מאמר שיטה

הדמיית המעיים ב"בהירות"

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62143

⸱

11 ביוני 2021

 , 
1Department of Pathology & Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים את הפרוטוקול לצביעה פסיבית של CLARITY (PACT) של מעי עכבר כדי לאפשר הדמיה של רקמות תת-אפיתליות, כולל נוירונים, תאים גליה ותאים אנטרואנדוקריניים (EEC) ללא חתך רקמות. הפרוטוקול כולל הטמעת הידרוג'ל של רקמה קבועה בפורמלדהיד, והסרת שומנים לאחר מכן באמצעות חומר ניקוי אניוני כדי "לנקות" את הרקמה.

תקציר

CLARITY (רקמה תואמת הדמיה קשיחה היברידית של אקרילאמיד שקופה) התפתחה לאחרונה כטכניקה רבת ערך הכוללת הטמעת אקרילאמיד לרקמת דליפידאט (ללא חתך) ולשימור מבנה הרקמה התלת-ממדית לצביעה חיסונית. הטכניקה רלוונטית מאוד בהדמיית סביבת המעיים הדינמית שבה סוגי תאים שונים מתקשרים במהלך הומאוסטזיס ומצבי מחלה. שיטה זו המותאמת למעי העכבר מתוארת כאן, המסייעת לעקוב אחר סוגי תאים כמו אפיתליה, אנטרואנדוקרינית, נוירונים, גליה וההקרנות העצביות לתוך תאי האפיתל או האנטרואנדוקריניים המתווכים חישה מיקרוביאלית או חישת כימותרפיה תזונתית בהתאמה. רקמת המעי (1-1.5 ס"מ) מקובעת ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה ביום הראשון. ביום השני, PFA מושלך, והרקמה נשטפת שלוש פעמים עם PBS. הרקמה מוטמעת בהידרוג'ל כדי לשמור על שלמותה על ידי דגירה בתמיסת הידרוג'ל 4% (אקרילאמיד) ב-PBS (מדולל מ-30% פרוטו-ג'ל) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. ביום השלישי, תמיסת הרקמה-הידרוג'ל מודגרת ב-37  מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאפשר פילמור הידרוג'ל. לאחר מכן שוטפים את הרקמה שלוש פעמים בעדינות עם PBS כדי להסיר עודפי הידרוג'ל. השלב הבא של הסרת שומנים (ניקוי) כולל דגירה של רקמות בנתרן דודציל סולפט (8% SDS ב-PBS) ב-37 מעלות צלזיוס למשך יומיים (ימים 4 ו-5) על שייקר בטמפרטורת החדר (RT). ביום 6, הרקמה המנוקה נשטפת ביסודיות עם PBS כדי להסיר SDS. רקמה יכולה להיות מוכתמת חיסונית על ידי דגירה בנוגדנים ראשוניים (מדולל בסרום חמור רגיל של 0.5% ב-PBS המכיל 0.3% טריטון X-100), לילה ב-4 מעלות צלזיוס, ודגירה לאחר מכן בנוגדנים משניים מתאימים של Alexa Fluor למשך 1.5 שעות ב-RT, וצביעה גרעינית עם DAPI (1: 10000). הרקמה מועברת על מגלשת זכוכית נקייה ומורכבת באמצעות VectaShield להדמיה קונפוקלית.

