מאמר שיטה

בידוד והדמיה בזמן-לשגות של תאי מזנשים הפליאטל העוברי הראשי של העכבר כדי לנתח תכונות תנועה קולקטיבית

DOI:

10.3791/62151

⸱

13 בפברואר 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות של תאים מזנכימליים הפליאטוניים של עכבר ראשוניים להדמיה של צמיחה דו-ממדית (2D) ובגידות לתיקון פצעים. אנו מספקים גם את המתודולוגיה לניתוח נתוני ההדמיה של זמן לשגות כדי לקבוע היווצרות זרם תאים תנועתיות כיוונית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח החיך הוא תהליך דינמי, הכולל צמיחה אנכית של מדפי חיך דו-צדדיים ליד הלשון ואחריו גובה והיתוך מעל הלשון. פגמים בתהליך זה מובילים לחיך שסוע, מום מולד נפוץ. מחקרים אחרונים הראו כי גובה מדף פלטלי כרוך בתהליך שיפוץ שהופך את כיוון המדף מאנכי לאופקי. קשה ללמוד את תפקידם של תאי המדף המנשימליים בשיפוץ דינמי זה. ניתוח כמותי מבוסס הדמיה בזמן שימש לאחרונה כדי להראות כי תאי מזנכימלים הפליאטוניים עכבר ראשוניים (MEPM) יכולים לארגן את עצמם לתנועה קולקטיבית. ניתוחים כמותיים יכולים לזהות הבדלים בתאי MEPM מוטנטיים ממודל עכבר עם פגמים בגובה החיך. מאמר זה מתאר שיטות לבודד ולתרבות תאי MEPM מעוברי E13.5 - במיוחד להדמיה בזמן-לשגות- ולקבוע תכונות תאיות שונות של תנועה קולקטיבית, כולל אמצעים להיווצרות זרם, יישור צורה והתמדה של כיוון. הוא מניח שתאי MEPM יכולים לשמש מודל פרוקסי לחקר תפקידו של mesenchyme מדף פלטלי במהלך התהליך הדינמי של גובה. שיטות כמותיות אלה יאפשרו לחוקרים בתחום הקרניופאציה להעריך ולהשוות תכונות תנועה קולקטיבית בתאי שליטה ומוטנטים, אשר יגבירו את ההבנה של שיפוץ mesenchymal במהלך העלאת מדף פלטאלי. יתר על כן, תאי MEPM מספקים מודל תאים מזנכימלי נדיר לחקירה של תנועת תאים קולקטיבית באופן כללי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפתחות החיך נחקרה בהרחבה כמו פגמים ב palatogenesis להוביל חיך שסוע - פגם מולד נפוץ המתרחש במקרים בודדים או כחלק ממאות תסמונות1,2. התפתחות החיך העוברי היא תהליך דינמי הכולל תנועה והיתוך של רקמה עוברית. תהליך זה ניתן לחלק לארבעה שלבים עיקריים: 1) אינדוקציה של מדפים palatal, 2) צמיחה אנכית של המדפים palatal ליד הלשון, 3) העלאת המדפים palatal מעל הלשון, ו 4) היתוך של המדפים palatal בקו האמצע1,3,4. במהלך העשורים האחרונים, מוטציות עכבר רבות זוהו כי לחיך שסוע גלוי5,6,7,8. אפיון מודלים אלה הצביע על פגמים באינדוקציה מדף palatal, התפשטות, וצעדי היתוך; עם זאת, פגמים בגובה מדף פלטלי היו נדירים. לכן, הבנת הדינמיקה של גובה מדף פלטלי הוא תחום מסקרן של מחקר.

