מאמר שיטה

הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת

DOI:

10.3791/62093

⸱

11 בפברואר 2021

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפקוד מחסום אפיתל מעיים Dysregulated ותגובות חיסוניות הם סימני היכר של מחלות מעי דלקתיות שנותרו נחקרות בצורה גרועה בשל מחסור במודלים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים מודל לולאת מעיים של עכברים המעסיק מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים כדי לחקור חלחיליות רירית וגיוס לויקוציטים ב- vivo.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רירית המעי מרופד בשכבה אחת של תאי אפיתל היוצרת מחסום דינמי המאפשר הובלה paracellular של חומרים מזינים ומים תוך מניעת מעבר של חיידקים זוהרים וחומרים אקסוגניים. הפרה של שכבה זו גורמת לחמיצות מוגברת לתכולה זוהרת וגיוס של תאי מערכת החיסון, שניהם סימני היכר של מצבים פתולוגיים במעיים כולל מחלות מעי דלקתיות (IBD).

מנגנונים המסדירים את תפקוד מחסום האפיתל ואת ההגירה הטרנס-אפיתלית (TEpM) של נויטרופילים פולימורפונוקלאריים (PMN) אינם מובנים לחלוטין בשל היעדר שיטות ניסיוניות ב- vivo המאפשרות ניתוחים כמותיים. כאן, אנו מתארים מודל ניסיוני מורין חזק המעסיק קטע מעיים חיצוני של ileum או המעי הגס הפרוקסימלי. לולאת המעי החיצונית (iLoop) היא בעלת כלי דם מלאים ומציעה יתרונות פיזיולוגיים על פני גישות מבוססות תא ex vivo המשמשות בדרך כלל לחקר חלחנות ונדידת PMN על פני מונולי תאים אפיתל.

אנו מדגימים שני יישומים של מודל זה בפירוט: (1) מדידה כמותית של חמיטות מעיים באמצעות זיהוי של dextrans תווית פלואורסצנטיות בסרום לאחר הזרקה תוך אלומינלית, (2) הערכה כמותית של PMN נודד על פני אפיתל המעי לתוך לומן המעיים לאחר הקדמה תוך-אלומינלית של כימותרפיה. אנו מדגימים היתכנות של מודל זה ומספקים תוצאות המשתמשות ב- iLoop בעכברים חסר חלבון הקשור לאפיתל הדוק צומת JAM-A בהשוואה לבקרות. JAM-A הוכח לווסת את תפקוד מחסום האפיתל, כמו גם PMN TEpM במהלך תגובות דלקתיות. התוצאות שלנו באמצעות iLoop לאשר מחקרים קודמים ולהדגיש את החשיבות של JAM-A בוויסות של חדירות מעיים PMN TEpM ב vivo במהלך הומאוסטזיס ומחלות.

מודל iLoop מספק שיטה סטנדרטית מאוד לשחזור במחקרי vivo של הומאוסטזיס מעיים ודלקת וישפר באופן משמעותי את ההבנה של תפקוד מחסום המעי ודלקת ריריים במחלות כגון IBD.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רירית המעי מקיפה שכבה אחת של תאי אפיתל מעיים טוריים (IECs), תאי מערכת החיסון הבסיסיים של למינה פרופריה וריריות השרירים. מלבד תפקידו בספיגת חומרים מזינים, אפיתל המעי הוא מחסום פיזי המגן על פנים הגוף מפני חיידקים קומנסליים זוהרים, פתוגנים ואנטיגנים תזונתיים. בנוסף, IECs ותאי חיסון lamina propria לתאם את התגובה החיסונית גרימת סובלנות או תגובה בהתאם להקשר וגירויים. דווח כי ההפרעה של מחסום האפיתל יכולה להקדים את תחילת דלקת רירית פתולוגית ולתרום למחלות מעי דלקתיות (IBD) המקיפה הן קוליטיס כיבית והן מחלת קרוהן1,2,3,4,5,6,7. אנשים עם קוליטיס כיבית מציגים הגירה טרנס-אפיתלאלית מוגזמת (TEpM) של נויטרופילים פולימורפונוקלאריים (PMN) היוצרים מורסות קריפטה, ממצא שנקשר לחומרת המחלה8,9. למרות תפקוד מחסום אפיתל נפגע ותגובות חיסוניות מוגזמות הם סימני היכר של IBD, יש חוסר ניסיוני בדיקות vivo לבצע הערכות כמותיות של חדורות מעיים וגיוס תאי החיסון לתוך רירית המעי.

