הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכת פיזור ביופילם בפצעי מורין

4.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62136

⸱

7 באוגוסט 2021

 ,  , 
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים אקס ויוו ושיטות vivo להערכת פיזור חיידקים מזיהום פצע בעכברים. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי לבדוק את היעילות של טיפולים אנטי מיקרוביאלית אקטואלי אנטי ביופילם, או כדי להעריך את יכולת הפיזור של זנים חיידקיים שונים או מינים שונים.

תקציר

זיהומים הקשורים Biofilm מעורבים במגוון רחב של מצבים כרוניים כגון כיבים ברגל סוכרתית שאינם ריפוי, סינוסיטיס כרונית, מדיה דלקת אוזניים חוזרת, ועוד רבים. תאים מיקרוביאליים בתוך זיהומים אלה מוגנים על ידי חומר פולימרי חוץ תאי (EPS), אשר יכול למנוע אנטיביוטיקה ולארח תאים חיסוניים מפני ניקוי הזיהום. כדי להתגבר על מכשול זה, חוקרים החלו לפתח סוכני פיזור כטיפולים פוטנציאליים. סוכנים אלה מתמקדים ברכיבים שונים בתוך ה- EPS של הביופילם, מחלישים את המבנה ויוזמים פיזור של החיידקים, אשר תיאורטית יכול לשפר את העוצמה האנטיביוטית ואת הסיווג החיסוני. כדי לקבוע את היעילות של סוכני פיזור עבור זיהומים פצע, פיתחנו פרוטוקולים המודדים פיזור biofilm הן ex vivo ו in vivo. אנו משתמשים במודל כריתה כירורגית של עכבר שתואר היטב כדי ליצור זיהומים כרוניים הקשורים לביופילם. כדי לפקח על פיזור vivo, אנו מדביקים את הפצעים עם זנים חיידקיים המבטאים לוציפראז. לאחר זיהומים בוגרים הוקמו, אנו להשקות את הפצעים עם פתרון המכיל אנזימים להשפיל רכיבים של EPS biofilm. לאחר מכן אנו עוקבים אחר המיקום והעוצמה של האות הזוהר בפצע ואיברים מסננים כדי לספק מידע על רמת הפיזור שהושגה. לניתוח ex vivo של פיזור biofilm, רקמת פצע נגוע שקוע בתמיסת אנזים משפיל biofilm, ולאחר מכן עומס חיידקי שנותר ברקמה, לעומת עומס חיידקי בתמיסה, מוערך. שני הפרוטוקולים יש חוזקות וחולשות והוא יכול להיות אופטימיזציה כדי לעזור לקבוע במדויק את היעילות של טיפולים פיזור.

מבוא

עליית עמידות לאנטיביוטיקה ברחבי העולם מובילה לחוסר אפשרויות אנטיביוטיות לטיפול במגוון זיהומים חיידקיים1. בנוסף לעמידות לאנטיביוטיקה, חיידקים יכולים להשיג סובלנות אנטיביוטית על ידי אימוץ אורח חיים הקשור לביופילם2. ביופילם היא קהילה של מיקרואורגניזמים המוגנים על ידי מטריצה של פוליסכרידים, דנ"א חוץ תאי, שומנים וחלבונים3, הנקראים באופן קולקטיבי החומר הפולימרי החוץ תאי (EPS). ככל שמשבר ההתנגדות לאנטיביוטיקה נמשך, אסטרטגיות חדשות המאריכות את השימוש, או מחזקות את היעילות של, אנטיביוטיקה נחוצות מאוד. סוכני אנטי-ביופילם הם פתרון מבטיח אחד4.

בין אסטרטגיות אנטי-ביופילם שונות שהוצעו, ניצול סוכני פיזור, אשר למקד רכיבים שונים של EPS biofilm, נמצאים בחזית הפיתוח הטיפולי5. גליקוסייד הידרולאס (GH) הם סוג אחד כזה של חומר פיזור. GH הם סוג גדול של אנזימים לזרז את המחשוף של קשרים שונים בתוך פוליסכרידים המספקים שלמות מבנית EPS. הקבוצה שלנו, כמו גם אחרים, הראו כי GH יכול ביעילות להשפיל biofilms, לגרום לפיזור ולשפר את היעילות האנטיביוטית עבור מספר מינים חיידקיים שונים, הן במבחנה והן vivo6,7,8,9,10,11.