ניתוח זהיר של כמה מוטציות עכבר עם פגמים בגובה מדף פלטלי הוביל למודל הנוכחי מראה כי האזור הקדמי מאוד של המדף palatal נראה להתהפך, בעוד תנועה אנכית לאופקית או "שיפוץ" של המדפים palatal מתרחשת באמצע לאזורים האחוריים של החיך1,3,4, 9,10,11. האפיתל הקצה המדיאלי של המדף palatal סביר יוזם את האיתות הנדרש עבור שיפוץ זה, אשר מונע לאחר מכן על ידי mesenchyme מדף palatal. לאחרונה, חוקרים רבים זיהו עיכוב בגובה מדף פלטלי במודלים של עכברים שהראו הידבקויות אוראליות חולפות המערבות מדפי palatal12,13. השיפוץ mesenchymal כרוך ארגון מחדש של התאים כדי ליצור בליטה בכיוון האופקי, ובו זמנית לסגת מדף palatal בכיוון האנכי9,10,14. בין מספר מנגנונים המוצעים להשפיע על גובה המדף palatal ואת שיפוץ mesenchymal הבסיסי הם התפשטות תאים15,16,17, שיפועים כימיים18, ורכיבי מטריצה חוץ תאית19,20. שאלה חשובה התעוררה: האם עיכוב גובה המדף palatal נצפה Specc1l-עכברים לקויים גם בחלקו בשל פגם בשיפוץ מדף palatal, והאם פגם שיפוץ זה יכול להתבטא פגם מהותי בהתנהגות של תאי MEPM ראשוניים21?

תאי MEPM ראשוניים שימשו בתחום הקרניופאציאל עבור מחקרים רבים הכוללים ביטויגנים 22,23,24,25,26,27,28,29, וכמה מעורביםהתפשטות 30,31 ונדידה25,31,32 אך אף אחד לא עבור ניתוח התנהגות תא קולקטיבית., הדמיה בזמן-לשגות של תאי MEPM בוצעה בתרבית 2D ובתיקונים לפצעים כדי להראות שתאי MEPM הציגו תנועה כיוונית ויצרו זרמי תאים תלויי צפיפות- תכונות של תנועהקולקטיבית 21. יתר על כן, תאים מוטנטיים Specc1l יצרו זרמי תאים צרים יותר והראו מסלולי העברת תאים משתנים מאוד. חוסר תנועתיות מתואם זה נחשב לתרום לעיכוב גובה החיך בעוברים מוטנטי Specc1l 13,21. לפיכך, בדיקות פשוטות יחסית אלה באמצעות תאי MEPM ראשוניים עשוי לשמש פרוקסי לחקר שיפוץ mesenchymal במהלך העלאת מדף palatal. מאמר זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי MEPM ראשוניים, כמו גם את הדמיה וניתוח זמן לשגות, עבור 2D ופצע תיקון הבדיקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בהם מעורבים בעלי חיים בוצעו בפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של KUMC, בהתאם להנחיות ולתקנות שלהם (פרוטוקול מספר: 2018-2447).

1. קציר E13.5 עוברים

  1. המת חסד עכברים בהריון באמצעות תא שאיפת CO 2 או על ידיהליך שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש. המשיכו מיד לתתח.
  2. לחשוף את החצי הנחות של חלל הבטן על ידי הסרת העור ואת הצפק. Excise שתי קרני הרחם, אשר מכילים את העוברים E13.5.
  3. מניחים בקצרה את הרחם בתחבולה סטרילית של 37 מעלות צלזיוס (PBS) כדי לשטוף עודפי דם, שיער או פסולת אחרת. מניחים את הרחם בצלחת סטרילית של 10 ס"מ מלאה ב-PBS סטרילי.
  4. באמצעות מספריים קטנים, לחתוך דרך דופן הרחם לאורך הרחם כדי לחשוף כל עובר, עדיין ב שק החלמון שלה. הסר את שק החלמון המקיף את העובר, אבל לשמור אותו עבור genotyping, במידת הצורך. כאשר העוברים מוסרים, מניחים כל עובר בבאר משלו של צלחת 12 באר מלאה PBS.

