מערכת GAL4-UAS הדו-צדדית היא כלי רב-תכליתי לשינוי ביטוי גנים באופן ספתיוטמפורלי מבוקר המאפשר ניתוח גנטי תפקודי בגמביה אנופלס. ההליכים המתוארים לשימוש במערכת זו הם אסטרטגיית שיבוט סטנדרטית למחצה, סקס וסינון של גלמים עבור סמני חלבון פלואורסצנטיים קיבעון עובר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש במערכת GAL4-UAS לגנטיקה תפקודית בגמביה אנופלס
במאמר זה
סיכום
תקציר
מערכת GAL4-UAS הדו-צדדית היא כלי רב-תכליתי ורב עוצמה לניתוח גנטי פונקציונלי. המהות של המערכת היא לחצות קווי 'נהג' מהונדסים המבטאים את גורם שעתוק השמרים GAL4 באופן ספציפי לרקמה, עם קווי 'מגיב' מהונדסים הנושאים מבנה הפרעות גן/RNA מועמד שהביטוי שלו נשלט על ידי רצפי הפעלה במעלה הזרם (UAS) הקושרים את GAL4. בצאצאים שלאחר מכן, הגן או מבנה ההשתקה מתבטא אפוא באופן spatiotemporal שנקבע, המאפשר פנוטיפים הנובעים להיות נבזי ותפקוד הגנים להסיק. המערכת הבינארית מאפשרת גמישות בגישות ניסיוניות למסך פנוטיפים הנוצרים על ידי ביטוי טרנסג'ן בדפוסים ספציפיים לרקמות מרובות, גם אם עלויות כושר חמורות מושרות. התאמנו את המערכת הזו לאנופלס גמביה, וקטור המלריה העיקרי באפריקה.
במאמר זה, אנו מספקים חלק מההליכים הנפוצים המשמשים במהלך ניתוח GAL4-UAS. אנו מתארים את קווי AN. gambiae GAL4-UAS שכבר נוצרו, כמו גם את השיבוט של מבני מגיב חדשים עבור upregulation ו RNAi נוקאאוט. אנו מציינים מדריך צעד אחר צעד למין של גולם יתושים כדי ליצור צלבים גנטיים, הכולל גם צאצאי סינון כדי לעקוב אחר ירושה של סמני גנים פלואורסצנטיים המתייגים את הנהג ואת החדרות המגיב. אנו מציגים גם פרוטוקול לפינוי עוברים של גמביה כדי לחקור התפתחות עוברית. לבסוף, אנו מציגים התאמות פוטנציאליות של השיטה ליצירת קווי נהג באמצעות CRISPR/Cas9 החדרה של GAL4 במורד הזרם של גנים היעד.
מבוא
מערכת GAL4-UAS הדו-מפלגתית היא סוס העבודה של אפיון תפקודי של גנים באורגניזם מודל החרקים Drosophila melanogaster1,2,3. כדי להשתמש במערכת GAL4-UAS, קווי נהג מהונדסים, המבטאים את גורם שעתוק השמרים GAL4 תחת שליטה על רצף רגולטורי, נחצים עם קווי מגיב הנושאים מבנה של עניין או הפרעות RNA (RNAi) הנשלט על ידי רצף הפעלה במעלה הזרם (UAS) המוכר על ידי GAL4. צאצאי הצלב הזה מבטאים את הטרנסג'ן של העניין בתבנית מרחבית המוכתבת על ידי האמרגן השולט בביטוי GAL4 (איור 1). פנוטיפים המוצגים על ידי צאצאים של צלבים מגיבים לנהג ניתן להעריך כדי להדגיש את הפונקציה של גנים מועמד.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תכנון ובניית מבנים של UAS
- עיצוב והרכבה של וקטורים לביטוי גנים מועמד
- קבע את הרצף שישמש לתרוממות גנים מועמדים.
- רצף את cDNA / gDNA מתוך המתח של עניין ולהשוות אותו לרצף שפורסם כדי לאמת את זהותו ולזהות SNPs פוטנציאליים ואתרי הגבלה לעיכול אבחוני.
- ודא כי פריימר קדימה המשמש להגברת גנים מכסה את רצף Kozak המקומי ולהתחיל קודון, במידת הצורך. פריימר עם ~ 10 bp מחייב במעלה הזרם של קודון ההתחלה יקיף את רצף Kozak.
