הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכבר לדלקת לבלב כרונית באמצעות עירוי TNBS צינור המרה

3.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62080

⸱

28 בפברואר 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Ralph H. Johnson Veterans Affairs Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

דלקת לבלב כרונית (CP) היא מחלה המאופיינת בדלקת ופיברוזיס של הלבלב, הקשורים לעתים קרובות עם כאבי בטן עקשניים. מאמר זה מתמקד בשיפור הטכניקה ליצירת מודל עכבר של CP באמצעות עירוי צינור המרה עם 2,4,6 -טרינדרובנזן חומצה גופרתית (TNBS).

תקציר

דלקת לבלב כרונית (CP) היא מחלה מורכבת הכוללת דלקת לבלב ופיברוזיס, ניוון בלוטות, כאבי בטן ותסמינים אחרים. מספר מודלים מכרסמים פותחו כדי לחקור CP, אשר צינור המרה 2,4,6 -טריניטרובנזן חומצה גופרתית (TNBS) מודל עירוי משכפל את התכונות של כאב נוירופתי לראות CP. עם זאת, עירוי סמים צינור המרה בעכברים הוא מאתגר מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מדגים את ההליך של עירוי TNBS צינור המרה עבור הדור של מודל עכבר CP. TNBS היה חדורה לתוך הלבלב דרך האמפולה של ואטר בתריסריון. פרוטוקול זה מיטב את נפח התרופה, טכניקות כירורגיות וטיפול בסמים במהלך ההליך. עכברים שטופלו ב-TNBS הראו תכונות של CP כפי שמשתקפות על ידי הפחתות במשקל הגוף והלבלב, שינויים בהתנהגויות הקשורות לכאב, ומורפולוגיה לבלב חריגה. עם שיפורים אלה, התמותה הקשורה הזרקת TNBS היה מינימלי. הליך זה הוא לא רק קריטי ביצירת מודלים מחלת הלבלב, אלא הוא גם שימושי במשלוח תרופות הלבלב המקומי.

מבוא

דלקת לבלב כרונית (CP) היא מחלה דלקתית כרונית המאופיינת על ידי ניוון הלבלב, פיברוזיס, כאבי בטן, ובסופו של דבר אובדן של תפקודים אקסוקריניים ואנדוקרינים1. הטיפולים הרפואיים והכירורגיים הנוכחיים אינם מרפאים אך נעשים כדי להקל על הסימפטומים שהם תוצאה של המחלה: כאבי בטן עקשן, תפקוד אנדוקריני ואקסוקריני. לכן, טיפולים יעילים יותר נדרשים בדחיפות2. מודלים של בעלי חיים מספקים כלי חיוני לפיתוח הבנה טובה יותר של המחלה וחקירת טיפולים פוטנציאליים3. מודלים עכבר מרובים עבור CP פותחו, אשר cerulein ו / או מודלים אלכוהול נפוצים. Cerulein, אוליגופפטיד מגרה הפרשת הלבלב, הוכח לגרום להתרבות מודל CP הכולל ניוון הלבלב, פיברוזיס, בין היתר4. מודל נפוץ אחר משתמש זריקות סדרתיות של L-ארגנין, אשר מייצרת אי ספיקה אקסוקרינית דומה לזו שנצפו בחולים אנושיים5. CP יכול גם להיות מושרה על ידי קשירת צינור הלבלב מלאה או חלקית, כמו גם יתר לחץ דם צינור הלבלב6,7. למרות מגוון המודלים של בעלי חיים הזמינים עבור CP, אף אחד מהמודלים האלה למעשה משחזר את כאבי הבטן שחווים חולי CP8.