2. ניתוח מדפי הפליאה מעוברים (איור 1)

הערה: לחטא את מכשירי ניתוח נירוסטה (ראה את טבלת החומרים) לאחר עיבוד כל עובר על ידי הצבת המכשירים תחילה בכוס של 100% אלכוהול אתיל (EtOH), ולאחר מכן בחיטוי מכשירים ב 350 °C (10 שניות), ולאחר מכן קירור אותם בכוס שנייה של 100% EtOH.

  1. בעזרת כף מחוררת מעוקרת, מניחים את העובר בצלחת חדשה בגודל 10 ס"מ מלאה במדיום תרבות MEPM המורכב מהמדיום החיוני המינימלי של דולבק (DMEM) המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS), L-גלוטמין (4 מ"מ L-Glu) והאנטיביוטיקה-פניצילין והסטרפטומיצין (50 יחידות/מ"ל).
  2. ערפו את ראש העובר ממש מתחת לקו הלסת בעזרת מספריים סטריליים(איור 1A,קו מנוקד אדום). הסר את הלסת התחתונה על ידי החדרת נקודה אחת של מלקחיים #5 דק מעוקר לתוך הפה, שמירה אותו רק בתוך הלחי. לדחוף את הנקודה של המלקחיים מוכנס דרך עד שהוא יוצא מהחלק האחורי של הגולגולת.
  3. כוון את המלקחיים לאורך הקו הצהוב באיור 1B, כך שהצד השני של המלקחיים (שעדיין נמצא מחוץ לעובר) מרחף ממש מעל תעלת האוזן, ואז צובט את המלקחיים שנסגרו כדי לחתוך את הרקמה. במידת הצורך, להפעיל עוד מלקחיים עדינים לאורך התפר של מלקחיים סגורים עכשיו לחתוך דרך כל רקמה שלא נקטעה לחלוטין על ידי צביטה.
  4. חזור על השלב הקודם עבור הצד השני של ראש העובר. המשך הליך חיתוך לצבוט כדי להסיר באופן מלא את הלסת התחתונה, הלשון, ואת החלק הנחות של הגולגולת ולחשוף את המדפים palatal.
  5. הסר את הגולגולת על ידי חיתוך ממש מעל העיניים, כפי שמוצג באיור 1C (קו ירוק). עשה זאת על ידי הנחת הראש על צדו השמאלי או הימני ומיקום הנקודות של מספרי נירוסטה קטנים מול ומאחורי הגולגולת ממש מעל גובה העיניים של העובר. חותכים את החלק העליון של הגולגולת עם חיתוך מהיר אחד של המספריים, יצירת משטח שטוח שיהיה חשוב ליציבות בשלבים מאוחרים יותר וזה צריך להיראות כמו איור 1D כאשר מסתכלים מהצד.
  6. מניחים את החלק הנותר של הראש הפוך, עם ההיבט העליון של הראש (גולגולת הוסרה) נח שטוח על החלק התחתון של המנה, אשר יספק משטח יציב להסרת מדף palatal. קחו רגע כדי לזהות את המדפים היפים, שנחשפים כעת ופונים כלפי מעלה ויופיעו כשני רכסים מוגבהים משני צדי החריץ המרכזי בחצי הקדמי של הראש(איור 1E).
  7. מצמידים את החלק הנותר של הראש לצלחת כדי לשתק אותו בזמן שהמדפים מוסרים. לעשות זאת על ידי החדרת נקודה אחת של מלקחיים עדינים דרך הרקמה ליד אזור האף של הראש, הקדמי למדפי palatal, ולהכניס את הנקודה השנייה של המלקחיים דרך בסיס הגולגולת, אחורי אל המדפים palatal. החזק אותם במקום בעת ביצוע כריתת המדפים palatal.
    1. לשתק את הראש ביד אחת, לבחור כל אחד משני המדפים כדי להסיר ראשון, ולהכניס את שתי הנקודות של זוג שני של מלקחיים עדינים לתוך הרקמה בבסיס המשטח לרוחב של המדף, ולצבוט לחתוך את הרקמה (איור 1F). חזור על זה לאורך בסיס המשטח המהודל של המדף ולאחר מכן הן בקצה הקדמי והן בקצוות האחוריים של המדף כדי להתנתק מהראש.
  8. הרימו בעדינות את המדף, ויצרו צביטות נוספות, לפי הצורך, כדי לשחרר לחלוטין את המדף מהרקמה שמסביב.
  9. חזור על שני השלבים הקודמים כדי להסיר את המדף החיך השני.
  10. עם המדפים palatal עכשיו משוחרר מן הרקמה שמסביב להציב PBS (איור G),להשתמש ב- העברת נורות פלסטיק סטרילית כדי לצייר את המדפים בפיפטה, ולהעביר אותם לתוך צינור microcentrifuge 1.5mL יחד עם כ 500 μL של PBS. שמור את הצינורות המכילים מדפי palatal על קרח כמו שאר המלטה מעובדת באותה צורה.
    הערה: לחלופין, ניתן למקם מדפים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל טריפסין מחמם מראש (0.25%) מיד לאחר הניתוח (במקום להניח אותם על קרח). הדגימות יהיו טריות יותר, אך יש לנקוט בזהירות כדי לתזמן את כל שלבי ההליך עבור כל מדגם בודד לעומת טיפול בדגימות באופן קולקטיבי.

