הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכברוש אוסטאוסרקומה סנגנית אורתוטופית עם קטיעה כדי לשלוט בקצב גרורות

3.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62139

⸱

3 במאי 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Comparative Pathobiology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University, 3Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 5Program for Comparative Medicine, Gene Therapy Program, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 6Tuskegee College of Veterinary Medicine, 7Department of Human Pathology, Juntendo University Faculty of Medicine, 8Department of Surgery, Juntendo University Shizuoka Hospital, Juntendo University School of Medicine, 9Department of Urology, The Johns Hopkins School of Medicine, 10Department of Gastroenterology and Minimally Invasive Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine

במאמר זה

סיכום

כאן, השתלה אורתוטופית סינגנית ואחריה הליך קטיעה של אוסטאוסרקומה עם גרורות ריאות ספונטניות שניתן להשתמש בהן לחקירה פרה-קלינית של ביולוגיה גרורות ופיתוח של טיפולים חדשניים מתואר.

תקציר

ההתקדמות האחרונה בטיפול באוסטאוסרקומה (OS) התרחשה בשנות השמונים כאשר הוכח כי כימותרפיה רב-גורמית משפרת את ההישרדות הכללית בהשוואה לניתוח בלבד. כדי לטפל בבעיה זו, מטרת המחקר היא לחדד מודל פחות ידוע של מערכת ההפעלה בחולדות עם גישה היסטולוגית מקיפה, הדמיה, ביולוגית, השתלה וקטיעה כירורגית המאריכה את ההישרדות. השתמשנו במודל עכברושים אימונו-תחרותי, מלידה ספראג-דולי (SD), מודל חולדה סינגנית עם קו תאים מושתל של מערכת ההפעלה UMR106 (שמקורו בחולדה SD) עם שתלי גידול טיבי אורתוטופיים לחולדות זכר ונקבה בנות 3 שבועות כדי לדגמן מערכת הפעלה לילדים. מצאנו שחולדות מפתחות גידולי ריאות ראשוניים ומדסטטיים ניתנים לשחזור, וכי קטיעות גפיים בגיל 3 שבועות לאחר ההשתלה מפחיתות באופן משמעותי את שכיחות גרורות הריאות ומונעות מקרי מוות בלתי צפויים. מבחינה היסטולוגית, מערכות ההפעלה העיקריות והמטאסטטיות בחולדות היו דומות מאוד למערכת ההפעלה האנושית. סקר ביטוי חלבון של תאי מערכת ההפעלה מגלה כי גידולים אלה מבטאים קינאזים משפחתיים של ErbB. מאז קינאז אלה באים לידי ביטוי גם ב- OSs האנושי ביותר, מודל חולדה זה יכול לשמש כדי לבדוק מעכבי מסלול ErbB לטיפול.

מבוא

אוסטאוסרקומה (OS) הוא הגידול העיקרי הנפוץ ביותר בעצמות אצל ילדים, מתבגרים ומבוגרים צעירים. ההתקדמות האחרונה בטיפול במערכת ההפעלה התרחשה בשנות השמונים כאשר הוכח כי כימותרפיה רב-גורמית משפרת את ההישרדות הכללית בהשוואה לניתוחלבדו 1. מערכת ההפעלה מתפתחת במהלך צמיחת עצם מהירה, המתרחשת בדרך כלל בעצמות צינוריות ארוכות כגון עצם הירך, השוקה, עצם הרחם. הם מאופיינים במראה אוסטיאוליטי, אוסטאובלסטי או מעורב עם תגובה periosteal בולט2. כימותרפיה וחתך כירורגי יכול לשפר את התוצאה עבור חולים עם הישרדות של 5 שנים עבור 65% מהחולים2,3. למרבה הצער, חולי מערכת הפעלה ברמה גבוהה עם מחלה גרורתית יש 20% הישרדות. מערכת ההפעלה פולשת באופן אזורי וגורמת גרורות בעיקר לריאות או לעצמות אחרות והיא נפוצה יותר אצל גברים. הצורך המשכנע ביותר עבור חולים צעירים אלה הוא טיפול חדשני המונע ומבטל את הכדאיות של גרורות רחוקות.