מחקרים קודמים הראו כי הזרקת לבלב מקומית של 2,4,6 - טריילרבנזן חומצה גופרתית (TNBS) משכפלת את הכאב המתמשך שחווים חולי CP9,10,11. עכברים שטופלו ב- TNBS הדגימו רגישות יתר בבטן והתנהגויות מוגברות הקשורות לכאב, כמו גם "רגישות יתר כללית" לגירויים כואבים, תופעה שנצפתה בחולי CP10. בנוסף לחיקוי מדויק של כאבי CP, מודל TNBS משכפל גם תכונות פתולוגיות אחרות של המצב האנושי כגון פיברוזיס, חדירת תאים מונונוקלאריים והחלפת תאי סינאר ברקמתשומן 10,12. עם זאת, עירוי TNBS באמצעות צינור המרה הוא הליך מאתגר מבחינה טכנית בעכברים שעלול לגרום למוות. למיטב ידיעתנו, אין פרוטוקול חזותי כדי להראות כיצד עירוי צינור המרה מבוצע. במאמר זה, אנו מדגימים את ההליך של עירוי אוורור מרה של TNBS כדי ליצור מודל עכבר CP. הליך זה יסייע לייצר מודלים בעלי ערך לבעלי חיים לחקר CP ומחלות לבלב אחרות וניתן להשתמש בו כדי להחדיר חומרים אחרים (למשל, וירוס, תאים) לתוך הלבלב13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים נערכו באישור ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה ובמרכז הרפואי ראלף ה. ג'ונסון. C57BL / 6J עכברים זכרים בין 8-10 שבועות של גיל שימשו במחקר זה. עכברים שוכנו תחת מחזור כהה סטנדרטי של 12 אור/ 12 עם ליביטומקס עד למזון ומים.

1. הכנת פתרון TNBS להזרקה

  1. הכן 10% אתנול ב 0.9% מלוחים. להמיס את המניה TNBS (ראה טבלה של חומרים) ב 10% אתנול לריכוז סופי של 7.5 מ"מ על ידי הוספת 7.5 μL של TNBS לתוך 1 מ"ל של 10% אתנול.
    זהירות: TNBS מהווה סכנה כימית. הכן את הפתרון בתוך מכסה המנוע של האדים והשתמש בציוד מגן אישי כגון כפפות, משקפי מגן וחלוק מעבדה כדי להימנע ממגע ישיר עם TNBS.
  2. לטעון 50 μL של 0.75% פתרון TNBS לתוך מזרק אינסולין עם מחט 31-מד. לטעון 50 μL של 10% אתנול מלוח לתוך מזרק באותו גודל כמו בקרת רכב. מניחים את המזרקים על הקרח ומגינים עליהם מפני אור עד הצורך.

2. הכנת עכבר וניתוח

  1. תגלח את השיער מאזור ניתוח הבטן.
  2. הזריקו מנה אחת מראש של המשפך (למשל, בופרנורפין 0.1 מ"ג/ק"ג i.p. ) לפני הניתוח.
  3. לגרום ולשמור על העכבר תחת הרדמה כללית עם 1.5-2% איזופלוראן ו 1 L / min של חמצן. אשר את ההשפלה על ידי צביטת בהונות והתבוננות בחיה מחוסר רפלקס.
  4. מניחים את העכבר על כרית כירורגית מחוממת במהלך הניתוח. החל משחה וטרינרית על כל עין כאשר העכבר נמצא תחת הרדמה.
  5. לחטא את האתר הכירורגי על ידי ניגוב האזור הכירורגי 3x עם 2% יוד, ואחריו 70% אלכוהול(שולחן החומרים).
  6. בצע לפרוסטומיה עם מספריים מיקרו כדי ליצור 0.5-1 ס"מ ירידה.
  7. לחשוף בעדינות את התריסריון ולאתר את צינור המרה המשותף באמצעות צמר גפן(שולחן החומרים).
  8. הנח קליפ מיקרו המו ישר(שולחן חומרים)מעל הצינור המשותף הפרוקסימלי כדי למנוע את זרימת TNBS או פתרונות רכב לתוך הכבד וכיס המרה (איור 1A,B).
  9. לחשוף בעדינות את התריסריון ולהכניס את המחט לתוך צינור הלבלב דרך הפפילה של ואטר.
  10. לאחר המחט היא בתוך הצינור, למקם קליפ מיקרו המו מעוקל (שולחן החומרים) מעל התריסריון המקיף את המחט (איור 1A) כדי לאבטח את המחט במקום ולמנוע את הפתרון המוזרק מלהיכנס לתריסריון.
  11. בהדרגה להחדיר את הפתרון (TNBS או רכב) לתוך צינור הלבלב במהלך דקה אחת.
    הערה: TNBS צריך להיות חדור לאט על פני דקה אחת של זמן, וזה קל לשלוט על מהירות העירוי כאשר הלבלב הוא perfused עם מזרק אינסולין עם מחט 5/16 אינץ 'ו 31G. שמור על היד יציבה ככל האפשר כדי למנוע דקירה צינור המרה. אם TNBS מוזרק בהצלחה, צבע צהוב עשוי להיות גלוי בתוך הלבלב.
  12. לאחר עירוי, להסיר בזהירות את מהדק מיקרו ליד הכבד, ולאחר מכן להסיר את מהדק מיקרו מחזיק את המחט ואת התריסריון.
  13. החזירו בזהירות את התריסריון למיקומו המקורי.
  14. השאירו 0.5 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית חמה (36-37 מעלות צלזיוס) בחלל הבטן לפני הסגירה, כדי לעזור לתריסריון לחזור למיקומו המקורי ולסייע בהתאוששות של פריסטלזיס.
  15. סגור את החתירה בשכבת השריר באמצעות תפר רציף עם תפר 5-0. סגור את העור באמצעות תפר מופרע עם תפר 4-0.
  16. מניחים את הכלוב המכיל עכברים על כרית חימום כדי לאפשר התאוששות מההרדמה.
  17. אשר כי העכברים חמים ומסוגלים תנועה ספונטנית לפני החזרתם לחדר ההחזקה.
  18. המשך לספק מכנס לשון (למשל, buprenorphine 0.1 מ"ג / קילוגרם i.p.) כל 12 שעות חום משלים עבור 48 שעות לאחר הניתוח.