- כלול את קודון העצירה בקטע המוגבר מהפריימר ההפוך ברוב הנסיבות. השתמש ברצפי סיום של 3' המסופקים בווקטורים הפלסמידים המתוארים, או להגביר רצפים גנומיים של גנים מועמדים.
- הזמינו ר....
- קבע את הרצף שישמש לתרוממות גנים מועמדים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ביטוי 3xP3 של eYFP, dsRed ו- eCFP מספק זיהוי אמין, ניתן להבחין בקלות של אנשים בעלי גנים של הסמן המייצרים ביטוי בעיניים ובגרעיני גחון של גומה א. גמביה (איור 3). המורפולוגיה הדיפרנציאלית שנצפית באיברי המין החיצוניים של גברים ונשים המשמשים למין ודוגמה לגולם בלתי מזוהה מודגשות באיור 4. הסרת כל המים מהגולם מגבירה את הקושי המיני כאשר משוטים אנאליים מטשטשים הדמיה של איברי המין (איור 4D,E). מערכת GAL4-UAS .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הבנת תפקוד גן היתושים חיונית לפיתוח גישות חדשות לשליטה באנופלים ולהשפעת העברת המלריה. מערכת GAL4-UAS המתוארת היא מערכת רב-תכליתית וחזקה לניתוח פונקציונלי של גנים מועמדים ועד כה השתמשנו במערכת כדי לבחון את הבסיס הגנטי של עמידות לחומרי הדברה17 וייצור פחמימנים חמודים15,23, כמו גם לתייג באופן פלואורסצנטי אוכלוסיות תאי יתושים שונות8 . עד כה נוצרו מבנים מגיבים באמצעות שיבוט אנזימי הגבלה לפלסמיד, הנושא אתר שיבוט מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים במימון מ- LSTM ו- IVCC (אדריאנה אדולפי), BBSRC (פרס החוקר החדש (AL), MRC (סטודנט לדוקטורט ל- BCP:MR/P016197/1), Wellcome (מלגת פוסט-דוקטורט של סר הנרי וולקום ל- LG: 215894/Z/19/Z) ששילבו את ניתוח Gal4UAS בהצעות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת פטרי מפלסטיק 100 x 15 מ"מ | SLS | 2175546 | חבילה של 10 |
| 1000 ומיקרו; L גילסון פיפטה | גילסון | F144059P | |
| 20/25 מ"ל צינורות אוניברסליים | Starlab | E1412-3020 | חבילה של 400 |
| 3 מ"ל פיפטות פסטר | SLS | G612398 | גריינר פסטר פיפטה 3 מ"ל סטרילי עטוף בנפרד |
| 50 מ"ל צינורות בז | פישר סיינטיפיק | 11512303 | |
| אתנול מוחלט | פישר סיינטיפיק | BP2818-500 | 500 מ"ל |
| חומצה אצטית | SLS | 45726-1L-F | 1 L |
| כלובים | SLS | E6099 | 30x30x30 עם יציאת מסך |
| מברשות צבע עדינות | אמזון | UKDPB66 | KOLAMOON 9 חתיכות סט מברשות ציור מפורטות מברשות מיניטורה לצבעי מים, ציור אקרילי, ציור שמן (יין אדום) |
| מזון דגים | אמזון | Tetra Min Fish Food, מזון מלא לכל הדגים הטרופיים לבריאות, צבע וחיוניות, 10 ליטר | |
| תמיסת פורמלדהיד | Sigma Aldrich | F8775 | |
| שואב פה | ג'ון הוק | 612 | |
| מלח בריכה | בריכת אמזון | בלגדון גרדיאן, לבריאות הדגים, איכות המים, טוניק כללי, חוצץ pH, 9.08 ק"ג, פינוקים 9,092 ליטר | |
| סירי גלם | Cater4you | SP8OZ | 250 סירים עם מכסים |
| דליי פלסטיק קטנים | אמזון | 2.5 ליטר דלי פלסטיק לבן עם מכסה לבן (חבילה של 10) | |
| נתרן היפוכלוריט | פישר סיינטיפיק | S25552 |
מקורות
- Brand, A. H., Perimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