מודלים פרה-קליניים של מערכת ההפעלה נבדקו4,5,6,7 ומעט דגמים חיסוניים זמינים באמצעות כריתה של מערכת ההפעלה האורתוטופית פותחו. בשנת 2000 פותח דגם חשוב באמצעות עכברי BALB/c עם מערכת הפעלה סינגנית אורתוטופית וקטיעה8. בהשוואה למודל העכבר הזה, מודל החולדות מבוסס על בעלי חיים גדולים פי 10 מהמובילים ליתרונות מסוימים. מודל UMR106 החולדה פותח מערכת הפעלה המושרה 32P בחולדה ספראג דולי (SD), אשר נגזר לתוך קו תא9. בשנת 2001, השתלה אורתוטופית של UMR106-01 תוארה לראשונה בשוקה מושתלת של עכברים אתימיים עם התפתחות גידול ראשונית מהירה ועקבית ותכונות רדיולוגיות, היסטולוגיות במשותף עם מערכת ההפעלה בבני אדם. גרורות ריאתיות התפתחו והיו תלויות במיקום האורתופולוגי של UMR106 לתוך מיקרו-סביבה בעצמות10. בשנת 2009, יו ואח' 11 הקים מודל עכברוש עצם הירך האורתוטופית לשחזור באמצעות תאי UMR106 בחולדות SD זכריות גדולות יותר. השתלות הגידול המוצלחות וקצב גרורות הריאות בחולדות ללא קטיעה היו דומים לנתונים שהוצגו כאן. במחקר זה בוצעה קטיעה נוספת למודל באמצעות חולדות צעירות, מה שהציע כי התזמון של הסרת הגידול העיקרי הוא קריטי בדוגמנות מערכת ההפעלה, הקשורה במיוחד להתקדמות גרורתית. עם עידון זה, קטיעה והדמיה in vivo לשפר את המודל הזה עבור מחקרים פרה קליניים להערכת תרופות חדשניות עבור מערכת ההפעלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים והניסויים הקשורים לחולדות בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של ג'ונס הופקינס.

1. פרוטוקול תרבית התאים של מערכת ההפעלה של עכברוש SD UMR-106

  1. לגדל תאים ב- DMEM, בתוספת 10% (v/v) FBS, פניצילין (10 U/mL)-סטרפטומיצין (10 U/mL) ב 37 °C באטמוספירה לחה 5% CO2. בצע ניסויים באמצעות תאים עם מעברים של 2-812.

2. הזרקה תוך-ביאלית של פרוטוקול תאי מערכת ההפעלה

הערה: חולדות SD בהריון בזמן להזדווגות במתקן החיות ובגיל 3 שבועות, המלטה משמשת (מאז UMR 106 קו התא הוא סינגני לחולדות SD, אין צורך הקרנה).