השיטות הנפוצות ביותר המשמשות לחקר חדירות אפיתל מעיים ו- PMN TEpM משתמשות בגישות מבוססות תא ex vivo באמצעות monolayers של חברת החשמל המתרבתים על קרום נקבובי חדיר למחצה מוסיף10,11,12. שלמות מחסום האפיתל מנוטרת על ידי מדידות של התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית (TEER) או השטף הפאראלי של האיזוטיווציאנאט פלואורסצין (FITC) המסומן על ידי דקסטרן מתא apical לסל13,14,15. באופן דומה, PMN TEpM נחקר בדרך כלל בתגובה כימותרפיה כי הוא הוסיף בתא התחתון16. PMN ממוקמים בתא העליון ולאחר תקופת דגירה, PMN כי היגרו לתוך התא בזאלי נאספים וכימות. בעוד שיטות אלה שימושיות, קלות לביצוע ומאוד ניתנות לשחזור, הן ללא ספק גישות רדוקציוניסטיות ואינן מייצגות בהכרח השתקפות מדויקת של תנאי vivo.

בעכברים, בדיקה נפוצה לחקר חמידות פראלית במעיים היא על ידי gavage אוראלי של FITC-dextran ומדידה לאחר מכן של FITC-dextran מראה בסרום הדם13,17. החיסרון של בדיקת זה הוא שזה מייצג הערכה של שלמות המחסום הכוללת של מערכת העיכול ולא של תרומות מעיים אזוריות. בנוסף, כחול אוונס משמש בדרך כלל להערכת דליפת כלי דם ב vivo18 וגם הועסק כדי להעריך חמלות רירית מעיים בעכבר וחולדה19,20,21. הכימות של כחול אוונס ברירית המעי דורש מיצוי מרקמות המעסיקות דגירה בפורמאמיד בן לילה. לכן, אותה רקמה לא יכולה לשמש לחקר חדירות אפיתל מעיים וחדירת נויטרופילים.

כאן אנו מדגישים פרוטוקול פשוט המפחית את מספר בעלי החיים הדרושים לאיסוף נתונים לשחזור על חלחוביות הרירית המעי הגס ונדידת לויקוציטים טרנספיטהל ב vivo. אנו, אם כן, ממליצים על השימוש FITC-dextrans כי ניתן לזהות בקלות בסרום דם מבלי להתפשר על שלמות לולאות מעיים אשר ניתן לקצור לניתוח נוסף. ראוי לציין, לולאות קשירה מעיים שימשו במינים שונים (כולל עכבר, חולדה, ארנב, עגל) כדי לחקור זיהום חיידקי (כגון סלמונלה, ליסטריה monocytogenes ו Escherichia coli)22,23,24,25, כמו גם חמיצות מעיים26; עם זאת, למיטב ידיעתנו אין מחקרים החוקרים מנגנונים של PMN TEpM באזורים ספציפיים במעי כגון ileum או המעי הגס המעורבים בדרך כלל IBD.

כאן אנו מתארים את מודל לולאת מעי העכבר (iLoop) שהוא שיטת vivo מיקרוכירורגית חזקה ואמינה המעסיקה מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים של האיליום או המעי הגס הפרוקסימלי. מודל iLoop רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומאפשר הערכה של שלמות מחסום המעי ו- PMN TEpM על עכברים חיים תחת הרדמה. אנו מדגימים שני יישומים: 1) כימות של רמות סרום של 4 kDa FITC-dextran לאחר ניהול תוך-אלומינאלי ב- iLoop 2) כימות של PMN transmigrated ב- iLoop לומן לאחר הזרקה תוך-אלומינלית של chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. יתר על כן, ניצול מודל iLoop עם עכברים או עכברים או עכברים אועכברים המכילים אובדן סלקטיבי של JAM-A על IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) בהשוואה לעכברי בקרה, אנו מסוגלים לאמת מחקרים קודמים שדיווחו על תרומה משמעותית לחלבון צמוד הקשור לצומת JAM-A לחלחיליות במעיים ולהעברת נויטרופילים15,28,29,30,31.

מודל iLoop הוא שיטה פונקציונלית ופיזיולוגית מאוד שניתן להשתמש בה כדי לאשש במבחנות. יתר על כן, זהו מודל ניסיוני רב-תכליתי המאפשר לחקור ריאגנטים שונים שניתן להזריק ללומן הלולאה, כולל כימותרפיה, ציטוקינים, פתוגנים חיידקיים, רעלנים, נוגדנים וטיפולים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות ולמדיניות של המכונים הלאומיים לבריאות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן.

1. הכנה טרום הניתוחית

הערה: שיטה זו נוצרה באמצעות עכברים בוגרים מרקע גנטי C57BL/6, בגילאי 8 - 12 שבועות. כל העכברים הוחזקו בתנאים קפדניים של פתוגן ספציפי ללא גישה למזון ומים רגילים. התוצאות התקבלו באמצעות C57BL/6, Jam-a - עכברים ריקים (Jam-a-/-) או עכברים מחסה אובדן סלקטיבי של JAM-A על IECs (Villin-cre; Jam-afl/fl) ופסולת ג'אם-אfl/fl שולט כפי שתואר בעבר30.