3. תרבות של תאי MEPM

הערה: בתנאים המתוארים כאן, תאי האפיתל של החיך אינם שורדים את המעבר הראשון, וכתוצאה מכך תרבית תאים מזנכימלית חיך טהור. השתמש בטכניקה סטרילית כדי לבצע את כל השלבים במכסה המנוע של תרבית הרקמות.

  1. לשאוף ולהשליך את PBS מן הצינור 1.5 מ"ל, דואג לא להשליך את המדפים בתהליך. מיד להוסיף 200 μL של טריפסין מחמם מראש (37 °C) (0.25%) לכל צינור המכיל מדפי palatal. בקצרה צנרת המדפים למעלה ולמטה טריפסין באמצעות קצה פיפטה 1000 μL כדי להאיץ את טריפסיניזציה.
  2. לדגור על הצינורות במשך 5 דקות ב 37 °C (5 °F), ולאחר מכן pipet כל דגימה למעלה ולמטה שוב כדי לעזור לשבור את הרקמה. לדגור את הצינורות עוד 5 דקות ב 37 °C (7 °F), וצינור למעלה ולמטה פעם נוספת כדי להשלים את הניתוק של הרקמה.
    הערה: המדפים חייבים להיות מנותקים לחלוטין או כמעט לחלוטין ומושעים ב טריפסין ללא גושי רקמה נראים לעין שנותרו.
  3. הוסף 800 μL של מדיום תרבות MEPM (שלב 2.1) לכל צינור 1.5 מ"ל. צנטריפוגה צינור 1.5 מ"ל ב 200 × גרם במשך 5 דקות כדי גלולה את התאים. הסר את supernatant, ו resuspend גלולה התא 1 מ"ל של מדיום תרבות MEPM.
  4. צלחת תאי MEPM לתוך צלחת 6 טוב תרבית רקמות מטופלת המכילה מדיום תרבית MEPM. אפשר לתאים לדבוק במשטח הפלסטיק במשך 12 שעות ב 37 °C בחממה עם 5% CO2.
    הערה: לאחר דגירה בן לילה, הרוב המכריע (~ 90%) של תאים יתחברו. בשלב זה, התאים הדבוקים ייראו הומוגניים למדי, עם צורה משולשת או מוארכת מעט.
  5. לשנות את המדיום כל יום על ידי שאיפה עדינה המדיום הישן ומיד להחליף אותו עם 1 מ"ל של PBS סטרילי חם ללא סידן או מגנזיום במשך ~ 1 דקות. שאפו את ה-PBS והחליפו ב-3 מ"ל של מדיום תרבות MEPM מחמם מראש.
  6. מעבר התאים ברגע שהם הופכים 100% מפגש.
    הערה: תאי MEPM צריכים להתרבות על ידי הכפלת מספר כמעט מדי יום.
    1. כדי לעבור את התאים, לשאוף בעדינות את המדיום הישן, ומיד להחליף אותו עם PBS חם ללא סידן או מגנזיום במשך ~ 1 דקות. שאפו את ה-PBS והחליפו אותו ב-0.5 מ"ל של טריפסין 0.25% מתוכנן מראש.
    2. דגירה ב 37 °C (5 דקות), או עד התאים להתנתק מפני השטח של המנה כאשר בעדינות נדנדה קדימה ואחורה ביד. לאחר שהתאים התנתקו, הוסף מיד 5 מ"ל של מדיום תרבית MEPM מחמם מראש לתאים המנוסים.
    3. באמצעות צינור סרולוגי 10 מ"ל, לאסוף בעדינות את התאים בצינור חרוט 15 מ"ל, ואת צנטריפוגות הצינור ב 200 × גרם במשך 5 דקות כדי גלולה התאים. שאפו את טריפסין ובינוני, ו resuspend התאים ב 3 מ"ל של מדיום תרבית MEPM מחמם מראש. מזל בעדינות 1 מ"ל של תאים לתוך באר אחת של צלחת 6-well, ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום תרבות MEPM להביא את הנפח הכולל ל 3 מ"ל.
      הערה: זה מהווה פיצול 1:3 של תאים. MEPMs עשוי להיות מעבר עד שלוש פעמים. צפיפות הזריעה של MEPMs היא גמישה במקצת, ומספר התאים הנוכחים משתנה בהתאם לכלי הפולחן. עם זאת, MEPMs אינם מתרבים כראוי כאשר הם מפוצלים בדלילות רבה מדי וצריכים להיות לפחות 20-25% במנה החדשה שלהם ברגע שהם דבקים.

4. שימור קריאופרציה של תאי MEPM

  1. לאחר תאי MEPM טריפסינים הם גלולה, resuspend התאים במדיום תרבית MEPM כדי להשיג ריכוז של ~ 1 × 106 תאים / מ"ל. להזרים את התאים לתוך cryovials, ולהוסיף ריכוז סופי של 5% דימתילסולפוקסיד במלאי התא. מכסים את הקריוביאל, מערבבים בקצרה על ידי היפוך, ומיד מניחים את הבקבוקונים במיכל קפוא שמתקרר בקצב של 1 °C /min.
  2. מניחים את הצידנית במקפיא של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, להעביר את cryovials למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
  3. הפשרת תאי MEPM שמורים
    1. מוציאים את הקריוביאלים ממיכל החנקן הנוזלי, ומפשירים בטמפרטורת החדר עד שהתכולה מתחילה להפוך לנוזל. רוקן את התוכן לתוך צינור חרוט 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיום תרבות MEPM מחמם מראש.
    2. צנטריפוגות הצינור ב 200 × g כדי כדורי התאים. resuspend התאים 1 מ"ל של מדיום תרבית MEPM, וצינור את התאים לתוך באר אחת של צלחת 6-באר. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות MEPM חם כדי להביא את הנפח הכולל ל 3 מ"ל.
    3. תרבית התאים ב 37 °C (5 °F) באינקובטור עם 5% CO2. לשנות את המדיום מדי יום.