3. ניטור התנהגות העכבר

  1. הסר תפרים ביום 7 לאחר הניתוח.
  2. נטר את בריאות העכבר ואת התנהגותו מדי יום במהלך השבוע הראשון לאחר הניתוח. צפה בסימני מצוקה כגון השמעה, תנוחת גב כפופה או ירידה בקטר. למדוד את משקל הגוף כל יומיים.
  3. השתמש פון פרי monofilaments (VFFs) כדי למדוד רגישות יתר מכנית בטן לפני, ו 2, 3 שבועות לאחר הניתוח כמתואר9,14.
    1. החל VFFs של כוחות מיושמים שונים בסדר עולה על אזור הבטן העליונה 10x כל 1-2 s. שקול את העלאת, נסיגה, או ליקוק הבטן (תגובת גמילה) כתגובה חיובית.
    2. החל גירוי חזק יותר אם לא נצפתה תגובה חיובית, וגירוי חלש יותר אם נצפתה תגובה חיובית. סף המשיכה הוא הכוח שבו העכבר מגיב 50% מהזמן.

4. איסוף וניתוח היסתולוגי של רקמת הלבלב

  1. להקריב את העכברים תחת הרדמה על ידי נקע צוואר הרחם, בזהירות לנתח את הלבלב מן המעי ואיברים אחרים.
  2. תקן את הלבלב ב 10% paraformaldehyde עבור 24 שעות, הטמעה פרפין, לחתוך קטעי רקמות של 5 מיקרומטר, ומניחים אותם על שקופיות זכוכית להכתמה.
  3. בצע המטוקסילין-אאוזין, והכתמת טריכרום של מאסון בשיטות סטנדרטיות כפי שדווח בעבר4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הליכי עירוי צינור המרה היו אופטימיזציה כדי להפחית את תמותת העכבר הקשורים להליך זה10. TNBS ניתן לראשונה בנפח כולל של 35 μL או 50 μL. הזרקת TNBS בנפח של 50 μL יכול להגיע הלבלב כולו ולעורר פנוטיפ מחלה הומוגנית יותר (איור 1B). בנוסף, הזרקת TNBS באמצעות מזרק אינסולין עם מחט 31G יכול לשלוט טוב יותר על מהירות עירוי ביחס מזרקים רגילים וגדלי מחט. TNBS מוכן טרי מאוחסן על קרח בשימוש בתוך שעה אחת של הכנת סמים גם הניב תוצאה טובה יותר בהשוואה TNBS מוכן יותר משעה אחת. עם שיפורים אלה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עירוי צינור המרה של TNBS כדי לגרום דלקת לבלב כרונית הוא מאתגר מבחינה טכנית בעכברים, כמו עד 22.5% של עכברים יכולים למות בתוך 3-4 ימים של עירוי סמים10. כאן, דו"ח זה חידד את ההליך בהתבסס על מחקרים קודמים והפחית את תמותת העכברים המוקדמים ל -<10%. לדוגמה, נפח התרופה המוגבר (מ 35 μL ל 50μL) יכול להבטיח את התרופות להגיע כל הלבלב. שימוש במזרק אינסולין וגודל מחט קטן יותר (31G) מפחית את הנזק הפוטנציאלי לצינור הלבלב ואת דליפת המרה לתוך כיס המרה או הבטן, אשר ככל הנראה יגרום למוות עכבר בתוך הימים הראשונים לאחר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי המחלקה לענייני יוצאי צבא (VA-ORD BLR&D הצטיינות I01BX004536), והמכון הלאומי לבריאות מענקי # 1R01DK105183, DK120394, ו- DK118529 ל- HW. אנו מודים לד"ר הונגג'ו וו על שיתוף הניסיון הטכני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% פורמלין ניטרלי חוצץ v/vפישר סיינטיפיק23426796