  1. הכנת שטח
    1. בצע ניתוח באזור נקי. מודל לולאת המעי, לעומת זאת, הוא ניתוח לא הישרדות שאינו דורש טכניקה אספטית / סטרילית. יש להקפיד על שיטות תברואה וטרינריות ולהשתמש במכשירים כירורגיים נקיים (כלומר, קרצוף עם סבון, שטוף במים ואחריו 70% אתנול).
    2. הפעל לוח כירורגי מבוקר טמפרטורה (או רפידות חימום) ומקור אור מותאם כדי למנוע מהיפותרמיה במהלך ההרדמה והניתוח.
    3. הכן קשירה על ידי חיתוך מקטעים 6 ס"מ של תפרים כירורגיים 4-0 משי שאינם נספגים.
    4. הכן גזות כותנה (5 ס"מ על 5 ס"מ) החתוכים במרכז בעקבות צורה אליפסואידית. אלה ישמשו כדי לכסות את לפרוסטומיה קו האמצע ולמנוע מגע ישיר בין iLoop חיצוני פרוות בעלי חיים. משרים את הגזות החתוכים בתמיסת מלח מאוזנת חמה של הנקס (HBSS) במיכל צלחת פטרי.
    5. הכן צמר גפן רטוב ספוג HBSS חם שישמש לטיפול באיברים ו- iLoop חיצוני.
    6. הכן מזרק 10 מ"ל מלא HBSS חם ולהתחבר צינור האכלה צהוב. מזרק זה ישמש לחות רקמות חשופות במהלך הניתוח כדי לשטוף בעדינות את iLoop של תוכן צואה.
  2. הכנת בעלי חיים
    1. להרום את החיה בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר. בפרוטוקול זה תערובת של איזופלוריין וחמצן ניתנת באמצעות מאדה הרדמה. על פי הוראות היצרן, להתאים את קצב זרימת החמצן ל 1 L / min. הגדר את האידוי ל -5% וטען מראש את תא האינדוקציה. לאחר 5 דקות, להפחית אידוי איזופלוראן ל 2% - 2.5%.
    2. מניחים את החיה בתא האינדוקציה למשך 3 דקות עד 5 דקות, ולאחר מכן מעבירים את החיה ללוח ניתוח מחומם ומחברים תקע אף הרדמה. לרסן את החיה בתנוחה על ידי ארבעת הגפיים באמצעות סרט הדבקה.
      הערה: כחלופת הרדמה, תערובת של קטמין (80 מ"ג/ק"ג - 100 מ"ג/ק"ג) וקסילאצין (5 מ"ג/ק"ג - 10 מ"ג/ק"ג) מדולל בתמיסת מלח (0.9% NaCl) ניתן לנהל על ידי הזרקה תוך-גופית. הרדמה צריכה להישמר לאורך כל הניתוח על ידי ניהול תוך שרירי של קטמין/ קסילסין (ב 0.1 - 0.25 פעמים של מינונים ראשוניים) כדי להבטיח עומק הרדמה. אם זמין, אידוי הרדמה איזופלורן מומלץ מאוד להבטיח רבייה טובה יותר, שרידות ולמנוע כאב בעלי חיים.
    3. יש למרוח משחה עיניים על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש קרנית.
    4. בצע בדיקה גופנית הכוללת קצב לב (סביב 500 פעימות / דקה) וקצב, צבע קרום רירי (ורוד), זמן מילוי נימי (< 2 s), קצב נשימה (לא נמוך מ 40 - 60 נשימות / דקה), וטמפרטורה (36 °C (36 °C)32.
    5. לפני שתמשיכו לשלבים הבאים, העריכו את עומק ההרדמה על ידי רפלקס משיכת דוושות. השתמש גירוי כואב (קמצוץ) של העור בין בהונות ו /או רפידות בוהן. העכבר יגיב על ידי התכווצות והסרת רגלו. רפלקס הדוושה הזה נעלם כאשר בעלי החיים הוא מרדים עמוק.
      הערה: ניטור של סימנים חיוניים ורפלקס דוושה מומלץ לאורך כל ההרדמה לכל הפחות כל 15 דקות. הנחיות מוסדיות לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) להערכת עומק הרדמה ממליצות ניטור של הדברים הבאים: (א) צבע הזנב, הרגל והריריות (כגון לשון). צבע ורוד כמו נורמלי חיוור או כחול כמעיד על זלוף דם ירד או מצוקה נשימתית; (ב) הערכת דפוס הנשימה כנשימות רגילות לעומת נשימות לא סדירות. בדיקה טמפרטורה רקטלית, oximeter מכרסמים ומוניטורים קצב הלב יכול לשמש להערכת טמפרטורת הגוף, קצב הלב והנשימה, בהתאמה.