5. הדמיה חיה של תאי MEPM - נדידת הגירה קולקטיבית 2D (איור 2)

  1. הכן צלחת לשימוש להדמיה חיה.
    1. השתמש במספריים כירורגיים קטנים או אזמל חד כדי לקצר תוספת סטרילית של סיליקון 2-well לגובה של ~ 1 מ"מ. הכן הוספה עבור כל דגימה הנמצאת בשימוש.
    2. בעזרת מלקחיים, מניחים את תוספת הסיליקון המקוצרות של 2-well במרכז באר של צלחת 6-well. לחץ למטה לאורך כל הקצוות כדי להבטיח שהוא דבק לחלוטין.
  2. הפשר תאים מוקפאים על-ידי ביצוע השלבים בסעיף 4.3 של פרוטוקול זה. ספירת תאי MEPM וזרע 300 תאים/מ"מ2 של מוסיף הסיליקון המקוצר בנפח כולל של 40-50 μL MEPM תרבית בינונית לבאר. תרבית התאים לילה ב 37 °C (5 °F) באינקובטור עם 5% CO2.
  3. למחרת, היכונו להדמיה חיה של מעידה בזמן.
    1. השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם אינקובטור על הבמה ויכולת הדמיה אוטומטית. מוסיפים מים למאגר החממה על הבמה כדי להפחית את האידוי של המדיום התרבותי; הגדר את הטמפרטורה ל 37 °C (5 °F) ו CO2 עד 5%. אפשר לכ-30 דקות עד שהלחות תצטבר לפני שתניח את המנה בת 6 הבאר באינקובטור על הבמה.
  4. השתמש בהגדרות שוות ערך להגדרות הבאות עבור הדמיה של זמן-לשגות.
    1. בחר את המטרה 4x כדי שיהיו לה שדות תצוגה גדולים ומסנן ניגודיות פאזה.
      הערה: בדרך כלל אין צורך בדוגמת מיקוד אוטומטי, דגימת חיפוש אוטומטי, z-stack ותאורה אוטומטית.
    2. בחר שני שדות מיקרוסקופיים לבאר כדי ללכוד את הלומן של תוספות הסיליקון המקוצרות. ודא שלכל עמדות ההדמיה יש את המוקד הנכון.
      הערה: ניתן להתאים מישורי תמונה במהלך ההדמיה, אך התאמה כזו אינה נחוצה בדרך כלל.
    3. בחר את סוג קובץ פלט התמונה הרצוי ולאחר מכן בחר או בחר אפשרויות לאחר ההדמיה, כגון יצירת וידאו אוטומטית וסימני מים, לפי הרצות. אם ישים, בחר ניגודיות פאזה כמצב הדמיה.
      הערה: שימוש בסימן מים עלול לעכב את שלבי עיבוד התמונה הבאים.
    4. הגדר את משך ההקלטה ל- 72 שעות. הגדר את התוכנית כדי ללכוד תמונות כל 10 דקות.
      הערה: בדרך כלל נדרשים רק 48 שעות של הדמיה, אך ניתן לעצור את ההדמיה בכל נקודה לפני הסימן 72 שעות מבלי לאבד תמונות שכבר צולמו.
    5. ודא שהתא הסביבתי פועל כנדרש ב-5.3.1. שמור הגדרות אלה (השגרה) והתחל בהדמיה.
  5. המשך בהדמיה עד 72 שעות (או השעה שצוינה).

6. הדמיה חיה של תאי MEPM בבחנת תיקון פצעים(איור 3)

  1. הכן צלחת לשימוש להדמיה חיה. בעזרת מלקחיים, מניחים תוספת סטרילית של סיליקון 2-well במרכז באר של צלחת 6-well, ולחץ למטה לאורך כל הקצוות כדי להבטיח שהוא דבק לחלוטין. הכן הוספה אחת של 2-well עבור כל דגימה הנמצאת בשימוש.
  2. הפשר תאים מוקפאים על-ידי ביצוע השלבים בסעיף 4.3 של פרוטוקול זה. ספירת תאי MEPM, ובמידת הצורך, מרכז את התאים ל- 350 תאים/μL לפחות.
  3. זרע 1400 תאים/מ"מ2 לתוך הסיליקון מוסיף בנפח של 100 μL של מדיום תרבות MEPM לכל טוב. תרבית התאים במשך 48 שעות ב 37 °C בחממה עם 5% CO2, ולשנות את המדיום כל יום.
  4. לאחר 48 שעות להכין מיקרוסקופ להדמיה בזמן לשגות חי כמתואר בסעיפים 5.3 ו 5.4. מיד לפני הצבת התאים באינקובטור על הבמה, הוסף 3 מ"ל של מדיום תרבית MEPM מחמם מראש לבאר (אך מחוץ לתוספות), ולאחר מכן הסר בזהירות את תוספות הסיליקון.
    הערה: הקיר המפריד בין שני התאים משאיר פער שהוא "הפצע".
  5. התחל הדמיה בזמן לשגות כמתואר ב- 5.4, עם ההבדלים הבאים:
    1. השתמש במטרה הגדלה גבוהה יותר (למשל, פי 10). כדי ללכוד סגירת פצע, בחר 5 שדות ראייה לאורך כל פצע, כך שהפצע מקביל לציר האנכי של התמונה.
  6. הפסיקו את ההדמיה לאחר 72 שעות או כאשר הפצעים נסגרו לחלוטין.