רפידות הכנה לאלכוהול, סטריליFisher Scientific22-363-750
מערכת הרדמה לבעלי חייםVetEquip, Inc.
בופרנורפין הידרוכלוריד, הזרקתPar Sterile Products, LLCNDC 42023-179-05
צינורות צנטריפוגה, 15 מ"לפישר סיינטיפיק0553859A
אתנול, מוחלט (200 הוכחה), כיתה ביולוגיה מולקולרית פישרסיינטיפיקBP2818500
מספריים מיקרו חיתוך עדינים במיוחד 4 אינץ' ישר חדRoboz כירורגי חברת אינסטרומנטRS-5882
מלקחיים Graefe 4 אינץ' קצה עדין במיוחדRoboz Surgical Instrument Co.RS-5136
כרית מחוממתאמזוןB07HMKMBKM
מחזיק מחט Hegar-Baumgartner 5.25 אינץ'רובוז מכשירים כירורגיים ושות 'מזרק אינסולין RS-7850
עם מחט 31 מדBD324909
רפידות הכנה ליודפישר סיינטיפיק19-027048
איזופלורןפיראמל טיפול קריטיNDC 66794-017-25
מיקרו קליפ מריחת מלקחיים 5.5 אינץ'רובוז מכשירים כירורגיים ושות 'RS-5410
מיקרו קליפ, ישר חזק מעוקל 1x6 מ"מRoboz Surgical Instrument Co.RS-5433
מיקרו קליפ, ישר, רוחב קליפ 0.75 מ"מRoboz Surgical Instrument Co.RS-5420
תמיסת חומצה פיקרילסולפונית, TNBS, 1M ב-H2OMillipore Sigma92822-1ML
תפר פוליפרופילן 4-0Med-Vet InternationalMV-8683
תפר פוליפרופילן 5-0Med-Vet InternationalMV-8661
נתרן כלורי, 0.9% תמיסה תוך ורידיתVWR2B1322Q
וילון כירורגי, סטריליMed-Vet InternationalDR1826
קלטת רקמותפישר סיינטיפיק22-272416
חוטי פון פרייBiosebEB2-VFF
901806

מקורות

  1. Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
  2. Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
  3. Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
  4. Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
  5. Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26(2011).
  6. Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
  7. Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
  8. Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
  9. Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
  10. Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
  11. Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76(2019).
  12. Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  13. Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
  14. Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
  15. Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  16. Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
  17. Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

עירוי לתעלת המרהפיברוזיס של הלבלבדלקת הלבלבכאב נוירופתיאטרופיה של הלבלבטכניקה כירורגיתהובלת תרופות ללבלב
מודל עכבר לדלקת לבלב כרונית באמצעות עירוי TNBS צינור המרה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.