  1. אינדוקציה
    1. מניחים את החולדה בתא אינדוקציה בגודל בינוני ומעוררים הרדמה עם 2%-3% איזופלוראן. נטר את החיה ברציפות לעומק ההרדמה על ידי רפלקס לצבוט בוהן, קצב נשימה ואופי.
    2. הכנס את האף לתוך האף. מאובטח עם קלטת, במידת הצורך.
    3. הסר את השיער ברגל ימין עד הגחון ואת הבטן התחתונה גב עם קוצץ או להשתמש בסוכן depilatory. הנח את החולדה בתנוחה על-ביתית.
    4. לשפשף את האזור הכירורגי באופן אספטי באמצעות 70% אתנול לדלל אצטט כלורהקסידין או לדלל betadine. התחל סביב אזור הברך וקרצוף בתנועה מעגלית הן באופן קרוב והן distally. חזור על שלב זה שלוש פעמים. לא וילונות משמשים להשתלת גידול.
    5. החל חומר סיכה בעיניים הן בעיני החולדה כדי למנוע ייבוש קרנית הנגרמת על ידי הרדמה. מניחים את החולדה על כרית חימום נמוכה. ודא כי החולדה יש טמפרטורת גוף נורמלית (37 °C )C) וקצב נשימה נורמלי.
  2. כירורגיה
    1. הפעל איזופלוריין ב- ~ 1.5%-2% (לתחזוקה). ודא כי החיה נמצאת במישור הולם של הרדמה באמצעות חוסר רפלקס צביטת בוהן. אם לא, להגדיל את אחוז איזופלוראן ל 2.5%.
    2. סמן מחט סטרילית (כ 22 G) ב 10 מ"מ מהקצה להנחיית עומק להחדרה.
    3. הכנס את המחט 10 מ"מ למטה לתוך diaphysis של השוקה על ידי כניסה לברך כפופה באמצע הרמה tibial, הרחבת המחט דרך metaphysis לתוך diaphysis באמצעות תנועה קלה כמו מקדחה כדי להפוך את פתח. הסר את המחט.
    4. טען את השעיית התא למזרק המילטון ישירות לפני ההזרקה לתוך השוקה. כדי לעשות זאת, מערבבים בעדינות את התאים לפני ציור לתוך מזרק כמו כוח המשיכה גורם לתאים להתיישב בתחתית הצינור.
      הערה: תאים יכולים להיות מאוחסנים בצינור 1.5 עד 2 מ"ל (בטמפרטורת החדר) לפני ציור לתוך מזרק המילטון (100 μL) לאחר ערבוב זהיר. תאים ניתן לשמור בטמפרטורת החדר במשך 2-3 שעות במהלך הליך ההשתלה. בדוק תמיד את הכדאיות התאית של תאים בצינור לפני ולאחר מכן לאחר הפעלת ההשתלה. אי-הכללה כחולה של טריפן היא השיטה הקלה ביותר להערכת כדאיות התא.
    5. לאחר העצם הוא חצה עם המחט הראשונה, להכניס מחט שנייה (מחט בקוטר קטן יותר מסומן גם ב 10 מ"מ) מחט מחובר מזרק 100 μL המילטון טעון עם תאים. הקפד להכניס את המחט עד לסימן 10 מ"מ לתוך אותו חור המשתרע לתוך הדיאפיזה.
    6. פריקה עדינה 20 μL של 75,000 תאי מערכת ההפעלה השעיה PBS לתוך הדיאפיזה וחלל מח העצם.
      הערה: המחט לא צריכה להתנדנד בעצם וצריכה להרגיש בטוחה. אם המחט זזה בקלות, ייתכן שקליפת המוח נחצתה בזיהוי. חזור על ההכנסה שוב כדי לקבל מיקום מוצק יותר לפני הזרקת התאים.
    7. הסר את מחט המילטון מהעצם.
      הערה: אם טיפה קטנה של דם צורות, להחיל לחץ קל. אם צורות נפילת נוזלים ברורות באתר הניקור, ייתכן שהמחט לא הורחבה מספיק רחוק בעצם וייתכן שהמתלים של תא הגידול דלפו חזרה דרך החור. להקליט את זה בהפתקים אבל בדרך כלל, השתלת הגידול תהיה מוצלחת. עם ניסיון, הליך השתלת הגידול צריך לקחת 5 דקות לכל חולדה. עם ניסיון, השתלת הגידול של תאים בעצם תהפוך לקלה יותר. הזרקה מקרית של תאים בשריר סביב העצם, לא יכול להוביל microenvironment הגידול הדרוש גרורות ריאתי.
  3. שחזור
    1. ודא כי החולדה היא נורמותמית. מניחים את החולדה בכלוב עם כרית חימום שהונחה מתחת לכלוב להתאוששות.
    2. לאחר ערות מלאה, נייד, ונשימה היטב, להזריק את החולדות עם Buprenorphine (1.0-1.2 מ"ג / קילוגרם SC).
      הערה: כדי לקבל גישה ל Buprenorphine, לבדוק עם המוסד כדי לראות אפשרויות לאישור באמצעות הצוות הווטרינרי כדי לבצע את ההזמנה.
    3. העבר את החולדות בחזרה לכלובים נקיים ולפקח פעם ביום, בכל שבוע.