7. ניתוח חישובי של רצפי תמונה לשגות זמן

הערה: בצע את ההליכים הבאים במחשב המצויד בכלים חישוביים סטנדרטיים, כגון מתורגמן הפיתון, מהדר C ומעטפת (ראה טבלת החומרים).

  1. ניתוח השפעה על המפגש
    הערה: ניתן להשתמש בהליך זה כדי להעריך את התפשטות התאים בתוך תרבות דלילה או כדי לכמת ניסויים לסגירת פצעים. כדי לזהות אזורים שנכבשו על-ידי תאים, סף פילוח מוחל על סטיית התקן המקומית של בהירות התמונה. הקוד תואר בעבר על ידי וו ואח'33 ונויפלד ואח'34 והוא זמין ב http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. קבעו את סף הפילוח של התמונות. כדוגמה, כדי לראות את הפילוח עם סף 4, הנפיק את הפקודה
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -פלט בדיקה.jpg
      ולאחר מכן בדוק את הפלט(פלט.jpg).
      הערה: אם הסף נמוך מדי, אזורי הרקע במיקרוגרף מסווגים ככיסוי תאים. לעומת זאת, אם הסף גבוה מדי, אזורים המכוסים בתאים אינם מסווגים ככאלה. ערך הסף האופטימלי שומר על שתי השגיאות לכל הפחות.
    2. השתמש בקובץ ה- Script שסופק area.sh כדי לחשב ערכי השפעה עבור רצף של תמונות כ
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg.... > השפעה.dat
      הערה: ערך סף האפליה 4 מאומת בשלב 1, והתוצאות מאוחסנות בזיהוי הקובץ.dat. על-ידי מיון התמונות לתיקיות מתאימות, ניתן להחליף את רשימת שמות קבצי התמונה בסימון תווים כלליים:
      area.sh -S4 * .jpg > .jpg >.dat
    3. לניסויי סגירת פצעים, הפוך את נתוני ההשפעה A(t)- הגודל של אזור מכוסה תא המתבטא כאחוז כפונקציה של מהירות התפשטות קצה פצע V כ-
      figure-protocol-1
      כאשר w מציין את רוחב השדה ו- dA/dt הוא נגזרת הזמן של A(t), כלומר קצב ההרחבה של האזור המכוסה בתא.
  2. מפת תנועתיות תאים
    1. בצע אלגוריתם velocimetry של תמונת חלקיקים (PIV) כדי לאפיין תנועתיות תאים, ולחלץ את מידת התנועה המקומית "זרימה אופטית" בין זוגות תמונה, אך לא כדי לזהות תאים בודדים.
      הערה: כאן, גודל חלון ראשוני של 50 מיקרומטר משמש, כמתואר בפירוט על ידי זמיר ואח'35 ו Czirok ואח'36, עם גודל חלון ראשוני של 50 מיקרומטר. ניתוח PIV מניב v(x,t) של שדה מהירות עבור כל מסגרת תמונה t ומיקום (בתוך התמונה) x.
    2. לחלץ את המהירות הממוצעת של תנועתיות התא מ v(x,t) כממוצע מרחבי המחושב על שטח הכבוש של התא, כפי שנקבע בסעיף 7.1.
  3. מעקב ידני אחר תאים
    הערה: בעוד ניתוח PIV מספק הערכה אוטומטית של תנועתיות התא, כדי להתמקד בהתנהגות של תאים בודדים דורש לעתים קרובות מעקב ידני. בעוד מספר כלים מספקים פונקציונליות זו, זה מאוד מועיל אם ניתן לשנות את הסמנים הממוקמים באופן ידני לאחר המיקום הראשוני שלהם, ואם המעקב יכול להתבצע הן קדימה והן אחורה בזמן.
    1. בצע מעקב אחר תאים באמצעות כלי פיתון שפותח בהתאמה אישית (http://github.com/donnagreta/cm_track), המספק גם פונקציות עריכה בסיסיות כגון מחיקת מקטעי מסלול.
      הערה: כלי מעקב ידני זה מניב את המיקומים P(i,t) של תא i בזמן t בקובץ טקסט, ומופעל כ
      cm_track.py -i תמונות / -o מסלול.dat
      כאשר התמונות של זמן לשגות נמצאות בתמונות התיקיה/ ונתוני המיקום נאספים ברצועת הקובץ.dat (איור 4).