2. דור לולאת האיל

  1. הכנת העור: לשפשף פרווה של קו האמצע הבטן עם ספוגיות אלכוהול או ספוג גזה ספוג עם 70% אתנול. אין להרטיב אזור רחב של פרווה עם אלכוהול כדי למנוע היפותרמיה.
  2. באמצעות מספריים, לבצע לפרוסטומיה בקו האמצע. לעשות קיסם אנכי באמצע הבטן (כ 2 ס"מ אורך) ולחשוף את צפק. היזהר לא לפגוע באיברים תוך-בטן.
  3. מניחים גזת כותנה רטובה חתוכה מראש על חלל הבטן החשוף.
  4. השתמש דגימות כותנה רטובה כדי לגייס חיצוני את caecum. מניחים בזהירות את הקקום על גזת הכותנה הרטובה.
    הערה: Caecum הוא מקומי ברביע caudal השמאלי של חלל הבטן ברוב העכברים ללא תלות המין של החיה.
  5. השתמשו בדגימות כותנה רטובות כדי להתגייס ולחוץ בעדינות את האיליום שבו החלק הסופי (קצה דיסטלי) מחובר לקאקום(איור 1B).
  6. לפרוס לפחות 6 ס"מ של ileum מסוף על גזה כותנה רטובה ללא הפרעה של כלי mesenteric ואספקת הדם. אספקת הדם נשמרת אם אין דימום והרקמה שומרת על צבעה הוורוד(איור 1B).
    הערה: הימנע ייבוש של רקמות חשופות על ידי שמירה על רקמות לחות בכל עת עם HBSS חם (כל 2 - 3 דקות) באמצעות מזרק 10 מ"ל מחובר צינור האכלה צהוב (שלב 1.1.6).
  7. קרוב לקאקום, זהה את העורק הראשי המספק את האיליום במזנטריה. לאחר מכן אתר שני אתרי קשירה במזנטריה נטולי כלי דם קריטיים.
  8. באמצעות מלקחיים רקמה קהה, בחוזקה לתפוס את ileum מסוף (הקרוב ביותר caecum) ושימוש מלקחיים קצה עדין, fenestrate mesentery הימנעות כלי הדם. מניחים תפר משי על פני הניקוד וקושרים קשר כירורגי כדי ליצור את הקשירה הראשונה (קצה דיסטלי של הלולאה).
  9. השתמש בסרגל כדי למדוד 4 ס"מ מהקשירה הראשונה וליצור את הקשירה השנייה (הקצה הפרוקסימלי של הלולאה) כאמור בשלב 2.8 (איור 1C).
  10. עם מספריים עדינים חתוכים בזהירות ליד כל קשירה כדי לבודד את לולאת ileal 4 ס"מ, שמירה על אספקת דם שלמה ממברנה mesenteric.
    הערה: לחתוך את שני הקצוות של החלק החיצוני של iLoop, ולאחר מכן לשטוף בעדינות כצעד הכרחי המונע הפרעה עם תוכן זוהר (חומר צואה), ובכך להקל על פיזור אפילו של FITC-dextrans או גירויים כימיים לאורך כל המקטע המבודד, כמו גם המאפשר כימות מדויק יותר של לויקוציטים על ידי ציטומטריית זרימה. הליך זה מאפשר גם התנערות אחידה של הרירית לאחר הזרקת כרכים מוגדרים של ריאגנט ושחזור טוב יותר בין בעלי חיים.
  11. שטף בעדינות את התוכן של מקטע לולאת ileal עם HBSS חם באמצעות צינור הזנה צהוב גמיש המחובר למזרק 10 מ"ל (ראה שלב 1.1.6).
  12. ליגת את שני הקצוות החתוכים של לולאת האילול הסמוקה באמצעות תפר משי.
  13. השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 30 G לאט להזריק 250 μL של ריאגנט כגון FITC-dextrans (שלב 4.2) או chemokine (שלב 5.3) לתוך לומן המעי. לולאת האיליאל תנפח ותגרום להתנפחות מתונה של הרירית (איור 1D).
    הערה: הזריקו ריאגנט ללולאה לומן בצד הנגדי של העורק המזנטרי. היזהר לא לשלוף את לולאת ileal מן החיה תוך הזרקה כדי למנוע קריעת כלי הדם ולעורר דימום.
  14. בעזרת צמר גפן רטוב, החזירו בעדינות את לולאת האילול, האילאום הפרוקסימלי והקאקום.
  15. השתמש מחזיק מחט, מלקחיים אנטומיים 3.0 תפרי משי שאינם נספגים עם מחט חיתוך הפוכה כדי לסגור את דופן הבטן.
  16. מניחים את החיה בתא הרדמה מווסת טמפרטורה לתקופת הדגירה.

3. יצירת לולאת המעי הגס הפרוקסימלית (pcLoop)

הערה: לקבלת פרטים אודות עכברים ששימשו ליצירת pcLoop, עיין במידע שסופק בתחילת סעיף הפרוטוקול.

  1. בצע את שלבים 2.1. - 2.4. כפי שתואר לעיל עבור לולאת ileal.
  2. בעזרת צמר גפן רטוב, יש לחוץ את האיליום כולו ומניחים אותו על גבי גזת כותנה רטובה. זהה את המעי הגס הפרוקסימלי ואת אספקת הדם הממוקמת במזוקולון. גייסו את המעי הגס הפרוקסימלי ובאמצעות מלקחיים עדינים יוצרים את הקשירה הראשונה באזור נקי מכלים במזוקולון במהירות של כ-0.5 ס"מ מהקקום(איור 2B).
  3. מדוד 2 ס"מ מהקשירה הראשונה וצור קשירה שנייה באזור נקי מאספקת דם במזוקולון(איור 2C).
  4. באמצעות מספריים עדינים לחתוך בזהירות ליד כל קשירה כדי לבודד pcLoop באורך 2 ס"מ.
    הערה: כפי שהוזכר בפתק תחת שלב 2.10, חשוב לחתוך את שני הקצוות כדי לבודד pcLoop כי הוא ניקה בעדינות של תוכן זוהר. לחתוך בזהירות דרך הרקמה המעי הגס mesocolon כדי למנוע כלי קטן מדימום לתוך לומן המעי. במידת הצורך, השתמש בכרוה תרמית כדי להגביל את הדימום באתר החתכים.
  5. יש לשטוף בעדינות את ה-pcLoop עם HBSS חם כדי להסיר צואה באמצעות צינור הזנה צהוב גמיש המחובר למזרק 10 מ"ל (ראה שלב 1.1.6).
  6. ליגט את שני קצות החתכים של pcLoop הסמוק באמצעות תפר משי.
  7. השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 30G לאט להזריק 200 μL של ריאגנט כגון FITC-dextrans (שלב 4.2) או chemokine (שלב 5.3) לתוך לומן המעי. ה- pcLoop יתנפח ויגרום להתנפחות מתונה של הרירית (איור 2D).
    הערה: הזריקו את ריאגנט ל-pcLoop לומן בצד הנגדי של העורק המזנטרי. להבטיח עקביות בין בעלי חיים וליצור pcLoop באורך 2 ס"מ כדי להבטיח התנערות שווה של הרירית.
  8. השתמש בטפטוף כותנה רטוב כדי להחזיר בעדינות את ה- pcLoop, האילול והקקום המסונפים לחלל הבטן.
  9. השתמש מחזיק מחט, מלקחיים אנטומיים 3.0 תפרי משי שאינם נספגים עם מחט חיתוך הפוכה כדי לסגור את דופן הבטן.
  10. מניחים את החיה בתא הרדמה מווסת טמפרטורה לתקופת הדגירה.

4. הערכה כמותית של חלחיליות מעיים: 4 kDa FITC-dextran assay

  1. בצע לולאת ileal או pcLoop (כמתואר לעיל).
  2. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 30 G, להזריק לתוך לומן המעיים או 250 μL (ileum - שלב 2.13) או 200 μL (המעי הגס - שלב 3.7) של 4 kDa FITC-dextran פתרון (1 מ"ג / מ"ל ב HBSS). שמור על פתרון FITC-dextran שאינו בשימוש מוגן מפני אור כדי להכין את העקומה הסטנדרטית לאחר איסוף הסרום.
  3. עבור לולאת ileal בצע את השלבים 2.14 עד 2.16, עבור pcLoop שלבים 3.8 עד 3.10. בקצרה, לשים איברים ו iLoop בחזרה במקום לתוך חלל הבטן, לסגור את דופן הבטן.
  4. מניחים את החיה במשך 120 דקות בתא הרדמה מחומם.
  5. לאחר תקופת הדגירה לפתוח את דופן הבטן, לקבל גישה ללב ולבצע ניקוב לב באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 25G כדי לאסוף את הדם. מעבירים דם לצינור הפעלה של קריש דם בסרום 1.3 מ"ל, מערבבים בעדינות ושומרים על קרח מוגן מפני אור. לאסוף לפחות 500 μL של דם לעכבר.
    הערה: בעלי חיים מורדמים כאשר הם נמצאים תחת הרדמה באמצעות שיטה פיזית כגון עריפת ראש או נקע צוואר הרחם, ובהתאם לפרוטוקול בעלי החיים שאושר.
  6. צינור מפעיל קרישת סרום צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 x גרם בטמפרטורת החדר על פי המלצות היצרן. לאסוף את הסרום (supernatant) ולהעביר לתוך צינור צנטריפוגה 1.7 מ"ל. שמור את הצינור על קרח ומוגן מפני אור.
  7. כימות פלואורסצנטיות בסרום דם
    1. הכן עקומה סטנדרטית של FITC-dextran 4 kDa בסרום של עכברי בקרה (מלוחים או HBSS היא חלופה תקפה). צור דילול טורי כפול עם ריכוז התחלתי של 1 מ"ג / מ"ל FITC-dextran. FITC-dextran 4 kDa ריכוזים הנמדדים בטווח שבין 0.25 מ"ג /מ"ל ו 2 מיקרוגרם / מ"ל.
    2. העבר נפח שווה של המדגם והסטנדרטים ללוח שחור 96-באר (תחתון שטוח) ולמדוד FITC בקורא לוחות פלואורסצנטי (עירור 490 ננומטר, פליטה 520 ננומטר), על פי הוראות היצרן ופרוטוקולים שפורסמו33. חשב את ריכוז FITC בהתבסס על העקומה הסטנדרטית או ערכי החמיאות הנוכחיים כקיפול-שינוי מנורמל לקבוצת הביקורת הניסיונית.

5. הערכה כמותית של PMN נודד לתוך לומן המעי לאחר גירוי תוך אלומינלי עם כימותרפיה

הערה: מעט מאוד PMN מתגוררים ברירית המעיים ברמה הבסיסית. טיפול מקדים בבעלי חיים עם ציטוקינים פרו דלקתיים גורם לסביבה דלקתית המאפשרת גיוס PMN ממחזור הדם אל רירית המעי.

  1. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 30 G, לבצע הזרקה intraperitoneal (i.p.) של פתרון סטרילי של 100 ננוגרם של פקטור נמק הגידול α (TNFα) ו 100 ננוגרם של אינטרפרון-γ (INFγ) ב 200 μL של פוספט חוצץ מלוחים (PBS).
  2. לאחר 4 - 24 שעות של טיפול מקדים עם ציטוקינים פרו דלקתיים, לבצע לולאה ileal או pcLoop (כמתואר לעיל).
  3. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 30 G, להזריק לתוך לומן המעיים או 250 μL (ileum - שלב 2.13) או 200 μL (המעי הגס - שלב 3.7) של פתרון chemoattractant Leukotriene B4 (LTB4) 1 nM ב HBSS.
    הערה: Leukotriene B4 (LTB4) משמש בפרוטוקול זה כמו כימותרפיה חזקה עבור PMN. כימותרפיה אחרת כגון N-פורמילמתיניל-לאוסיל-פנילאלנין (fMLF) או כימוקין (מוטיב C-X-C) ליגנד 1 (CXCL1/KC) יכולים לשמש גם כדי לגרום לגיוס משמעותי של PMN לתוך לומן המעי הגס30.
  4. עבור לולאת ileal בצע את השלבים 2.14 עד 2.16. עבור pcLoop בצע את השלבים 3.8 עד 3.10. בקצרה, לשים איברים ו iLoop בחזרה במקום לתוך חלל הבטן, לסגור את דופן הבטן.
  5. מניחים את החיה במשך 60 דקות בתא הרדמה מחומם.
  6. אוסף תוכן לולאת המעי
    1. הכן פתרונות ואחסן על קרח: עבור לולאת ileal ו- pcLoop, הכינו מאגר כביסה המכיל 2 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), 5 mM Dithiothreitol (DTT) ו-2% FBS ב-PBS סטרילי ללא סידן ומגנזיום.
    2. לאחר תקופת הדגירה ותחת תחזוקת הרדמה, פתחו את דופן הבטן ושלפו את ה-iLoop (לולאת ileal או pcLoop). המת חסד בעלי חיים כאשר הם תחת הרדמה באמצעות שיטה פיזית כגון עריפת ראש או נקע צוואר הרחם, ובהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר.
    3. יש לשטוף את הלולאה עם PBS קר כדי להסיר כל שאריות זיהום דם ולספוג עודף PBS עם מגבונים רקמה. בזהירות לאסוף את תוכן הלולאה לתוך צינור צנטריפוגה 1.7 מ"ל (כ 250 μL עבור לולאה ileal ו 200 μL עבור pcLoop). לשטוף את הלולאה עם חוצץ לשטוף קר 500 μL, מיד לאחר האיסוף, למקם את הצינור על קרח.
      הערה: DTT מסייע להמסת ריר. אם תוכן זוהר iLoop הוא מאוד צמיג (בהתאם לרקע הגנטי של העכבר), לדלל אותו 1:2 או 1:3 עם מאגר לשטוף המכיל DTT.
    4. להעביר את פתרון התוכן הזוהר דרך מסנן רשת ניילון 35 מיקרומטר באמצעות צינור עגול 5 מ"ל עם כובע מסננת תא. שלב זה מסייע בהסרת שברי רקמות וצבירים של תאים. לשטוף את מסננת התא עם 1 מ"ל של חוצץ לשטוף.
    5. צינור צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F). להשליך supernatant, לשטוף גלולה עם 500 μL - 1 מ"ל לשטוף חוצץ, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות, 4 °C (4 °F).
    6. גלולה של תאי אור iLoop resuspend ב 200 μL של חוצץ ציטומטריית זרימה (FCB) המכיל 2% FBS ב- PBS סטרילי ללא סידן ומגנזיום. תאים יכולים להישמר בצינור או מועברים לצלחת תחתונה עגולה 96 היטב עבור כתמים ציטומטריה זרימה וניתוח.
  7. כתמים וניתוח ציטומטריה של זרימה
    1. בקרת פיצוי: תאי דם לבנים
      1. הכן מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 G מלא מראש עם סטרילי 0.5 M EDTA (pH 8.0). 10% EDTA לכל נפח דם צפוי (100 μL של EDTA עבור 1 מ"ל דם).