מבוא

CLARITY (רקמה תואמת הדמיה קשיחה hYdrogel) התפתחה לאחרונה כטכניקה רבת ערך הכוללת הטמעת אקרילאמיד (הידרוג'ל) והסרת שומנים ברקמות כדי לשמר את מבנה הרקמה התלת-ממדי לצביעה חיסונית (ללא חתך)1,2. הרקמה המוטמעת בהידרוג'ל שקופה אופטית וחדירה למקרומולקולות, כאשר חלבונים וחומצות גרעין נשמרים לאחר הסרת השומנים על ידי חומר ניקוי. CLARITY הוכרה כאחת מעשר פריצות דרך בולטות בשנת 2013 על ידי Science3. למרות שפותחה בתחילה כדי לדמות רקמות מוח עשירות בשומנים שבהן שומנים משפיעים על פיזור האור ואיכות ההדמיה, הטכניקה נמצאת כיום בשימוש נרחב להדמיית רקמות אחרות כמו מעיים, כבד, כליות ולב. הטכניקה מציעה את היכולת לצבוע ולדמות רקמה על ידי ביטול הצורך בחיתוך, מה שאחרת עלול לגרום להערכה מוטה של אינטראקציות תא-תא עקב התפלגות לא סדירה של סוגי תאים. הטכניקה מספקת גם את ההזדמנות לבצע ערימות z קונפוקליות ולשחזר תמונה תלת מימדית של הרקמה, מה שיכול לעזור לקבוע את הצפיפות, המיקרו-ארכיטקטורה והאינטראקציה בין תאים-תאים בין סוגי תאים שונים בצורה מציאותית יותר מאשר מקטע רקמה. יתר על כן, הטכניקה שונתה כדי לאפשר צביעה חיסונית של רקמות צפופות כמו עצם, כמו גם מחקרי הכלאה באתרם. רקמת התלת מימד המוטמעת בהידרוג'ל מציעה פלטפורמה אטרקטיבית להבהרת האינטראקציות בין תאי אפיתל, אנטרואנדוקרינים, גליה ותאי עצב, שצוטטו לאחרונה כחיוניים להבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות כמו מחלת פרקינסון, אלצהיימר, הפרעות בספקטרום האוטיסטי וכו'.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה של אוניברסיטת אמורי לשימוש וטיפול בבעלי חיים. עכברי C57BL/6 (ניתן להשתמש גם בזכר וגם בנקבה) בגיל 8-12 שבועות קיבלו גישה חופשית למזון ולמים לפני המתת חסד.

1. הסרת מעי (יום 1)

  1. המתת חסד של העכבר בשיטת חנק פחמן דו חמצני, בקצב זרימה של 1.6 מ"ל גז פחמן דו חמצני עד להפסקת הנשימה למשך 2 דקות).
  2. הנח את העכבר על לוח ניתוח עם גפיים מוצמדות. עקר את הבטן עם 70% אתנול. בעזרת מלקחיים חותכים את העור במספריים.
  3. הרם את הכבד בעדינות וזהה את הקיבה. ואז החזק את הבטן במלקחיים, חתך את הוושט ממש מעל הקיבה. החזק את הבטן בעזרת מלקחיים, גזור בעדינות את המזנטריות ונתק את המעי מחלל הבטן עד פי הטבעת. חותכים את המעי המנותק בפי הטבעת.
  4. העבירו את המעי המנותק לתמיסת PBS קרה כקרח בצלחת פטרי. כעת חתכו בעדינות את המזנטריה בין הקטעים האילאליים ויישרו את המעי כך שהחל מהקיבה כל המזנטריות ייחתכו, עד למעי הגס.
  5. חותכים 1-1.5 ס"מ מאזור המעי הרצוי לצביעה של CLARITY לצלחת פטרי חדשה המכילה PBS קר כקרח.
  6. בעזרת מזרק של 5 מ"ל המחובר לקצה קהה של מחט 20 גרם, שטפו את תכולת הצואה עם PBS קר כקרח.
    הערה: ניתן להשתמש בכל אזור במעיים לצביעה של CLARITY באותה טכניקה. ניתן לחתוך את מקטע המעי לאורך המזנטריה או להשתמש בו בשלמותו עבור השלבים הבאים.

2. קיבוע רקמת המעי (יום 1)

  1. תקן את הרקמה בתמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS.
  2. העבירו חתיכה של 1-1.5 ס"מ של קטע מעי מעניין לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל מלא ב-4% PFA ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לקיבוע.

