148מדלל ל-4% עם PBS
CD14 סגול מבריק 421  Biolegend560349
CD25 PE  Biolegend302621
CD3 PE/Cy7  Biolegend300316
CD4 Alexa Fluor 488  Biolegend317419
CD45 סגול מבריק 711  Biolegend304137
CD8 סגול מבריק 510  ביולג'נד301047
שפופרת אפנדורף 1.5 מ"ל שפופרתאפנדורף13094697
אפנדורף 0.5 מ"לתרמו סיינטיפיקAB0533
פלקון 15 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטיפלקון10136120
פלקון 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםפלקון10788561
פלקון צינורות פוליסטירן עגולים תחתוניםBD2300E
קריאה מהירה 102 תא ספירת פלסטיקKOVA INTERNATIONAL630-1893
מסננים למדיום תרבית 250 מ"לNalgeneThermo Fisher Scientific168-0045
מסננים למדיום תרבית 500 מ"לNalgeneThermo Fisher Scientific166-0045
HB 101 תוסף ליופיליזציהIrvine ScientificT151
HB Basal MediumIrvine ScientificT000
FBS (סרום בקר עוברי)EurocloneECS0180L
HS (סרום אנושי)Sigma AldrichH3667
Human IL-2 ISMiltenyi Biotec130-097-744
L-גלוטמיןGibco11140050
LymphoprepFalcon352057
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניותSigma11082132001
ParaformaldehydeThermo Fisher Scientific10538931
PBS (תמיסת מלח עם חוצץ פוספט)Thermo Fisher Scientific10010023
פניצילין/סטרפטומיציןGibco1507006310000 U/mL
PHA (פיטוהמגלוטינין)תאי גזע טכנולוגיות7811
צלחות פטרי מפלסטיקתרמו סיינטיפיקR80115TS10 0 מ"מ x 15 מ"מ
RPMI 1640 מדיהHyClone15-040-CV
נתרן פירובטGibco by Life טכנולוגיות11360070
מסנני מזרק 0,45µ lצלוחיות תרבית תאים Rotilabo-SpritzenfilterP667.1
T-25InvitrogenThermo Fisher ScientificAM9625
T-75 בקבוק תרבית תאיםThermo Fisher Scientific10232771
β- מרקפטואתנולGibcoA2916801

מקורות

  1. Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
  2. Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
  3. Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
  4. Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
  5. Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
  6. Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
  7. Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
  8. Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
  9. Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
  10. Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945(2015).
  11. Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
  12. Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
  13. Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
  14. Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
  15. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
  16. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
  17. Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51(2019).
  18. Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
  19. Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
  20. Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
  21. Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
  22. Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900(2017).
  23. Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
  24. Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
  25. Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854(2017).
  26. Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
  27. Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
  28. Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
  29. Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
  30. Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד לימפוציטים Tמחלת השסתום האאורטלי ההסתיידהציטומטריה של זרימהשיבוט תאי Tבידוד PBMCתאי T מסוג CD4הפעלה חיסונית
חקירת הסתיידות שסתום אבי העורקים באמצעות בידוד ותרבות של לימפוציטים T באמצעות תאי מאכיל ממעיל באפי מוקרן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.