עם עניין גובר פיזור biofilm,חשוב לפתח שיטות יעילות להעריך את יעילות הפיזור. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לטיפול בדלקות פצע הקשורות biofilm עם סוכן פיזור בעכברים, ואת ההערכה של יעילות פיזור, ב vivo ו ex vivo. המטרה הכוללת היא לספק שיטות יעילות שניתן להשתמש בהן עם מודלים פרה-קוליניים למדידת פיזור ביופילם ביעילות וביעילות.

מודל זיהום כריתה כירורגית מורין שימש במחקרים אלה כדי להקים זיהום הקשורים biofilm. השתמשנו במודל זה למעלה מ-15 שנה ופרסמנו את התצפיות שלנו בהרחבה7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. באופן כללי, זהו מודל זיהום לא קטלני שבו חיידקים נשארים מקומיים למיטת הפצע והם הקשורים לביופילם (חיידקים הנראים בצבירות המוקפות ב- EPS), ומגדירים זיהום כרוני שנמשך עד 3 שבועות. עם זאת, אם עכברים הם immunocompromised (עם סוכרת מסוג 1 למשל), הם יכולים להיות רגישים יותר לפתח זיהום מערכתי קטלני במודל זה.

בדו"ח זה, אנו מספקים פרוטוקולים להערכת פיזור של חיידקים מפצע, הן vivo ו ex vivo. שני הפרוטוקולים יכולים לשמש כדי לבחון את היעילות של סוכן פיזור ויש להם נקודות החוזק והחולשה שלהם. לדוגמה, הערכת פיזור ב vivo יכול לספק חשוב, מידע בזמן אמת על התפשטות חיידקים לחלקים אחרים של הגוף לאחר פיזור, וכיצד המארח מגיב. מצד שני, הערכת ex vivo פיזור עשוי להיות רצוי יותר עבור סינון סוכנים מרובים, מינונים, או ניסוחים, כמו הרקמה ניתן לחלק סעיפים מרובים שניתן לבדוק בנפרד, ובכך להפחית את מספר העכברים הנדרש. בעת הערכת סוכנים מרובים, אנו בדרך כלל למדוד פיזור הראשון במבחנה כפי שתואר קודם לכן 6,9,22. לאחר מכן אנו בודקים את ex vivo היעיל ביותר ומילואים בדיקות vivo עבור מספר מוגבל של סוכנים מבטיחים מאוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה של בעלי חיים נבדק ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס טק (פרוטוקול מספר 07044). מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. הכנת חיידקים לזיהומים בעכבר

הערה: כאן אנו מתארים עכברים מדביקים רק עם Pseudomonas aeruginosa. עם זאת, מינים חיידקיים אחרים עשויים לשמש כדי לגרום לזיהום. זנים וחומרים חיידקיים מפורטים בטבלת החומרים.

  1. השתמש Pseudomonas aeruginosa סוג פראי זן PAO1 נושאת את פלסמיד זוהר pQF50-lux23 עבור ניסויים אלה כפי שתואר קודם לכן7.
  2. לגדול P. aeruginosa זנים צלפים ארלנמייר מבולבל, עם רועד ב 200 סל"ד, בציר לוריא-Bertani (LB) ב 37 °C (69 °F) עבור 16 עד 20 שעות. הוסף ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל של ampicillin לתרבות הלילה של PAO1 (pQF50-lux) לתחזוקה של פלסמיד.
  3. תת-תרבות P. aeruginosa על ידי הוספת 100 μL של תרבות הלילה בקבוק ארלנמייר המכיל 10 מ"ל של מרק LB עם ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל אמביצילין. לאחר מכן לגדול עבור 2-2.5 שעות ב 37 °C (67 °F) עם רועד, כדי OD600 ננומטר של 0.4, ולאחר מכן באופן סדרתי לדלל (1:10) שלוש פעמים עבור מנה מדביקה של כ 104 תאים.