3. מדידה וניטור

  1. למדוד את גודל הגידול 9-10 ימים לאחר ההשתלה ולאחר מכן כל 2 ימים עד 3 שבועות לאחר ההשתלה כדי לקבוע קצב גדילה. מדוד את הקוטר המרבי של השוקה באמצעות קליפר אלקטרוני או ידני. אחסן את הנתונים בגיליון אלקטרוני עם נוסחה לחישוב נפח הגידול. מדוד את השוקה contralateral (לא מושתל) כמו בסיס.
    הערה: הקטרים המושתלים האחוריים משמשים כפונדקאית לגודל הגידול. הגפיים האחוריות נמדדות בניצב לציר הארוך של השוקה בקוטר הגדול ביותר לשתי מדידות, גחון/אחורי ומדיה/ לרוחב על הגפה. נפח הגידול המשוער מחושב על ידי הנוסחה11: נפח הגידול (מ"מ3) = הקוטר הגדול ביותר (מ"מ) x הקוטר הקטן ביותר (מ"מ)2/2.
  2. שקול את החולדות לכריתת הישרדות או טיפול כימותרפי כאשר גידולים מתקרבים 15 מ"מ בממד הגדול ביותר או 3 שבועות לאחר השתלת הגידול. הגפה הנגדית מודדת כ 7-9 מ"מ ברוב החולדות בגיל זה.

4. ניהול תוך ורידי של דוקסורוביצין

  1. תירדים את החולדות עם 2% איזופלוריין. הכן את העור על וריד הצוואר עם שלוש שטיפות כירורגיות באמצעות betadine ואלכוהול כמתואר13.
  2. תחת ניתוח זהיר, לדמיין את הווריד הצווארי ימין או שמאל. הכנס את המחט לתוך השריר overlying ולאחר מכן ישיר לכיוון ראשו של החולדה לתוך לומן וריד הצוואר כפי שהוא מדמיין את הצוואר הצווארי עורקים לשריר החזה.
    1. כאשר המחט מוכנס לתוך וריד הצוואר, בעדינות לצייר דם לתוך המזרק כדי להבטיח החדרה נכונה. אפשר להאמין כי המחט היא דרך הווריד, אבל המחט היא מתחת לווריד ולא לומן. אם וריד הצוואר הופך קטן מדי עבור זריקות כאשר בוטה לנתח לחשוף את וריד הצוואר, להשתמש בווריד הצוואר האחר עבור הזריקה.
  3. הזריקו דוקסורוביצין (2 מ"ג/ק"ג) לאט מעל 1 דקות בנפח של 100-150 μL. הפתרון ניתן לדמיין תוך ורידי בווריד הצוואר במהלך המסירה.
  4. הזרקת כמויות דומות של תמיסת מלח רגילה בחולדות שליטה.
  5. הסר את המחט ולהפעיל לחץ עדין על הווריד עם גזה סטרילית.
  6. סגור את חתך העור באמצעות 3-4 מהדקי פצעים. הסר את הקליפים ב 7-10 ימים לאחר הזרקה.
    הערה: חולדות בדרך כלל לא מנסות להסיר קליפים ממתכת אלא לנשוך ולהסיר תפרים. שיטת הזרקת הצוואר עדיפה על זריקות וריד זנב עבור doxorubicin מאז כל תרופה שדולפת מחוץ לכלי גורם נמק של הזנב שעשוי לדרוש כריתת זנב.