3. הטמעת הידרוג'ל (יום 2)

  1. העבירו את מקטע המעי מתמיסת PFA 4% עם מלקחיים לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל עם תמיסת PBS ושטפו שלוש פעמים (5 דקות כל אחת, על שייקר במהירות 150-200 סל"ד) כדי להסיר שאריות PFA.
  2. הכנת הידרוג'ל 4%
    1. השתמש בתמיסת ג'ל 30% (ProtoGel) להכנת ההידרוג'ל. להכנת תמיסת הידרוג'ל 4%, יש לדלל את תמיסת המלאי של 30% מדוללת ב- PBS. להכנת 12 מ"ל של 4% הידרוג'ל, קחו 1.6 מ"ל של תמיסת ג'ל 30% והוסיפו 10.4 מ"ל PBS.
  3. העבר את הרקמה הקבועה משלב 3.1. לתמיסת הידרוג'ל 4% ב-PBS בשפופרת חרוטית של 15 מ"ל ומודגרת ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: מומלץ מאוד לשטוף את הרקמה ללא PFA באמצעות PBS לאחר דגירה של לילה. רקמה המאוחסנת זמן רב יותר ב-PFA אינה נותנת תוצאות טובות עם השלבים והצביעה הבאים. ניתן לאחסן את הטישו הקבוע לאחר שטיפת PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע.

4. שלב פילמור הידרוג'ל והסרת שומנים (ניקוי) (יום 3)

  1. הוצא את הצינור החרוטי המכיל את הרקמה בתמיסת הידרוג'ל מ-4 מעלות צלזיוס. מעבירים לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים למשך שעה. שלב זה מאפשר פילמור הידרוג'ל.
  2. לאחר שעה, הוציאו את הצינור החרוטי המכיל את הרקמה המוטמעת בהידרוג'ל של אמבט המים, ושפכו את תמיסת האקרילאמיד. כעת שטפו בעדינות את הטישו עם שטיפת PBS אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר את עודפי ההידרוג'ל.
  3. שלב הפחתת שומנים
    1. דליפידאט על ידי דגירה של הרקמה בנתרן דודציל סולפט (8% SDS) ב-PBS. העבירו את הרקמה המוטמעת בהידרוג'ל משלב 4.2 לתמיסת SDS של 8% בצינור חרוטי של 50 מ"ל. ודא שהרקמה שקועה לחלוטין בתמיסת SDS, ושהצינור מכוסה.
    2. העבירו את הצינור המכוסה בנפח 50 מ"ל המכיל את הרקמה ב-SDS על שייקר של 37 מעלות צלזיוס (200 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך יומיים (ימים 4 ו-5) כדי לאפשר הסרת שומן.
      הערה: ודא שתמיסת SDS ממולאת עד לפחות 20-25 מ"ל בצינור החרוטי של 50 מ"ל, כדי לפצות על כל אידוי שעלול להתרחש ב-37 מעלות צלזיוס במהלך 2 ימי הדגירה.
  4. בימים 4 ו-5, יש לדגור את הרקמה ב-SDS בשייקר של 37 מעלות צלזיוס (200 סל"ד) בטמפרטורת החדר.

5. שטיפת חומר הניקוי מהטישו הנקי (יום 6)

  1. קח את הרקמה מתמיסת SDS. הרקמה תיראה 'שקופה' או שקופה.
  2. העבירו את הטישו לצינור קומיקס חדש של 50 מ"ל עם תמיסת PBS ושטפו במהלך היום על שייקר (150-200 סל"ד) בטמפרטורת החדר עם מספר שינויים של PBS, כדי להבטיח שכל עקבות ה-SDS יוסרו. לפחות 10 שינויים בתמיסת PBS יבטיחו שהרקמה תהיה נקייה מה-SDS, וכלל אצבע טוב הוא לבדוק אם בשטיפת ה-PBS הסופית אין עקבות של קצף/קצף מה-SDS. זהו שלב קריטי מכיוון ש-SDS יכול להפריע לשלבי הצביעה הבאים.
    הערה: בסופו של יום, הרקמה שנוקה לאחר מספר שטיפות ב-PBS מוכנה כעת לצביעה חיסונית או אולי מאוחסנת ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.
  3. אחסון רקמות מעיים נקיות במשך יותר מחודש בתמיסת PBS ישפיע על שלמות הרקמה ואיכות הצביעה. השתמש ברקמת המעי שנוקה באופן מיידי או תוך 1-2 שבועות מרגע הניקוי לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