      2. לאסוף דם תחת הרדמה על ידי ניקוב לב. להעביר דם לתוך צינור 1.7 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות, 4 °C (7 °F).
        הערה: בעוד העכבר נמצא תחת הרדמה להשתמש בשיטה פיזית כדי לאשר מוות בהתאם לפרוטוקול בעלי חיים שאושר (כגון נקע צוואר הרחם).
      3. שאף את סופר-טבעי. Resuspend הכדור ב 1 מ"ל של אמוניום-כלוריד-אשלגן(ACK) חוצץ תמוז עבור תמוז של תאי דם אדומים. דגירה במשך 3 דקות - 5 דקות על קרח. צנטריפוגה 400 x גרם למשך 5 דקות, 4 °C (70 °F). אם הכדור עדיין אדום, חזור על שלב חיץ תמוז ACK זה עד שהכדור יהפוך ללבן.
      4. resuspend הכדור ב 1 מ"ל FCB צלחת 0.5 x 106- 1 x 106 של תאים לבאר. הכינו חמש בארות של צלחת עגולה 96 היטב. מניחים את הצלחת על קרח.
        הערה: השתמש באותה צלחת של 96 באר המכילה את התוכן הלומינלי של הלולאה (ראה שלב 5.6.6).
    2. כתמי ציטומטריה של זרימה
      1. צנטריפוגות צלחת 96-באר במשך 5 דקות ב 400 x גרם,4 °C (70 °F). להשליך את supernatant ו resuspend הכדורים עם 50 μL של CD16/CD32 עכבר מטוהרים כמו בלוק Fc (1 מיקרוגרם לכל 100 μL של FCB). דגירה במשך 5 דקות - 10 דקות על קרח.
      2. חיסון של התוכן הזוהר iLoop: הכן תערובת המכילה את כל הנוגדנים מצומדים פלואורוכרום (1:50 דילול ב- FCB): אנטי CD45-PerCP, אנטי CD11b-PE ואנטי-Ly-6G-Alexa Fluor 647. הוסף 50 μL של השילוב לכל באר, עבור נפח סופי של 100 μL.
      3. חיסון של תאי הדם הלבנים לפיצויים (1:50 דילול ב- FCB): השתמש ב- 50 μL של FCB בלבד (מדגם לא מזוהם, ובכן 1), 50 μL של כל נוגדן מצומד פלואורוכרום בודד (בארות 2 - 4), 50 μL של השילוב של כל הנוגדנים מצומדים פלואורוכרום (טוב 5). נפח סופי של 100 μL.
      4. לדגור על הצלחת במשך 30 דקות על קרח מוגן מפני אור.
      5. צנטריפוגות את הצלחת במשך 5 דקות ב 400 x גרם,4 °C (5 °F). להשליך את supernatant ולשטוף עם 200 μL של FCB. חזור על שלב הכביסה הזה פעמיים.
      6. הוסף FCB 150 μL / באר לדגימות הדם.
      7. הוסף 100 μL / גם FCB לדגימת התוכן הזוהר iLoop. ואז 50 μL / באר של חרוזי ספירה פלואורסצנטיים.
    3. ניתוח ציטומטריית זרימה
      1. שער לאירועים חיוביים CD45 ולביטוי של Ly-6G-/Gr-1 ו- CD11b30.
      2. השתמש ב- 100 μL של אמצעי האחסון לדוגמה כתנאי עצירה.
      3. חשב את המספר המוחלט של PMN שהועבר ל- iLoop lumen בעקבות המידע שסופק על ידי היצרן של חרוזי ספירה פלואורסצנטיים.
        הערה: הנתונים עשויים להיות מוצגים כ -(1) המספר הכולל של PMN בלומן30,34,35, (2) מספר PMN לגרם של רקמה וכן (3) מספר PMN למ"מ3 באמצעות הנוסחה לנפח של גליל: V = π(pi) r 2 שעות (V עבור נפח, r עבור רדיוס ו- h לגובה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצוג סכמטי של דגמי לולאת ileal ו- pcLoop מתואר באיור 1 ובאיור 2, בהתאמה. התמונות האנטומיות מציגות את השלבים הקריטיים של ההליך, כולל חשיש של מקטע המעי (איור 1B ואיור 2B),זיהוי מיקום מתאים לקשירות המאפשר הפרעה מינימלית באספקת הדם (איור 1C ואיור 2C) וניקוי ואחריו קשירה של קצות חתוכים של ה- iLoo...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המנגנונים האחראים על dysregulation של תפקוד מחסום המעי וגיוס תאי מערכת החיסון בתנאים פתולוגיים כגון IBD אינם מובנים לחלוטין. כאן, אנו מפרטים מודל חזק ב vivo murine אשר מעסיק קטע מעיים חיצוני היטב של ileum או המעי הגס הפרוקסימלי ומאפשר הערכה של חדירה במעיים, מחקרי הגירה נויטרופילים, כמו גם יישומים אחרים.

ה- iLoop הוא ניתוח ללא התאוששות המתבצע על בעלי חיים חיים. הרדמה חייבת להיות במעקב רציף במהלך הניסוי והערכה של עומק הרדמה היא חובה. הצעדים הקריטיים ביותר כוללים (1) בידוד של iLoop, (2) קשירה של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר סוון פלמינג מאוניברסיטת וירצבורג על תרומתו להקמת מודל לולאת המעי הגס הפרוקסימלי, שון ווטסון על ניהול מושבות העכברים וצ'ית'רה ק. מוראלדהרן על שעזרו ברכישת התמונות של מודל iLoop. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית /DFG (BO 5776/2-1) ל- KB, R01DK079392, R01DK072564 ו- R01DK061379 ל- C.A.P.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד וחומר
BD ספוגיות אלכוהולBD326895
BD מחט PrecisionGlide, 25G X 5/8 אינץ'BD305122
BD PrecisionGlide, 30G X 1/2 אינץ'BD305106
BD מזרק טוברקולין 1 מ"ל ללא מחטBD309659
15 מ"ל צינור צנטריפוגהקורנינג14-959-53A
קורנינג 96-באר מוצק פוליסטירן שחור מיקרופלייטFisherScientific07-200-592
קורנינג צלחת תרבית לא מטופלת, 10 ס"מMilliporeSigmaCLS430588
כותנה קצה מוליך (צמר גפן), 6 אינץ', סטריליFisherScientific25806 2WC
Dynarex כותנה מילוי גזה ספוגים, וופורייזר הרדמה לא סטרילי, 2 אינץ' x 2 אינץ'Medex3249-1
EZ-7000 (מערכת קלאסית, כולל יחידות חימום)E-Z SystemsEZ-7000
צינור צנטריפוגה פלקון 50 מ"ל VWR21008-940
סרט תיוג צבעוני של פישרברנדFisherScientific15-901-10R
מחזיק מחט הלסי (מחזיק מחט) FST12001-13
Kimwipes, קטן (מגבון טישו)FisherScientific06-666
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל תומאס סיינטיפיק c2170
מיקרו שפופרת 1.3 מ"ל Z (שפופרת מפעיל קרישי סרום)Sarstedt 41.1501.105
Moria מספריים עדיניםFST14370-22
5 מ"ל צינור פוליסטירן עגול תחתון עם מכסה מסננת תאים (35 ומיקרו; רשת ניילון)Falcon352235
Puralube משחה וטרינרית, חומר סיכה עיני סטריליDechra12920060
מלקחיים טבעתיים (מלקחיים של רקמות קהות)FST11103-09
Roboz Surgical 4-0 משי שחור קלוע, 100 YDFisherScientificNC9452680
מלקחיים של Semken (מלקחיים אנטומיים)FST1108-13
Sofsilk לא נספג תפר שחור תפר קלוע משי גודל 3-0, 18 אינץ', מחט 19 מ"מ אורך 3/8 עיגול חיתוך הפוך HenryScheinSS694
מלקחיים עדינים לסטודנטים, זוויתיFST91110-10
מזרק 10 מ"ל PP/PE ללא מחטMillipore Sigma 
96 באר תרבית תאים צלחתקורנינג3799
צינורות הזנה צהובים למכרסמים 20 גרם x 30 מ"מInstechFTP-20-30
<חזק>פתרונות ומאגרים
Accugene 0.5M EDTALonza51201
אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) מאגר ליסינגBioWhittaker10-548E
תמיסת מלח מאוזנת של הנקסקורנינג21-023-CV
תמיסת מלח חוצצת פוספט ללא סידן ומגנזיוםקורנינג21-040-CV
חזק>ריאגנטים
Alexa Fluor 647 נוגדן Ly-6G נגד עכבר (1A8)BioLegend127610
CD11b נוגדן חד שבטי, PE, eBioscience (M1/70)ThermoFisher12-0112-81
CountBright חרוזי ספירה מוחלטתInvitrogenC36950
DithiotreitolFisherScientificBP172-5
סרום בקר עוברי, מומת בחום&; D Systems511550
פלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרן, משקל מולקולרי ממוצע 4.000סיגמא60842-46-8
איזופלורןהלופחמן12164-002-25
לויקוטריאן B4Millipore Sigma71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)BD Pharmingen557235
עכברוש מטוהר נגד עכבר CD16/CD32 (עכבר BD FC Block)BD Bioscience553142
עכברים רקומביננטיים IFN-γPeprotech315-05
עכברים רקומביננטיים TNF-ואלפא;פפרוטק315-01A
Z248029< R

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
  3. Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn's disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
  4. Michielan, A., D'Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157(2015).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
  6. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  7. Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  8. Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
  9. Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
  10. Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
  11. Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
  12. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98(2019).
  13. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).
  14. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  15. Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
  16. Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
  17. Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
  18. Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037(2018).
  19. Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
  20. Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
  21. Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095(2017).
  22. Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
  23. Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
  24. Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
  25. Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
  26. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
  27. Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
  28. Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
  29. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  30. Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
  31. Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
  32. Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
  33. JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , JoVE, Cambridge, MA. e5024(2020).
  34. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  35. Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
  36. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606(2016).
  37. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  38. Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
  39. Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
  40. Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709(2020).
  41. Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392(2015).
  42. Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49(2016).
  43. Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FITC DextranJAM A

מאמרים קשורים