5. פרוטוקול כריתת גפיים הינדיות

  1. אינדוקציה
    1. מניחים את החולדה בתא אינדוקציה בגודל בינוני ומעוררים הרדמה עם 2%-4% איזופלוראן. לפקח על החולדה ברציפות לעומק ההרדמה.
      הערה: תא האינדוקציה מנוקד למיכל פחם וכל גז אחר מוסר על ידי שולחן טיוטה למטה המשמש לניתוח.
    2. הכנס את האף לתוך חטטן האף. מאובטח עם קלטת, במידת הצורך.
      הערה: הליך זה נעשה על שולחן טיוטה למטה כדי לנקות גזים נדיפים עודפים (כלומר, isoflurane).
    3. הסר את השיער ברגל ימין עד הגחון ואת הבטן התחתונה גב עם קוצץ או להשתמש בסוכן depilatory. הנח את החולדה בתנוחה על-ביתית.
    4. לשפשף את האזור הכירורגי באופן אספטי באמצעות 70% אתנול לדלל אצטט כלורהקסידין או לדלל betadine. הכן את העור לניתוח מאמצע העגל לאזור העור ממש מעל מפרק הירך של הבטן התחתונה הימנית. לשפשף את הרגל פרוקסימלית ואת האזור דיסטלי בהיקף. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
    5. החל את חומר הסיכה בעיניים בשתי העיניים של החולדה. ודא כי החולדה יש טמפרטורת גוף נורמלית (37 °C (37 °F) וסימנים חיוניים נורמליים. ניטור ופיקוח על טמפרטורת הגוף באמצעות כרית חימום המחוברת לצג בדיקה של טמפרטורה רקטלית.
  2. כירורגיה
    1. הפעל איזופלוראן ב- 1.5%-3% (תחזוקה). יש לנטר עומק הרדמה, כולל תגובה לצביטת בוהן, קצב נשימה ואופי. התאם את קצב האיזופלוריין לפי הצורך כדי לשמור על מישור הרדמה מתאים.
      הערה: קצב הנשימה בזמן הרדמה צריך להיות בין 50-100 נשימות לדקה. נשימות עמוקות, לעתים רחוקות הן אינדיקציה לכך שהעכברוש הוא מרדים עמוק מדי.
    2. פתחו חבילות ווילונות ווילונות סטריליים ואלבשו כפפות סטריליות. יש להצטמר על סטריליות למשך ההליך. מכשירים כירורגיים סטריליים בסיסיים הדרושים כוללים, מחזיק להב אזמל, מלקחיים, hemostats, מחזיק מחט, מספריים, ופצע קליפ applier.
    3. משוך את רגל החולדה דרך פתח האוורור של וילון כירורגי סטרילי. ודא כי החיה נמצאת במישור הולם של הרדמה באמצעות רפלקס צביטת בוהן.
    4. באמצעות להב אזמל או מספריים כירורגיות, לעשות חתך היקף, עורי רק פרוקסימלי לחנק (מפרק הברך).
    5. Deglove הגפה האחורית באמצעות גזה או ניתוח קהה כדי לחשוף את עורק הירך ואת הווריד על פני השטח הגחון-מנדל של הגפה האחורית.
    6. ליג את כלי הדם באמצעות 4-0 תפרים נספגים ברמה של עצם הירך האמצעית ו transect distally.
    7. מהדקים את הווריד בצורה לא דק כדי להפחית דליפה במהלך ניתוח שרירים.