6. צביעה אימונו-פלואורסצנטית לנוירונים, גליה ותאי אנטרואנדוקרינית

  1. העבירו את הרקמה שפונה לצינור של 1.5 או 2 מ"ל ודגרו בנפח של 500 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים מדוללים בסרום חמור רגיל של 0.5% ב-PBS המכיל 0.3% טריטון X-100) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. הנוגדנים (Ab) בהם נעשה שימוש: Tuj1 או β-3-tubulin (סמן עצבי פאן, 1: 1000), חלבון חומצה סיבית גליאלית (GFAP, 1: 500), כרומוגרנין A (1: 250).
  2. לאחר הדגירה של הלילה, הכניסו את הרקמה ל-3 שטיפות PBS (5 דקות כל אחת באמצעות 1-1.5 מ"ל PBS) כדי להסיר את ה-Ab הראשוני הלא קשור.
  3. העבירו את הרקמה לצינור חדש, ולאחר מכן דגרו עם 500 מיקרוליטר של Alexa Fluor Ab (AF) משני מתאים למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר בחושך. ה-Ab המשני המשמש הוא AF 488 עבור Tuj1 (1:1000), AF-555 עבור GFAP (1:500) ו-AF 555 (1:250) עבור כרומוגרנין A.
  4. לאחר הדגירה יש לשטוף את הטישו שלוש פעמים עם PBS כמו בשלב 6.2.
  5. לצורך צביעת הגרעינים, דגרו את הרקמה ב-DAPI (1: 10000 דילול או 0.2 מיקרוליטר ב-2 מ"ל PBS) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לבסוף, העבירו את הרקמה המוכתמת על מגלשת זכוכית נקייה, הוסיפו כיסוי על גבי הרקמה והרכיבו באמצעות 100 מיקרוליטר של VectaShield להדמיה קונפוקלית.
  7. הנח את השקופיות בחושך בטמפרטורת החדר במחזיק שקופיות למשך 30 דקות לייבוש, ולאחר מכן ניתן לצלם אותן או לאחסן אותן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. קיר המעיים של העכבר דק למדי וברגע שנפתח לאורך המזנטריה, ניתן להרכיב אותו על שקופיות זכוכית ישירות עם כיסוי. אם עובדים עם רקמות גדולות יותר כמו טחול, כליות, מגלשות תא (חלל) או מרווחים. עבור רקמות גדולות יותר כמו, ניתן להשתמש במגלשת חלל להרכבה.
    הערה: יש לציין שאם קטע המעי לא נחתך בשלב ההתחלתי (עיין בהערה בשלב 1), רצוי לחתוך את צינור המעי עם מספריים מיקרו שיקלו על השלבים הכרוכים בהרכבה.

7. הדמיה קונפוקלית

הערה: ניתן לדמות את הרקמה הנקייה, המוכתמת והמותקנת באופן מיידי או לאחסן אותה בקופסאות שקופיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