2. הכנת אנזים פיזור ביופילם

הערה: למחקר זה אנו משתמשים בתמיסה של 10% של עמילאז וצלולאז בחלקים שווים (5% מכל אחד), אשר ייקרא "GH", לטיפול בפיזור.

  1. השתמש בתמיסת GH 10% (w/v) של עמילאז (מ Bacillus subtilis)ו cellulase פטרייתי (מ אספרגילוס ניז'ר)מדולל 1 x פוספט מאגר מלוחים (PBS). השתמש PBS כטיפול בקרת הרכב.
  2. מחממים את כל הטיפולים ל-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להפעלת אנזימים.

3. בעלי חיים ניסיוניים והתקנה טרום ניתוחית

  1. עכברי בית, 5 המלטה חברים לכלוב, בתנאים מבוקרים סביבה, עם 12 שעות מחזורים אור / כהה וגישה נאותה למזון ומים.
  2. רצוי, להשתמש בעכברי וובסטר שוויצרי נקבה, בין 8 ל 10 שבועות.
  3. לשקול עכברים כדי לקבוע את הכמות הנכונה של הרדמה לנהל.
  4. ניהול הרדמה על ידי הזרקה תוך-פריטונית של קטמין 100 מ"ג/ק"ג 10 מ"ג/ק"ג קסילאזין.
  5. החל קרם עיניים (למשל, רענן P.M.) בזהירות על העין באמצעות ספוגית כותנה כדי להפחית את היובש.
  6. לפקח על פרמטרים פיזיולוגיים כולל קצב הנשימה, צבע העור, וטמפרטורת הגוף לאורך כל הניתוח.

4. ניתוח כריתת עובי מלא גב

  1. להעריך מישור כירורגי של הרדמה על ידי צביטה בוהן וניטור של קצב הנשימה ומאמץ. גילחו את משטח הגב והחילו קרם דפילטורי למשך 10 דקות (או לפי הוראות המוצר), ולאחר מכן הסירו בעדינות, והבטיחו שהעור יבש.
  2. לטיפול בכאב, לנהל 0.05 מ"ל של לידוקאין תת עורית לתוך האזור כדי להיות מגורש, ולהזריק 0.02 מ"ל של buprenorphine תת עורית לתוך עורית הצוואר. המתן 10 דקות כדי להבטיח שהשגת טיפול בכאב.
  3. לפני כריתה, לחטא את משטח הגב באמצעות ספוגית אלכוהול לצייר עיגול בקוטר 1.5 ס"מ לכיוון החלק האחורי של הגב. לשמור על שדה כירורגי סטרילי לאורך כל ההליך והשתמשו במכשירים אוטומטיים וכפפות סטריליות. כדי להגביל את הזיהום, לבצע את הניתוח על ידי מבער בונזן מואר ולהשתמש בכלים נקיים עבור כל בעל חיים.
  4. לנהל עובי מלא, פצע עור excisional לרמה של שריר panniculus עם מספריים כירורגיים.
  5. לאחר כריתה, מיד לכסות פצעים עם רוטב פוליאוריתן למחצה.
  6. להזריק כ 104 CFU של חיידקים ב 100 μL PBS מתחת להלבשה, על מיטת הפצע, כדי להקים זיהום.
    הערה: פצעים יכולים גם להיות נגועים במינים מרובים של חיידקים ו / או פטריות בו זמנית, או על ידי הצבת biofilms נוצר מראש12, או אפילו רקמת פסולת שחולצו מחולים19, על מיטת הפצע.
  7. לאחר ההדבקה, הכניסו עכברים לכלוב עם רפידות חימום וניטור עד שהם חזרו לרפלקס הימני שלהם.
    הערה: ודא כי עכברים לא להתקרר כמו זה יכול להוביל למוות.
  8. להקים זיהומים פצע במשך 48 שעות.
  9. בדוק תחבושות דבק מדי יום עבור דמעות ואזורים של אי דבקות והוחלף במידת הצורך.

5. בטיפול בפיזור vivo

הערה: כאן אנו מתארים את הניהול של סוכני הפיזור על ידי יישום סדרה של 3 פתרונות השקיית פצעים מקומיים (איור 1). עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מותאם עבור סוגים אחרים של משלוח כגון היישום של ג'לים, קרמים או רטבים.

  1. מניחים עכברים תחת הרדמה isoflurane (ב 3% ו 1 L לדקה של חמצן) תוך מתן הטיפולים.
  2. הכן שלושה מזרקים 1 מ"ל, עם 25 מחטים G, המכיל 200 μL של טיפול עבור כל עכבר.
  3. להזריק 200 μL של פתרון אנזים או PBS שליטה על הפצע על ידי הרמת בזהירות צובט את העור עם מלקחיים, מעט מעל הפצע לכיוון הראש של החיה. בזהירות לנקב את המזרק דרך העור הרים לאט להזריק את הפתרון בין ההלבשה לבין מיטת הפצע. ההלבשה מנוצל במחקר זה לעתים קרובות דבק הן את מיטת הפצע ואת הרקמה שמסביב.
    1. כדי להבטיח כי מיטת הפצע כולו מכוסה בתמיסה, בעדינות להעלות את ההלבשה עם מלקחיים, מושך אותו ממיטת הפצע, תוך הזרקת הפתרון לאט.
  4. לאחר הטיפול, מחזירים את העכברים לכלובים למשך 30 דקות.
  5. לאחר 30 דקות של חשיפה לטיפול, יש לה רדום מחדש את העכברים עם איזופלורן ולשאוף את הפתרון באמצעות מזרק, תוך הקפדה לנקב באותו אזור כמו קודם.
    הערה: פתרון שאיפה זה מכיל תאים חיידקיים מפוזרים, אשר ניתן לשמור עבור ניתוחים שונים במורד הזרם.
  6. לנהל את טיפולי ההשקיה השני והשלישי כראשון, באמצעות מזרק חדש בכל פעם.

6. בהדמיה וניתוח פיזור vivo

הערה: אם זן זוהר של חיידקים מנוצל כדי ליזום זיהום, מערכת הדמיה In Vivo (IVIS) ניתן להשתמש כדי לדמיין פיזור ממיטת הפצע.

  1. עכברי תמונה מיד לפני ואחרי הטיפול וב-10 ו-20 שעות לאחר הטיפול (איור 2 ואיור משלים 1).
  2. בצע הדמיה בזמן שעכברים נמצאים תחת הרדמה על ידי הצבתם בנפרד ב- IVIS והדמיה של כל אחד מהם במשך 5 שניות באורך גל של 560 ננומטר. שמור תמונות לניתוח נוסף.
    הערה: אורך הגל האופטימלי וזמן החשיפה יהיו תלויים בעיתונאי שבו נעשה שימוש ובמכשיר IVIS ובתוכנות ההדמיה.
  3. לצורך ניתוח, פתח תמונות בתוכנת IVIS ובחר את האזור שיש לנתח בלוח הכלים.
  4. כדי להסביר את הרקע, הנח עיגול על רקע תמונה ולאחר מכן הנח את אותו עיגול בגודל על גבי מיטת הפצע עבור כל עכבר.
  5. להעלאת ערכי מדידה, בחרו 'הצג - > מדידות אזור עניין (ROI) והעלו את טבלת המידות לגיליון אלקטרוני. הפחת את קריאת מעגל הרקע מכל אחת ממדידות מיטת הפצע כדי לחשב זוהר עבור כל דגימה. חשב אחוז זוהר שהשתנה על-ידי:
    החזר על ההשקעה טרום טיפול לאחר טיפול / החזר על ההשקעה) x 100.
    הערה: יש לנתח עכברים בשליטה ובטיפול בו-זמנית כדי לנרמל משתנים שעשויים להשפיע על רכישת תמונה או זוהר.

7. הערכת פיזור על ידי קביעת CFU

  1. באופן אנושי המתת חסד עכברים על ידי הזרקה תוך-אישית של 0.2 מ"ל של נתרן pentobarbital (למשל, קטלני פלוס) תחת הרדמה עם קטמין 100 מ"ג/ק"ג 10 מ"ג/ק"ג xylazine.
  2. רקמת מיטת פצע הקציר על ידי הסרת ההלבשה בעדינות עם מלקחיים סטריליים, ולאחר מכן לחתוך סביב ההיקף של מיטת הפצע עם מספריים כירורגיים סטריליים. בעדינות להרים קצה אחד של מיטת הפצע עם מלקחיים תוך שימוש במספריים לחתוך / להקניט את המדגם הרחק משכבה השריר.
  3. מניחים רקמה ממיטת הפצע בצינור הומוגניזציה 2 מ"ל שכותרתו מראש ושוקל מראש 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של PBS. לשקול את הצינורות שוב לאחר החדרת הדגימות, ולאחר מכן בעדינות להפוך 3-5 פעמים כדי לשטוף את כל חיידקים מפוזרים או דבקים באופן רופף, ולהסיר את PBS. הוסף 1 מ"ל של PBS טרי.
  4. על מנת לקצור את הטחולים, למקם עכברים במצב אנטומי עלה ומאובטח על ידי הצמדת הגפיים שלהם למשטח נתיחה. משרים את האזור כדי לנתח עם 70% אתנול על מנת לחטא את האזור ולשמור על הפרווה מזיהום המדגם.
  5. בזהירות לעשות חתך קטן בניצב לקו האמצע עם מספריים כירורגיים בדרמיס של הבטן התחתונה, הקפד למשוך את העור למעלה והתרחקות האיברים הפנימיים. המשך את החתך בפנים, לאורך קו האמצע, עד עצם החזה הושגה. לאחר חלל הצפק נחשף ואת האיברים הפנימיים היו גלויים, בעדינות להפריד את הטחול מרקמת החיבור ומניחים בצינור הומוגניזציה נפרד.
  6. שוקלים טחול ולשטוף עם PBS, כמתואר עבור רקמת מיטת הפצע.
    הערה: איברים אחרים בעלי עניין ניתן לקצור באופן דומה.
    1. בעת ביצוע החתך הראשוני, יש להקפיד להימנע מניקוב המעיים, או איברים אחרים.
  7. דגימות הומוגניזציה בצינורות טחנת חרוזים 2 מ"ל מלא מראש באמצעות homogenizer ספסל ב 5 m/s עבור 60 s, פעמיים.
  8. כדי למנות CFU, לדלל דגימות באופן סדרתי צלחת ספוט על אגר סלקטיבי. עבור דילול סדרתי, פיפטה 100 μL של המדגם לתוך 900 μL של PBS בצינור 1.5 מ"ל, מערבולת, ולחזור 5 פעמים. פיפט 10 μL של כל דילול על צלחת אגר כפי שמוצג באיור 3.
    הערה: אם נדרשת כמות CFU מדויקת יותר, מורחים 100 μL מכל דילול של המדגם על פני לוחות אגר נפרדים.

8. הערכה אקס ויוו של פיזור (איור 4)

  1. פצע עכברים להדביק עם כ 104 PAO1 כמתואר לעיל, ולאחר מכן המתת חסד 48 שעות לאחר ההדבקה.
  2. הסר בזהירות את ההלבשה עם מלקחיים, בטכניקה סטרילית ומבלי להפריע למיטת הפצע.
  3. השתמש במספריים כירורגיים סטריליים כדי לחתוך את ההיקף של מיטת הפצע הרחק מהעור נגוע באמצעות מלקחיים להרים קצה אחד של מיטת הפצע ומספריים כדי להוציא רקמת פצע נגוע משכבת השריר מתחת וסביב רקמה נגועה. לחלק דגימות מיטת פצע לחלקים שווים או להשתמש שלם.
  4. מניחים רקמת פצע לתוך ריק, שקל מראש 2 מ"ל חרוז טחנת צינורות הומוגניזציה. ואז לשקול את הצינורות שוב לאחר הוספת המדגם. חשב את משקל המדגם על-ידי:
    משקל לאחר הוספת מדגם - משקל לפני הוספת מדגם.
  5. הוסף 1 מ"ל של PBS, בעדינות להפוך צינור 3-5 פעמים כדי לשטוף את המדגם ולהסיר את כל התאים הפלנקטוניים. הסר ובטל את ה- PBS.
  6. הוסף 1 מ"ל של טיפול GH (או PBS כבקרה שלילית) לדגימה ודגירה במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 80 סל"ד.
  7. הסר את הפתרון פיזור biofilm ומניחים לתוך צינור נפרד 1.5 מ"ל. זה מכיל את התאים המפוזרים.
  8. הוסף 1 מ"ל של PBS לדגימת הרקמה הנותרת והפך בעדינות 3-5 פעמים כדי לשטוף את כל התאים המפוזרים שנותרו. הסר ובטל את ה- PBS.
  9. הוסף 1 מ"ל של PBS לרקמה הנותרת הומוגנית ב 5 m/s עבור 60 s באמצעות homogenizer ספסל.
  10. לדלל באופן סדרתי את הפתרון של תאים מפוזרים מדגם רקמה הומוגנית על ידי הצבת 100 μL של מדגם לתוך 900 μL של PBS בצינור 1.5 מ"ל, וחוזר חמש פעמים עבור סך של 6 דילול.
  11. צלחת ספוט 10 μL של כל דילול על אגר סלקטיבי מדיה (למשל, Pseudomonas בידוד אגר עבור P. aeruginosa)ו הדגירה את הצלחות ב 37 °C (60 °F) לילה.
  12. לספור את CFU ולחשב את 'אחוז מפוזר' כמו (CFU ב supernatant / (CFU ב supernatant + CFU ברקמת biofilm)) x 100.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בניסוי זה, עכברי וובסטר שוויצריים בני 8-10 שבועות נדבקוב-10 4 CFU של PAO1 הנושאים את פלסמיד הזוהר pQF50-lux. כפי שתואר לעיל, זיהום הורשה להקים במשך 48 שעות לפני מתן 3 x 30 דקות טיפולים של PBS (בקרת רכב) או 10% GH (טיפול) לעכל את EPS biofilm. עכברים צולמו טרום טיפול, מיד לאחר הטיפול (0 שעות) וב 10 שעות ו 20 שעות לאחר הטיפול. איור 2A ואיור נוסף 1 מראים זיהום מבוסס בתוך מיטת הפצע היוצר אות ביולומיננטי בהיר. פיזור של חיידקים מתוך מיטת הפצע ניתן לדמיין מיד לאחר הטיפול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מתארים פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את היעילות של סוכני פיזור biofilm. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות לשימוש עם סוגים שונים של חומרי פיזור, מינים חיידקיים או דגימות ex vivo, כולל דגימות פסולת קלינית. פרוטוקול זה מספק גם מודל רלוונטי קלינית לאיסוף וחקר תאים חיידקיים מפוזרים. הפנוטיפים של תאים חיידקיים מפוזרים הוכחו להיות נבדלים מאלה של תאים פלנקטוניים או biofilm 5,24,25,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (R21 AI137462-01A1), קרן טד נאש לונג לייף, קרן ג'ספר ל' וג'ק דנטון וילסון ומשרד ההגנה (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לפישר14823434 השתמש להשלמת דילולים סדרתיים של דגימות
25G 58 במחטפישר14823434מתחבר למזרק 1 מ"ל
Ampicillin נתרן מלחפישרBP1760-5הכינו תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל והוסיפו 100 ומיקרו; L עד 10 מ"ל של מרק LB הן ללילה והן לתת-תרבות
AmylaseMP Biomedicals2100447הכינו תמיסה של 5% w/v, מערבולת- ניתן להשתמש בחומרי פיזור אחרים
בופרנורפין SR-LAB 5 מ"ל (1 מ"ג/מ"ל)ZooPharmRX216118להשתמש כטיפול בכאב - עשוי להשתמש באפשרויות אחרות
CellulaseMP Biomedicals2150583הוסף 5% w/v לתמיסת העמילאז של 5% w/v, מערבולת, הפעל ב-37 מעלות; C למשך 30 דקות- ניתן להשתמש בחומרי פיזור אחרים
קרם אפילציהWalmart287746השתמש בכמות קטנה כדי לעסות לתוך זקיקי השיער בגב החיה והקצה 10 דקות להסרת שיער
מלקחיים לבישה, טיפים משונניםפישר12-460-536יכול להשתמש בצורות אחרות של מלקחיים
צלוחיות ארלנמאייר מבולבלות 125 מ"ל101406פישר השתמש לגידול לילה ותת-תרביות של חיידקים
FastPrep-24 הומוגנייזר ספסלMP Biomedicals6VFV9השתמש ב-5 m/s למשך 60 שניות פעמיים כדי להומוגניזציה של רקמות
Fatal PlusVortech Pharmaceuticals0298-9373-68הזרקת 0.2 מ"ל תוך פריטנאלי לכל עכבר
צינורות הומוגניזציה (צינור חרוזים 2 מ"ל 2.4 מ"מ מתכת)פישר15340151משמש להומוגניזציה של דגימות לציפוי
תרופותגב יהלום איזופלורן
תמיסת קטמין הידרוכלוריד/קסילזין הידרוכלוריד C-IIINSigma AldrichK4138השתמש כאנסתיה - ניתן להשתמש באפשרויות אחרות גם כדי להשיג שדה כירורגי של מרק אנסתיה
LB, מילרפישרBP1426-2הוסף 25 גרם לליטר ואוטוקלאב
לידוקאין 2%תרופות גב יהלום2468הזריק 0.05 מ"ל דרך הצד של אזור מיטת הפצע המסומן כך שהוא יופקד במרכז הסימן. יש להקצות 10 דקות לפני החיתוך
מרופנםסיגמא אולדריץ'PHR1772-500 מ"גלהכין 5 מ"ג/מ"ל להוספה לתמיסת GH למריחה מקומית ותמיסה של 15 מ"ג/מ"ל להזרקה תוך-פריטנאלית 4 שעות לפני ו-6 שעות לאחר הטיפול
ספוגי גזה כותנה לא סטרילייםפישר13-761-52השתמש להסרת קרם האפילציה
PAO1 pQF50-lux זן חיידקיRef [13]N/APAO1 pgF50-lux שימש כזן P. aeruginosa המעניין בתוצאות המייצגות של מאמר זה
צלחות פטריפישרPHR1772-500MG
מאגר פוספט מלוח 10xFisherBP3991לדלל פי 10 עד 1x לפני השימוש
רוטב פוליאוריטןMckesson66024007חותכים את הקצה המעוגל וחותכים את הריבוע הנותר ל-4 חלקים שווים
Pseudomonas אגר בידודVWR90004-394הוסף 20 מ"ל/ליטר גליצרול ו-45 גרם/מ"ל למים, חיטוי ושפך 20 מ"ל לצלחות פטרי
רענן אחר הצהריים.Walmartהשתמש בעיניים כדי להפחית יובש במהלך ההליך.
רפידות הכנה לאלכוהול סטריליותפישר22-363-750השתמש לניקוי העור מיד לפני הפציעה כדי לחטא את האזור
מספריים עדינים ישריםפישר89515יכול גם להשתמש במספריים מעוקלים
עכברי וובסטר שוויצרייםצ'ארלס ריבר551NCISWWEBניתן להשתמש בזני עכברים אחרים קצה
החלקה מזרק 1 מ"לפישר14823434משמש למתן תרופות ו טיפול באנזימים
להזרקה

מקורות

  1. Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
  2. Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
  3. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  4. Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
  5. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
  6. Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
  7. Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738(2018).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632(2016).
  9. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379(2020).
  10. Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
  11. Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
  12. Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317(2011).
  13. Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
  14. Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
  15. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  16. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
  17. Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518(2014).
  18. Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129(2015).
  19. Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
  20. Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079(2017).
  21. Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
  22. DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
  23. Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
  24. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462(2014).
  25. Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
  26. Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
  27. Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
  28. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  29. Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
  30. Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
  31. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  32. Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מודל פצע בעכבריםזיהום פצע כרוניחומרי פיזורחומר פולימרי חוץ-תאידימות In Vivoכימות עומס חיידקיאנליזה Ex Vivoזיהום פולימיקרוביאליטיפול אנזימטי
הערכת פיזור ביופילם בפצעי מורין
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.