      הערה: שרירים היקפיים יחולקו דיסטל לרמה של קשירת כלי הדם בעורק הירך ושרירים גבוהים מ עצם הירך לרמה של מפרק coxofemoral.
    8. באמצעות ניתוח בוטה, לחטוף את מפרק הירך עם סיבוב חיצוני לרוחב.
    9. מצא את ראש עצם הירך ופרק אותו מן האצטבולום. חותכים כל רקמה שנותרה שמירה על הרגל מחוברת לגוף.
    10. תן בלוק התזה לאצטבולום ולעצב הסיאטי עם כ 6 מ"ג / קילוגרם Ropivacaine.
    11. סגור את השרירים מעל acetabulum באמצעות תפירה מופרעת פשוטה (4-0, תפירה נספגת).
      הערה: 0.5% bupivacaine או לידוקאין נוספים (0.15-0.2 מ"ג סה"כ) עשוי להיות מוזרק במספר אתרים לאורך שכבת השריר הסגורה (חדירה מקומית / בלוק התזה).
    12. להתנגד ולסגור את קצוות העור באמצעות קליפסים פצע להציב לגזרים כל 5-10 מ"מ.
  3. שחזור
    1. מניחים את החולדה בכלוב התאוששות נקי עם תמיכה בחום באמצעות כרית חימום שהונחה מתחת לכלוב.
      הערה: כדי למנוע היפרתרמיה, כרית החימום לא צריך להיות במגע ישיר עם החיה ולא יעלה על 40 מעלות צלזיוס.
    2. לעקוב אחר החיה עד שהוא מחלים לחלוטין והוא נורמותמי (37.5-39 °C (37.5 -39 °F).
      הערה: אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד להכרה מלאה ולהחלמה חדה ונעה בקלות סביב הכלוב.
    3. לאחר ערות מלאה, נייד, ונשימה היטב, להזריק את החולדות עם Buprenorphine (1.0-1.2 מ"ג / קילוגרם SC).
      הערה: מתן בופרנורפין בחולדה מרדים עלול לפגוע בהתאוששות.
    4. יש לנהל 10 מ"ל של תמיסת רינגר הלקטית חמה בין השכמות.
    5. תזיז את החולדות בחזרה לכלוב הנקי ויתאחד עם הבוחרים.
    6. עקוב אחר כל בעלי החיים פעמיים ביום בחודש הבא לסימני כאב ומצוקה, כולל פילוירקציה, תנוחה כפופה, או חוסר יכולת או סימנים של זיהום באתר חתכום, כולל אריתמה, פריקה מוגלתית, או dehiscence פצע.
      הערה: עד כה לא ראינו סימנים קליניים (כגון זיהומים) בעקבות התאוששות לאחר הניתוח בכל אחד מבעלי החיים. רק לעכבר אחד הייתה ירידה בתפרים, ולאחר מכן נעשה שימוש בפצעים כדי לסגור פצעים ללא בעיות נוספות.
    7. ניהול buprenorphine או meloxicam לבעלי חיים המציגים סימנים קליניים של כאב במינונים שפורסמו בהתייעצות עם וטרינר בעלי חיים במעבדה.
    8. מתן אנטיביוטיקה (כלומר, צפלוספורין) לבעלי חיים המציגים סימנים קליניים של כאב במינונים שפורסמו בהתייעצות עם וטרינר של חיות מעבדה.
      הערה: כל בעלי חיים המציגים סימנים ממושכים של כאב או מצוקה שאינם משתפרים עם משככי כאבים או בעלי חיים המציגים סימני זיהום שאינם מגיבים לאנטיביוטיקה צריך להיות מורדם בצורה הומאנית.