  1. תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (למשל, אולימפוס FV1000).
  2. קח ערימות z בעובי של 50 מיקרומטר של רקמת המעי כדי לדמיין את האזורים מלומן המעי לכיוון שכבת הסרוסל.
  3. אחסן את תמונות ערימת z כקבצי תמונה, קבצי סרטים .avi או המרה לתמונה תלת מימדית בעזרת התוכנה5.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התמונות מרקמת המעיים של העכבר שאושרה על ידי CLARITY מיוצגות באיור 1. השלמה מוצלחת של הפרוטוקול מניבה תמונות חדות באיכות גבוהה שבהן ניתן להמחיש את כל הפרטים הסלולריים בבירור. צביעת DAPI לגרעינים היא אינדקס טוב מאוד להערכת איכות פרוטוקול CLARITY והצביעה החיסונית שלאחר מכן מכיוון שהיא יכולה לתאר את שלמות הרקמה. יתר על כן, צורת התא מספקת גם רמז כיצד הפרוטוקול הצליח במיוחד במקרה של תאים עצביים, גליאליים ואנטרואנדוקריניים עם מורפולוגיה תאית מובהקת. תא מעוות עם צביעה דלה/חריגה מראה שהכנת הרקמה נפגע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטת CLARITY שימושית מאוד לצביעה של מעי עכבר כדי להמחיש סוגי תאים שונים כולל אפיתליה, נוירונים ותאי גליה בתלת מימד, במיוחד רשת ההקרנות העצביות המשתרעות על פני דופן המעי עד לומן5 והעצבוב שלהם לתאי גליה ו-EEC. השיטה המוצגת כאן שונתה בהתאם למחקר המקורי של Yang et al. 20141.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים שטיפה מיידית של הקיבוע לאחר קיבוע לילה של רקמת המעי, הטמעת הידרוג'ל לאחר מכן והסרת שומן. שטיפות ה-PBS לאחר הסרת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להכיר בתמיכה של האגודה האמריקאית לגסטרואנטרולוגיה (AGA) פרס מחקר פיילוט להפרעות תנועתיות תפקודיות במערכת העיכול של AGA-Rome (ל-BC), AI64462 המענקים של המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (ASN) וליבת המיקרוסקופיה המשולבת להדמיה תאית של אוניברסיטת אמורי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% פרפורמלדהיד (PFA)  ב-PBSThermoFischer ScientificJ19943משמש לקיבוע רקמות
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד (DAPI)ThermoFischer ScientificD13061/10,000 דילול
Alexa Fluor-488ThermoFischer ScientificA-110341/1000 דילול
Alexa Fluor-555ThermoFischer ScientificA-214281/500 דילול
אנטי-GFAP (חלבון חומצה סיבית גליה)Abcamab72601/500 דילול
אנטי-בטא III טובולין (או Tuj1)Abcamab182071/1000 דילול
כרומוגרנין AAbcamab151601/250 דילול
ProtoGel  30%National DiagnosticsEC-890רעיל, מסוכן, טפל בזהירות- לעשות תמיסה של 4% ב-PBS לשימוש
נתרן דודציל סולפטThermoFischer Scientific283648% ב-PBS
Vectashield הרכבה בינוניתVector LaboratoriesH-1000

מקורות

  1. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  3. 2013 Runners-Up. CLARITY makes it perfectly clear. Science. 342, 1434-1435 (2013).
  4. Fung, T. C. The microbiota-immune axis as a central mediator of gut-brain communication. Neurobiology of Disease. 136, 104714(2020).
  5. Chandrasekharan, B., et al. Interactions Between Commensal Bacteria and Enteric Neurons, via FPR1 Induction of ROS, Increase Gastrointestinal Motility in Mice. Gastroenterology. , (2019).
  6. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164, 792-804 (2016).
  7. Muntifering, M., et al. Clearing for Deep Tissue Imaging. Current Protocols in Cytometry. 86, 38(2018).
  8. Cronan, M. R., et al. CLARITY and PACT-based imaging of adult zebrafish and mouse for whole-animal analysis of infections. Disease Models & Mechanisms. 8, 1643-1650 (2015).
  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355(2019).
  11. Milgroom, A., Ralston, E. Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging. Cell Biology International. 40, 478-483 (2016).
  12. Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J. W., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  13. Chen, Y., et al. Three-dimensional imaging and quantitative analysis in CLARITY processed breast cancer tissues. Scientific Reports. 9, 5624(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CLARITY
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים