מאמר שיטה

הדמיה של SARS-CoV-2 באמצעות אימונו RNA-פלואורסצנטיות בהכלאה Situ

DOI:

10.3791/62067

⸱

23 בדצמבר 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Malopolska Centre of Biotechnology, Jagiellonian University, 2Microbiology Department Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 3Department of Cardiac, Vascular and Endovascular Surgery and Transplantology, The Medical University of Silesia in Katowice, 4Silesian Centre for Heart Diseases

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה המשלבת פלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (RNA-FISH) עם כשל חיסוני כדי לדמיין תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) RNA. פרוטוקול זה עשוי להגביר את ההבנה של המאפיינים המולקולריים של אינטראקציות מארח SARS-CoV-2 RNA ברמת תא יחיד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מספק פרוטוקול לתגובת שרשרת הכלאה (HCR) בשילוב עם כשל חיסוני כדי לדמיין תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) RNA בקו התא ותרביות תלת מימדיות (3D) של אפיתל דרכי הנשימה האנושיות. השיטה מאפשרת הדמיה ספציפית ורגישה מאוד של RNA ויראלי על ידי הסתמכות על HCR ביוזמת לוקליזציה בדיקה. בדיקות של יוזם פיצול מסייעות להגביר את האות על-ידי מגברים בעלי תווית פלואורסצנטית, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות רקע זניחה במיקרוסקופיה קונפוקלית. תיוג מגברים עם צבעים פלואורסצנטיים שונים מקל על זיהוי בו זמנית של מטרות שונות. זה, בתורו, מאפשר את המיפוי של הזיהום ברקמות כדי להבין טוב יותר פתוגנזה ויראלית ושכפול ברמת תא יחיד. צימוד שיטה זו עם כשל חיסוני עשוי להקל על הבנה טובה יותר של אינטראקציות בין וירוסים מארחים, כולל החלפה של האפיגנום המארח ומסלולי התגובה החיסונית. בשל טכנולוגיית HCR רגישה וספציפית, פרוטוקול זה יכול לשמש גם ככלי אבחון. חשוב גם לזכור כי הטכניקה עשויה להשתנות בקלות כדי לאפשר זיהוי של כל RNA, כולל RNAs שאינם קידוד וירוסים RNA שעשויים לצוץ בעתיד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SARS-CoV-2 הוא נגיף בטאקורונה אנושי חדש שהתגלה בסוף 2019, וגרם למגפה חסרת תקדים כמה חודשים לאחר מכן. מכיוון שהנגיף חדש למדע, חלק גדול מהביולוגיה שלו והשפעתו על תאים מארחים עדיין לא ידועים. לכן, מיפוי הנגיף-תא ו -רקמה טרופיזם במהלך ההדבקה חשוב אם המאפיינים הביולוגיים הבסיסיים שלה ואת השפעותיו על המארח הם להיות מובנים. מספר טכניקות משמשות לבחינת יחסי הגומלין בין מארחי וירוסים, כולל מבחנים ביוכימיים, ביולוגיים ופיזיים. באתרו הכלאה היא שיטה נפוצה המעסיקה DNA משלים, RNA, או בדיקות חומצת גרעין שונה, אשר לוקליזציה לרצפי DNA או RNA ספציפיים בתא או ברקמה.

פותח פלואורסצנט RNA חדש בשיטת ההכלאה (RNA-FISH) המשלבת שינויים להגברת הרגישות על ידי הגברת יחס האות לרעש באמצעות HCR1. HCR מאפשר את המחקר של לוקליזציה RNA ברמת תא יחיד. בשל הספציפיות הגבוהה שלה, רגישות, ורזולוציה, שיטה זו שימושית לא רק עבור לימודי מדע בסיסיים, אלא גם עבור פרויקטים אפליקטורטיביים, למשל, אבחון. לאחרונה, ההיתכנות של שיטה זו הודגמה לגילוי SARS-CoV-2 RNA מקומי לתאים ciliated בתוך אפיתל דרכי הנשימה האנושי מובחן לחלוטין (HAE)תרבויות 2. תרבויות HAE מהוות את אחד הכלים המתקדמים ביותר המשמשים לחקר זיהום ויראלי בהקשר של "זיהום טבעי" microenvironment3,4.

מספר דיווחים על נגיפי קורונה אנושיים (HCoV), כולל SARS-CoV-2, מדגישים את החשיבות של שינויים אפיגנטיים ביחס לזיהום HCoV ופתופיזיולוגיה [נבדק ב 5],למשל, דפוס המתילציה של הגן המקודד את האנזים הממיר אנגיוטנסין 2 (ACE-2) קולטן6,7. מעניין, הקרנה ספקטרומטרית המונית זיהתה מספר גורמים אפיגנטיים המקיימים אינטראקציה עם פרוטאום SARS-CoV-28. ליתר דיוק, חלבון לא מבני 5 (NSP5) נקשר לווסת האפיגנטי, היסטון דיאצטילאז 2, וה- NSP5 (C145A) הלא פעיל באופן קטליטי מקיים אינטראקציה עם tRNA מתילטרנספראז 1 (24). בנוסף, פעילות מתיל-טרנספראז NSP16 נחסמת על ידי מעכב המתיל-טרנספראז, סינאפונגין9. עם זאת, התפקיד המדויק של גורמים אפיגנטיים אלה ב- COVID-19 עדיין לא ברור. שכפול של HCoV מתרחש בציטופלסמה של התא הנגוע, ומפעיל תגובות דלקתיות המווסתות על ידי שינויים אפיגנטיים10.

לדוגמה, HCoV-229E מכוונן עדין גורם גרעיני-קאפה B איתות ומתכנת מחדש עמוקות את הנוף כרומטין הסלולר המארח על ידי הגדלת אצטילציה של H3K36 ו H4K5 באזורים מסוימים11. זיהום בנגיף הקורונה הקשור לתסמונת הנשימה במזרח התיכון מגביר את רמות H3K27me3 ומרוקן את H3K4me3 באזורי היזמים של תת-קבוצות של גנים ספציפיים הרגישים לאינטרפרון12. בנוסף, RNA ויראלי מפעיל תגובות חיסוניות של התאים, כפי שהוכח עבור flaviviruses13, retroviruses14,15, ו Coronaviruses16. סמנים אפיגנטיים על RNA ויראלי עשוי לשחק תפקיד בזיהוי על ידי חיישנים סלולריים, כפי שמוצג עבור מתילציה m7A של וירוס כשל חיסוני אנושי-1 RNA17. עם זאת, שאלות נשארות: מהי ההשפעה של SARS-CoV-2 RNA על התגובה החיסונית, והאם סימנים אפיגנטיים מעורבים?

כאן תוארה שיטת RNA-FISH ממוטבת בשילוב עם ניתוח כשל חיסוני של קווי תאים ורקמות תלת-ממדיות (HAE מובחן לחלוטין). למרות שיטות ציטולוגיות, כגון FISH ו immunofluorescence, נמצאים בשימוש נרחב, זה דור חדש בשיטת הכלאה situ המבוסס על HCR מעולם לא שימש לגילוי וירוסים (למעט בפרסום האחרון)2. באופן כללי, immunostaining ו- FISH דורשים את השלבים הבאים: חדירה כדי לאפשר חדירה של בדיקות או נוגדנים; קיבוע שבו חומר סלולרי קבוע ומשומר; גילוי שבו נוגדנים או בדיקות חומצת גרעין מוחלים; ולבסוף, הרכבה של הדגימות להדמיה.

למרות שפרוטוקולים קיימים חולקים תכונות כלליות אלה, הם משתנים במידה ניכרת ביחס לפרמטרים המעורבים. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה, פשוט, אימונו-RNA-FISH תואר כדי לזהות SARS-CoV-2 RNA בתרבויות HAE ותאי ורו. הטכניקה כוללת את השלבים הבאים: (1) קיבוע של תאים עם paraformaldehyde; (2) חדירה עם חומר ניקוי או מתנול (MeOH); (3) התייבשות באמצעות סדרה מדורגת של פתרונות MeOH (תרבויות HAE בלבד); (4) איתור; (5) הגברה באמצעות טכנולוגיית HCR כדי לזהות SARS-CoV-2 RNA; (6) חיסון; ו-(7) הדמיה תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מאגר

  1. עבור 500 מ"ל של מאגר PHEM 2x, לשלב 18.14 גרם של piperazine-N,N′-bis(2-אתנסולפונית חומצה) (צינורות), 6.5 גרם של 4-(2-hydroxyethyl)-1 חומצה אתנסולפונית (HEPES), 3.8 גרם של חומצה אתילן גליקול טטראאצטית (EGTA) ו-0.99 גרם מגנזיום גופרתי (MgSO4). להפוך את הנפח עד ~ 400 מ"ל עם מים מזוקקים (dH2O), מערבבים, ולהתאים את ה- pH ל 7.0 באמצעות 10 מ אשלגן הידרוקסיד (KOH) או נתרן הידרוקסיד (NaOH). הפוך את הנפח הסופי עד 500 מ"ל, ולאחר מכן לפצל 50 aliquots מ"ל. יש לאחסן ב-20°C עד לצורך.
    הערה: המאגר לא יהיה ברור עד שה- pH יגיע ל- 7.0.
  2. הכינו פתרון מנייתי של 37% בפרפורמלדהיד (PFA). עבור 50 מ"ל, מערבבים 18.5 גרם של PFA ו 35 מ"ל של dH2O בבקבוק זכוכית. מניחים את הבקבוק על מערבב מגנטי עם חימום. מוסיפים 900 μL של 1 M KOH או NaOH, ומערבבים עד שהפתרון מתבהר. אפשר להתקרר ולהעביר לצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל; למעלה עד 50 מ"ל עם dH2O. ניתן לאחסן את הפתרון ב- -20 °C (60 °F) עד לצורך.
    הערה: יש לטפל בפורמלדהיד בברדס אדים תוך לבישת כפפות מגן וחלוק מעבדה.
  3. הכן מאגר קיבוע (3.7% PFA עם PHEM). עבור 50 מ"ל, לשלב 5 מ"ל של 37% פתרון PFA, 25 מ"ל של 2x מאגר PHEM, ו 20 מ"ל של dH2O בצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל. יש לאחסן ב-20°C עד לצורך.
    הערה: לאחר הפשרה, ניתן לאחסן את המאגר ב- 4 °C (60 °F) למשך עד 3 חודשים.
  4. הכן PBST (0.1% Tween-20 ב מלוחים עם מאגר פוספט אחד [PBS]). עבור 50 מ"ל, להוסיף 50 μL של 100% Tween-20 כדי 50 מ"ל של 1x PBS ומערבבים היטב.
    הערה: ניתן לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר (RT).
  5. הכן מאגרי התייבשות על-ידי שילוב MeOH/PBST ביחסים של 3:1, 1:1 ו- 1:3 (נפח סופי של 100 מ"ל של כל אחד; ראה טבלה 1).
    הערה: MeOH הוא רעיל מאוד דליק. כפי שהוא יכול לפגוע בעצב הראייה, זה צריך להיות מטופל במכסה המנוע אדים הימנעות כל להבות פתוחות. כמו ערבוב MeOH ו PBST יוצר תגובה אקסותרמית, לשלב את הפתרונות על קרח.
  6. עבור 1000 מל של 20x SSC, לשלב 175.3 גרם של נתרן כלורי (NaCl) ו 88.2 גרם של נתרן ציטראט ב, ולהתמלא 800 מל של dH2O. לערבב עד מומס, ולהתאים את ה- pH ל 7.2 באמצעות NaOH. הוסף dH2O לנפח כולל של 1000 מ"ל, ומובלעת אוטומטית או מסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק autoclaved.
  7. עבור 50 מ"ל של 5x SSCT, לשלב 12.5 מ"ל של 20x SSC מאגר עם 37.5 מ"ל של dH2O, ולהוסיף 50 μL של 100% Tween-20. מערבבים היטב.
  8. עבור 50 מ"ל של 50% 5x SSCT/50% PBST, לשלב 25 מ"ל של 5x SSCT עם 25 מ"ל של PBST.
  9. עבור 50 מ"ל של 2x SSC, לשלב 5 מ"ל של 10x SSC מאגר עם 45 מ"ל של dH2O. לערבב היטב.
    הערה: יש לאחסן את כל מאגרי SSC ב- RT בחושך.

2. הגדרת יעד, בדיקות ומגברים

  1. השתמש בכלים הזמינים באתר האינטרנט של היצרן כדי לעצב מגברים ובדיקות. ודא שהבדיקות משלימות את גדיל הדנ"א ההפוך של הגן SARS-CoV-2 N(איור משלים 1).
  2. קבע את גודל ערכת הבדיקות הטוב ביותר (קבוצה של 20 בדיקות מספיקה להמחנה).
  3. הגדר את המגברים המשמשים לגילוי RNA של יעד.
    1. השתמש במגבר HCR B1 המסומן בשם Alexa Fluor 647.
      הערה: מגבר HCR כולל סיכות שיער HCR metastable h1 ו- h2. ניתן לתכנן ניסויים מרובי ערכים באמצעות פרוטוקול זה. אם זה מתוכנן, בחר מגבר HCR אחר (B1, B2, ...) עבור כל RNA היעד להיות בתמונה בתוך אותה מדגם (למשל, מגבר B1 עבור יעד 1, מגבר B2 עבור יעד 2, ...).

3. תרבית תאים וזיהום בסארס-CoV-2

  1. תרבות ורו (תאי אפיתל כליות קוף) תאים במדיום הנשר שונה של Dulbecco המכיל 5% סרום שור עוברי.
    1. זרע 50,000 תאים על כריכות (מס '1, 15 × 15 מ"מ) בצלחת 12-באר.
  2. הכינו תרביות HAE מובחנות במלואן כמתואר18 על תמיכות טרנסוול חדירות עם קרום (קוטר = 6.5 מ"מ) ותרבות במדיום צמיחת אפיתל הסימפונות עד לשיתוף מלא.
  3. זיהום בווירוסים
    1. לחסן תאים עם SARS-CoV-2 ב 1000x מינון זיהומיות תרבות הרקמה החציונית (TCID50) לכל מ"ל
    2. דגירה תאים עבור 2 שעות ב 37 °C (69 °F).
    3. לשטוף תאים פעמיים עם PBS כדי להסיר וירוס לא מאוגד.
    4. תאי תרבות עבור 48 שעות.

4. SARS-CoV-2 RNA-FISH בתאי ורו בתרבית על כריכות

יום 1

  1. תיקון וחריגה של תאים
    1. לתקן תאים נגועים עם 3.7% w / v פתרון PFA עבור 1 שעה ב RT.
    2. לשאוף את הפתרון 3.7% PFA, ולשטוף את התאים פעמיים באמצעות 1x PBS.
    3. לחלחל התאים עם פתרון PBST במשך 10 דקות ב RT עם עצבנות.
    4. לשאוף את PBST, ולשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS.
  2. זיהוי
    1. לשאוף את הפתרון 1x PBS, ולשטוף את התאים פעמיים עם 2x SSC ב RT.
    2. לשאוף את הפתרון 2x SSC, ו prehybridize את הדגימות על ידי הוספת לפחות 300 μL של מאגר הכלאה בדיקה. מכסים את הבארות המכילות את התאים, ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
    3. הכן את פתרון הבדיקה על ידי הוספת 1.2 pmol של תערובת בדיקה למאגר הכלאה החללית.
      1. השתמש 1.2 μL של 1 μM בדיקה מלאי להכין 300 μL של מלאי עובד.
    4. הסר את פתרון הפרה-פיברידיזציה והעבר את התוויות לתא לח.
      1. פיפטה 30-50 μL של פתרון בדיקה על parafilm כדי ליצור טיפות בודדות.
    5. דגירה דגימות לילה (12-18 שעות) ב 37 °C (69 °F).

      יום 2
    6. מעבירים את הכיסויים בחזרה לצלחת של 12 בארות, ומסירים את פתרון הבדיקה העודף על ידי שטיפה למשך 4 x 5 דקות עם 400 μL של חיץ שטיפת בדיקה ב-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: כחלופה להנחת 30-50 μl aliquots על parafilm ותחת coverslips עבור דגירה, להוסיף 300 μL של פתרון בדיקה ישירות coverslips בצלחת 12-well. הליך זה הוא פשוט יותר, אך דורש כמויות משמעותיות של ריאגנטים. מחממים את חיץ שטיפת הבדיקה ל 37 °C (60 °F) לפני השימוש. לחשב את כמות המאגר הדרושה, ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה חרוט 15 מ"ל.
    7. לשטוף דגימות במשך 2 x 5 דקות עם 5x SSCT ב RT.
    8. החלף את פתרון SSCT 5x עם PBS 1x, ולאחסן את הדגימות ב 4 °C (60 °F) עד הגברה.
  3. הגברה הגברה
    1. הסר את הפתרון 1x PBS מן הבארות, ולהוסיף לפחות 300 μL של מאגר הגברה לכל באר. דגירה את הדגימות במשך 30 דקות ב RT.
    2. הכינו כל סיכת ראש של HCR (h1 ו-h2) על ידי קירור הנפח הרצוי בצינורות נפרדים.
      1. כדי להכין 300 μL של פתרון הגברה, להשתמש 18 pmol של כל סיכת ראש (למשל, עבור 300 μL, להשתמש 6 μL של 3 μM מלאי סיכת ראש פתרון).
      2. מעבירים את תמיסת סיכת הראש לצינורות.
      3. דגירה ב 95 °C (69 °F) עבור 90 s.
      4. מגניב ל- RT במשך 30 דקות בחושך.
    3. הכינו תערובת סיכות ראש על ידי הוספת סיכות הראש "h1" ו-"h2" מקוררת למאגר ההגברה.
    4. מניחים טיפות של 30-50 μL של תערובת סיכות ראש על parafilm.
    5. דגירה את הדגימות לילה (12-18 שעות) בחושך ב RT.

      יום 3
    6. מעבירים את הכיסויים בחזרה לצלחת 12 הבאר, ומסירים סיכות ראש עודפות על ידי שטיפה במשך 5 x 5 דקות עם 5x SSCT ב- RT עם תסיסה.
    7. שאפתן את מאגר ה-SSCT 5x והחלף אותו ב- PBS 1x.
      הערה: במידת הצורך, השתמש בדגימות RNA-FISH במבחן כשל חיסוני סטנדרטי, ואחריו בכתם גרעינים (ראה סעיף 5).
  4. כתמים גרעיניים והרכבת שקופיות
    1. לשאוף את הפתרון 1x PBS, ולהחליף אותו עם 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI, 0.2 מיקרוגרם / מ"ל) בפתרון 1x PBS.
    2. דגירה את הדגימות במשך 10 דקות ב RT בחושך.
    3. שאפו את פתרון ה-DAPI ושטפו את התאים פעמיים עם PBS אחד.
    4. מניחים שתי טיפות של 10 μL כל אחד של מדיום הרכבה; ודא שהטיפות מופרדות במידה מספקת כדי לאפשר הצבת שני כיסויים בשקופית אחת.
    5. הסר נוזל עודף על ידי הקשה על coverslips על מגבת נקייה, ולאחר מכן למקם אותם בינוני הרכבה נגד פשתן עם התאים פונים כלפי מטה.
    6. מניחים את הדגימות המותקנות על משטח יבש ושטוח בחושך ומניחים להם לרפא.
    7. לאחר הריפוי, לאטום את הקצוות של coverslips עם איטום VALAP או לק כדי למנוע את הדגימות להתייבש.

5. SARS-CoV-2 RNA-FISH בתרבויות HAE

יום 1

  1. תיקון וחלחלות לתרבות HAE
    1. לשאוף את המדיום, ולתקן את התאים הנגועים באמצעות 3.7% פתרון PFA עבור 1 שעה ב RT.
    2. לשאוף את הפתרון 3.7% PFA, ולשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS.
      1. החלף את פתרון PFA של 3.7% ב- PBS 1x תחת תוסף טרנסוול.
    3. השלך את PBS, ולייבש את הדגימות באמצעות 2 x 5 דקות שוטף עם 100% MeOH prechilled כדי -20 °C (69 °F).
    4. לאחר הכביסה השנייה, החלף את המאגר ב- MeOH טרי ומצונן לחדירה מתחת לתוסף Transwell. יש לאחסן לילה ב-20°C.

יום 2

  1. התייבשות מחדש
    Rehydrate הדגימות באמצעות סדרה מדורגת של פתרונות MeOH / PBST (כל אחד במשך 5 דקות) על הקרח: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH / 50% PBST, 25% MeOH / 75% PBTS, ו 100% PBST (פעמיים).
    1. לשטוף את התאים במשך 5 דקות על הקרח עם 50% 5x SSCT / 50% PBST.
    2. לשטוף תאים במשך 5 דקות על קרח עם 5x SSCT.
    3. החלף את מאגר ה- SSCT 5x ב- PBS 1x.
  2. זיהוי
    1. דגירה התאים (בתוך הכנס Transwell) במשך 5 דקות על קרח עם 100 μL של חיץ הכלאה בדיקה. לאחר מכן, להעביר את הצלחת לאינקובטור במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (prehybridization).
      הערה: יש לחמם מראש את מאגר ההכלאה לבדיקה ל-37°C לפני השימוש. חשב את אמצעי האחסון הנדרש: דרוש 100 μL עבור הכנסה אחת של Transwell.
    2. הכינו את פתרון הבדיקה. כמו 1 מ"ל של פתרון בדיקה דורש 4 pmol של בדיקה, להוסיף 4 μL של 1 μM בדיקה מלאי פתרון 1 מ"ל של חיץ הכלאה בדיקה, ומערבבים היטב.
      הערה: לזיהוי RNA, השתמש ב- 100 μL של פתרון בדיקה לכל הכנס Transwell. השאירו את פתרון הגשוש על הקרח עד סוף שלב הפרה-פיברידיזציה.
    3. הסר את פתרון הפרה-פיברידיזציה והוסף את פתרון הבדיקה.
    4. דגירה התאים לילה (12-18 שעות) ב 37 °C (69 °F).

      יום 3
    5. הסר בדיקה עודפת על ידי כביסה במשך 4 x 15 דקות עם 100 μL של חיץ לשטוף בדיקה ב 37 מעלות צלזיוס.
    6. לשטוף את הדגימות במשך 2 x 5 דקות עם 5x SSCT ב RT.
    7. החלף את 5x SSCT עם 1x PBS, ולאחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס עד הגברה.
  3. הגברה הגברה
    1. מראש את הדגימות על ידי דגירה אותם עם מאגר הגברה במשך 30 דקות ב RT.
    2. הכינו כל סיכת ראש על ידי קירור הנפחים הרצויים בצינורות נפרדים.
      1. כדי להכין 500 μL של פתרון הגברה, להשתמש 30 pmol של כל סיכת ראש (למשל, עבור 500 μL, להשתמש 10 μL של 3 μM מלאי סיכת ראש פתרון).
      2. מעבירים את תמיסת סיכת הראש לצינורות.
      3. דגירה ב 95 °C (69 °F) עבור 90 s.
      4. מגניב ל- RT במשך 30 דקות בחושך.
    3. הכינו את תמיסת סיכת הראש על ידי הוספת כל סיכות השיער מקורר הצמד ל 500 μL של מאגר הגברה ב RT.
    4. הסר את פתרון preamplification, ולהוסיף את הפתרון סיכת ראש מלאה.
    5. דגירה את הדגימות לילה (12-18 שעות) ב RT בחושך.
    6. הסר סיכות ראש עודפות על ידי כביסה עם 5x SSCT ב RT כדלקמן: 2 x 5 דקות, 2 x 15 דקות, ו 1 x 5 דקות.
    7. החלף את פתרון ה- SSCT 5x ב- PBS 1x, ואחסן ב- 4 °C (70 °F) למשך לא יותר מ- 2-3 ימים או המשך ישירות לכתמים גרעיניים.
      הערה: במידת הצורך, השתמש בדגימות RNA-FISH במבחן כשל חיסוני סטנדרטי, ואחריו בכתמים גרעיניים (ראה סעיף 6).
  4. כתמים גרעיניים והרכבת שקופיות
    1. שאפתן את פתרון PBS 1x, ולהחליף אותו עם פתרון DAPI (0.2 מיקרוגרם / מ"ל) ב 1x PBS.
    2. דגירה את הדגימות במשך 10 דקות ב RT בחושך.
    3. שאפו את פתרון ה-DAPI ושטפו את התאים פעמיים עם PBS אחד.
    4. מניחים את הקרום הגזור מן Transwell מוסיף על 10 μL של מדיום הרכבה נגד פשתן עם התאים פונים כלפי מעלה, ולהוסיף מדיום הרכבה נוספת (5 μL) לקרום.
    5. מכסים את הקרומים עם כיסויים.
    6. לרפא את הדגימות רכוב על משטח יבש, שטוח בחושך.
    7. לאחר הריפוי, לאטום את הקצוות של coverslips עם איטום VALAP או לק כדי למנוע את הדגימות להתייבש.

6. ניתוח כשל חיסוני של תאי Vero ותרבויות HAE

הערה: בצע את בדיקת האימונופלואורסצנטיות ביום 3 עבור קווי תאים או יום 4 עבור תרבויות HAE. השתמש בגישה שונה עבור כל דגם. כל ההבדלים מצוינים בבירור.

  1. לשאוף את פתרון 1x PBS מן הבארות.
  2. לחסום את הדגימות על ידי דגירה עם 1% w / v סרום שור אלבומין בפתרון PBST במשך 30 דקות ב 37 °C (69 °F).
  3. הכינו נוגדנים ראשוניים על ידי הכנת דילולים מתאימים בחסימת הפתרון, והדגירה.
    1. עבור תאי Vero על כיסויים:
      1. מניחים טיפות (30-50 μL) של פתרון נוגדנים על parafilm בתא לחות.
      2. מניחים כיסויים על טיפות הנוגדנים כאשר התאים פונים כלפי מטה.
    2. עבור HAE, החלף את חומר החסימה בתוספות בתמיסת נוגדנים (100 μL), והדגיר את הדגימות בתא לח.
      הערה: להתאים את הזמן והטמפרטורה עבור כל דגירה עם נוגדן ראשוני. פרמטרים אופייניים הם 2 שעות ב RT או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. לשטוף את הדגימות במשך 3 x 5 דקות עם PBST.
    1. עבור תאים על כיסויים, העבר לצלחת של 12 באר והוסף פתרון PBST.
    2. עבור תרביות HAE, החלף את פתרון הנוגדנים בתמיסת PBST.
  5. בדוק את מקורות האור והמסננים הזמינים עבור המיקרוסקופ הקונפוקאלי.
  6. בחר נוגדנים משניים על פי המין המארח. בחר את הפרמטרים פלואורופור (עירור אורכי גל פליטה, רוחב הספקטרום, ויעילות עירור על פי מקור האור הזמין).
    הערה: ניתן לעצב פרמטרים ספקטרליים באמצעות כלים מקוונים (ראה טבלת חומרים).
  7. הכן פתרונות נוגדנים משניים מתאימים על ידי דילולם עם פתרון חסימה.
  8. דגירה עם נוגדנים משניים (כמו ב 6.3), אבל דגירה במשך 1 שעה ב 37 °C (67 °F).
  9. לשטוף את הדגימות כמו בשלב 6.4.
  10. כתמים גרעיניים והרכבת שקופיות
    1. עבור תאים על כיסויים
      1. שאפת את PBST, ולהחליף אותו עם DAPI (0.2 מיקרוגרם / מ"ל) בפתרון PBS 1x.
      2. דגירה את הדגימות במשך 10 דקות ב RT בחושך.
      3. שאפו את פתרון ה-DAPI ושטפו את התאים פעמיים עם PBS אחד.
      4. מניחים את הכיסויים על טיפות של 10 μL של מדיום הרכבה עם התאים פונים כלפי מטה.
      5. לאטום את הכיסויים עם לק.
    2. לתרבויות HAE
      1. שאפתן את 1x PBST, ולהחליף אותו עם DAPI (0.2 מיקרוגרם / מ"ל) בתמיסת PBS 1x.
      2. דגירה את הדגימות במשך 10 דקות ב RT בחושך.
      3. שאפו את פתרון ה-DAPI ושטפו את התאים פעמיים עם PBS אחד.
      4. מניחים את הקרומים החתוכים על טיפות של 10 μL של מדיום הרכבה כאשר התאים פונים כלפי מעלה, ומוסיפים מדיום הרכבה נוסף (5 μL) לקרום.
      5. מכסים את הקרומים עם כיסויים.
      6. לאטום את הכיסויים עם לק.

7. מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. הגדר את הרצועות על-ידי ציון הפלואורופורים בהם נעשה שימוש.
  2. בחר את מצב הסריקה והמהירות.
  3. התאם את ערכי עוצמת הלייזר, הרווח וההיסט עבור כל פלואור על-ידי השוואתם לפקדים שליליים בהתאמה: עבור וירוסים, תאים נגועים מדומה; לחלבונים תאיים, דגימות מוכתמות בנוגדני בקרת איזוטיפים ממארח מתאים.
  4. לרכישת תמונה תלת-ממדית, הפעילו מצב מחסנית z והגדירו את הגבול העליון והתחתון. הגדר את גודל/מספר השלב.
    הערה: לפרטים נוספים על הדמיית נגיף הקורונה ראו19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול האימונו-רנ"א-FISH המתואר בכתב יד זה בוצע באמצעות שתי מערכות סלולריות: קו תאים Vero ותרבות HAE תלת-ממדית. השלבים העיקריים עבור שני הדגמים הסלולריים מוצגים בטבלה 2. פרוטוקול RNA-FISH להדמיה של SARS-CoV-2 בתרבויות HAE כולל שלבים האופייניים לדגימות רקמות, כלומר חדירה עם 100% MeOH והתייבשות באמצעות סדרה מדורגת של פתרונות MeOH-PBS ו- 0.1% Tween. אימונופלואורסצנטיות בוצעה לאחר השלמת RNA-FISH. תמונות זסטאק נרכשו ומעובדות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונו-רנ"א-פיש היא שיטה אמינה לכתמים כפולים של רנ"א וחלבונים תאיים. כאן, פרוטוקול חיסוני-RNA-FISH שונה תואר המאפשר זיהוי של SARS-CoV-2 RNA וחלבונים תאיים בקווי תאים ותרבויות HAE. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש במודלים שונים של תאים, כולל monolayers תאים או רקמות ספציפיות. השיטה מסתמכת על הרעיון של HCR ביוזמת לוקליזציה בדיקה מתאימה. לאחר מכן, השימוש בבדיקות של יוזם מפוצל כדי להתחיל להגביר את האות על ידי מגברים בעלי תווית פלואורסצנטית גורם לפלואורסצנטיות רקע מינימלית עד אפסית כאשר הם נצפים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה למחקר על SARS-CoV-2, ועל ידי מענקים מהמרכז הלאומי למדע (מענקים UMO2017/27/B/NZ6/02488 ל- K.P. ו- UMO-2018/30/E/NZ1/00874 ל- A.K.-P.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ציוד
מיקרוסקופ קונפוקלי LSM 880ZEISS
גרנט ביו, מיני רוקר - שייקרפישר חממת 12965501
Galaxy170Rניו ברונסוויקCO170R-230-1000
תרמומיקסר קומפורטאפנדורף5355 000 011
חומרים
15 מ"מ x 15 מ"מ מס' 1 כיסוייםLabSolute7695022
1.5 מ"ל צינורותFL-MEDICAL5.350.023.053
צלחת 12 בארותTTP92412
צינור צנטריפוגה חרוטיSarstedt5.332.547.254
פרפילםSigmaP7793-1EA
צנרת סרולוגיתאוסף VWR612-5523P, 612-5827P
זכוכית שקופיותPTH CHEMLAND04-296.202.03
Transwell ThinCertsGrainer bio-one665641
ריאגנטים
Alexa fluorophore 488 נוגדנים משניים מצומדים Invitrogen
ובטא; 5-tubulin Santa Cruz Biotechnology sc-134234
DAPIThermo ScientificD1306
דיסודיום פוספטסיגמאS51136-500G
EGTABioShopEGT101.25
HCR הגברה מאגרמכשירים מולקולריים, בע"מניתן להכין BAM01522 Buffer גם doi:10.1242/dev.165753: מידע משלים
מגבר HCR B1-h1 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.
מגבר S013922 HCR B1-h2 Alexa Fluor 647מכשירים מולקולריים, בע"מ
HCR Probe Hybridization BufferMolecular Instruments, Inc.ניתן להכין BPH03821 Buffer גם doi:10.1242/dev.165753: מידע משלים
על בדיקת HCR מוגדר עבור SARS-CoV-2 NcapsidMolecular Instruments, Inc.PRE134
HCR בדיקה מאגר שטיפתמכשירים מולקולריים, בע"מניתן להכין BPW01522 Buffer גם doi:10.1242/dev.165753: מידע משלים
HEPESBioShopHEP001.100
מגנזיום סולפט heptahydrateSigma63138-250G
מתנולסיגמא32213-1L-M
מונופוטסיום פוספטסיגמאP5655-100G
פרפורמלדהידסיגמאP6148-1 ק"ג
צינורותBioShopPIP666.100
אשלגן כלוריסיגמאP5405-250G
פרולונג יהלום אנטי-דהייה הרכבה בינוניתInvitrogenP36970
נתרן כלוריBioShopSOD001.5
טריסודיום ציטראט 2-הידראטPOCH 6132-04-3
Tween-20BioShopTWN580.500
תוכנה
Fluorescence Spectraviewerמידול פרמטרים ספקטרליים
ImageJ פיג'ירכישה ועיבוד של תמונות z-stack
מדעיתS012522

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
  2. Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
  3. Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
  4. Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
  5. El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118(2020).
  6. Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
  7. Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
  8. Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
  9. Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
  10. Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
  11. Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286(2017).
  12. Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8(2017).
  13. Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889(2019).
  14. Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
  15. Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
  16. Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
  17. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830(2017).
  18. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
  19. Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SARS CoV 2 VisualizationImmuno RNA FISHIn Situ HybridizationHybridization Chain ReactionViral RNA DetectionHuman Airway EpitheliumConfocal MicroscopyImmunofluorescence LabelingSingle Cell AnalysisProtein RNA Interactions

מאמרים קשורים