6. הדמיה עם צילום רנטגן

  1. לאחר השתלת הגידול, צלם את השוקה והריאות באופן לא פולשני כדי לזהות גידול באמצעות רנטגן עם מכונה המיועדת למכרסמים.
  2. תירדים את החולדות כפי שנעשה בעבר.
  3. צמו תמונות בהגדלה פי 3 עבור 6 s ב- 25 kV.
  4. לעבד את הסרט באמצעות מעבד רנטגן. רדיוגרפים ניתן לסרוק באופן דיגיטלי גם כן.

7. הליך נקרופסיה

  1. המתת חסד החולדות עם CO2. לאשר מוות באמצעות חוסר פעימות לב ומיד לצייר 3 מ"ל דם מהלב עבור דגימות סרום או פלזמה.
  2. פתח את בית החזה והבטן לבדיקה.
  3. לבודד את קנה הנשימה ו cannulate עם (18 גרם) קטטר. כדי לאבטח את הצנתר בקוה הנשימה, קשרו תבר משי סביב קנה הנשימה עם הצנתר.
  4. חבר את צנתר עירוי למזרק 3 או 5 מ"ל. להחדיר פורמלין או מלוחים בעדינות לנפח את אונות הריאות עבור דגימות היסתולוגיה טובה יותר. על עירוי, הריאות יתנפחו ויאפשרו הדמיה טובה יותר של גרורות ריאות.
  5. לבחון, לנתח ולשקול את כל איברי החזה והבטן שנבחרו (כגון כבד, כליות).
  6. לתקן את האיברים בפורמלין עבור היסטופתולוגיה או להקפיא על קרח יבש, 2-מתילבוטן, או חנקן נוזלי.
  7. להערכת ביטוי חלבון באמצעות כתם מערבי, לעשות lysates של רקמות קפואות. נוגדנים המגיבים עם רקמות חולדה מפורטים13.

8. אימונוהיסטוכימיה

  1. לעבד את רקמת מערכת ההפעלה העיקרית, להטמיע בפרפין, ולחלק אותו עבור כתמים אימונוהיסטוכימיים.
  2. אחזר את האנטיגן לאחר דפראפיזציה באמצעות מאגר סיטראט (pH 6.0). דגירה ב 0.3% H2O2 במתנול במשך 30 דקות כדי להרוות פרוקסידאז אנדוגני.
  3. לחסום את 5 מיקרומטר עבה מקטעי פרפין באמצעות סרום רגיל.
  4. דגירה עם נוגדנים ראשוניים נגד CD68 ו- CD3 (ראה טבלה) למשך הלילה ב 4 °C (70 °F).
  5. יש לשטוף את המקטעים ב-PBS ולדגור אותם בפולימר HRP באמצעות ערכת זיהוי.
    הערה: אימונוסטינינג פותח עם דיאמינובנזידין ככרומוגן.

9. סופג מערבי

  1. Lyse תאי UMR-106 ב 200-300 μL של חיץ תמוגה14 כדי לבצע אלקטרופורזה ג'ל סטנדרטית וכתם מערבי.
  2. השתמש 4% עד 12% ג'ל ביס-טריס.
  3. דגירה בנוגדן ראשוני נגד ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-אקטין או נוגדן ראשי נגד עכברים β2-AR (ראו טבלה) ונוגדן משני הקשור לפרוקסידאז חזרת.
  4. מוסיפים את המצע הכימותרפי. לחשוף את הממברנות לסרט רנטגן.
    הערה: רמות β-actin משמשות כפקדי טעינה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חולדות IMUNOcompetent SD מלידה משמשות למחקרי מערכת ההפעלה האלה, המציע מודל בעלי חיים עם מערכת חיסונית שלמה. השתמשנו בקו התא UMR106 מ- ATCC, שפותח מתאים שבודדו בתחילה מ מערכת הפעלה מעכברוש SD. שתלנו את התאים בחולדות SD, ובכך סיפקנו מודל סניקני למערכת ההפעלה. תאי UMR106 מושתלים בשוקה של חולדות SD זכר ונקבה בנות 3 שבועות, המדמה מודל מערכת הפעלה לילדים. יתר על כן, ההשתלה האורתוטופית של תאי UMR106 ישירות לתוך מטפיזיס השוקה / דיאפיזיס נותן microenvironment גידול רלוונטי.

בעת השתלת תאי הגידול, יש להכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חולדות עם שתלים טיביים של מערכת ההפעלה מפתחות גידולים מדידים ב-3 שבועות לאחר ההשתלה. אם גפיים עם גידולים נקטעים 3 שבועות לאחר ההשתלה, השכיחות של גרורות ריאות מופחתת באופן משמעותי. מערכות יס הן אוסטיאולטיות ואוסטאובלסטיות. חולדות ללא קטיעה לפתח גרורות ריאות כי הם מרובים ומגוון בגודל, נצפתה על ידי רדיוגרפיה או נמק על ידי 7 שבועות לאחר ההשתלה. EGFR, ErbB2 ו- ErbB4 באים לידי ביטוי במערכת ההפעלה UMR106 חולדה, בדומה למערכת ההפעלה האנושית16,17,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין חשיפה להצהיר.

תודות

מימון NIH באמצעות המכון הלאומי לסרטן, מענק # CA228582. שון אישיאמה מקבל בימים אלה מענק ממשרד תומרי מדיקל בע"מ

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AKTCell Signaling TECHNOLOGY4685S
תפר נספגEthiconJ214H
β-אקטיןSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-47778
β נוגדן 2-ARSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-569הוחלף על ידי β 2-AR (E-3): sc-271322
Bis– Tris gelsThermo FisherNP0321PK2
Buprenorphine SR LabZooPharmIZ-70000-201908
נוגדן CD3Dako#A0452
נוגדן CD68eBioscience#14-0688-82
מצע כימילומינסנטcytivaRPN2232
סרט CL-Xposure ThermoFisher34089
מערכת הרדמה מלאהEVETEQUIP922120
diaminobenzidineVECTOR LABORATORIESSK-4100
DoxorubicinActavisNDC 45963-733-60
נוגדן EGFRSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-03הוחלף ב-EGFR (A-10): sc-373746
נוגדן ERBB2SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-284הוחלף על ידי Neu (3B5): נוגדן sc-33684
ERBB4SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-283הוחלף ב-ErbB4 (C-7): נוגדן sc-8050
ERKSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-514302
חומר סיכה לעינייםPHARMADERMNDC 0462-0211-38
מזרק המילטון (100 ומיקרו; L)המילטוןדגם 1710 SN SYR
חזרת נוגדן משני מקושר פרוקסידאזcytivaNA934
ערכת זיהוי פולימר HRPVECTOR LABORATORIESMP-7401
ערכת גילוי פולימרים HRPמעבדות וקטורMP-7402
איזופלורןבאטלר שייןNDC 11695-6776-2
איזופלורן וופורייזרEVETEQUIP911103
UMR-106 תאATCCCRL-1661
רנטגןFaxitronUltraFocus
מעבד רנטגןהופ רנטגן Peoducts Incמעבד רנטגן MicroMaxמעבדי תקווה אינם זמינים יותר בארה"ב
קליפים פצועיםBECTON DICKINSON427631

מקורות

  1. Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
  2. Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
  3. Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B. Recent advances in osteosarcoma. Current Opinion in Pharmacology. 16, 15-23 (2014).
  4. Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
  5. Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P. Animal models in osteosarcoma. Frontiers Oncology. 4, 189(2014).
  6. Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
  7. Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271(2012).
  8. Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
  9. Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
  10. Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
  11. Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
  12. Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
  13. Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Cancer Research. 67 (4), 1436-1441 (2007).
  14. Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
  15. Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
  16. Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
  17. Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
  18. Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
  19. Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל חולדה לאוסטאוסרקומההשתלת גידול אורתוטופיתקטיעת גפהגרורות ריאתיותחולדות Sprague Dawleyהזרקה לווריד הג'וגולרידימות רנטגןאימונוהיסטוכימיהביטוי של פרוטאין קינאזחדירת תאי גידול
מודל עכברוש אוסטאוסרקומה סנגנית אורתוטופית עם קטיעה כדי לשלוט בקצב גרורות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.