figure-protocol-2
איור 4: ניתוח מסלולים בודדים של תאים. (A)מיקרוגרפים של ניגודיות פאזה בזמן מעידה כפופים להליך מעקב ידני, המסמן תאים (נקודות ירוקות). (D)מיקומי תאים (x,y) מאוחסנים עבור כל תא הנבדל במזהה שלו ולכל מסגרת f. (E)ניתן להציג מסלולים במיקרוגרפים ומקודדים בצבע כדי לציין מידע זמני. לדוגמה, בכל מסלול, לוח צבעים כחול-אדום מציין בהדרגה מקטעי מסלול מאוחרים יותר, כאשר אדום וכחול מסמנים את מיקומי התאים ההתחלתיים והסופיים, בהתאמה. (F)תכונות סטטיסטיות שונות של מסלולים, כגון עקירה מרובעת ממוצעת, ניתן לחלץ ולהשתמש בהם כדי לאפיין את תנועתיות של אוכלוסיות תאים שונות, אשר בדוגמה זו כוללים wildtype (wt, כחול), ו נוקאאוט (kd, אדום) תאי MEPM. סרגלי קנה המידה מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. מסלולי שכבת-על בתמונות באמצעות כלי שני, שהופעלו כ
    visdat.py -d מסלול.dat -i תמונות/ -o שכבת-על/ -l999 -r3 -C2
  2. אסוף את התמונות עם המסלולים מעל כיסוי שכבת העל של התיקיה.
    הערה: בדוגמה זו, נתוני מיקום התא מאוחסנים ברצועת הקובץ.dat, בעוד רצף התמונה של זמן לשגות נמצא בתוך תמונות התיקיה. שאר הפרמטרים שולטים באורך המקסימלי של המסלולים שצוירו (-l), בגודל הסמלים (-r) ובערך הצבעים (-C) שבו נעשה שימוש.
  1. ניתוח מסלולים בודדים של תאים
    1. אפיון מסלולים לפי אורך הנתיב הכולל
      figure-protocol-3,
      ועקירה נטו לכיוון הפצע
      figure-protocol-4,
      כאשר X מציין את ההקרנה של P בכיוון בניצב לפצע: קואורדינטת x של המיקומים כאשר הפצע מקביל לציר ה- y.
    2. חשב את יעילות ההדרכה figure-protocol-5 עבור כל תא i ונקודת זמן t37. לאפיין תרבויות על ידי ממוצע האוכלוסייה של אמצעים אלה תא יחיד, מוערך בנקודת זמן מתאימה t.
  2. תנועת הזרמה קולקטיבית של תאים
    1. לאפיין את המתאם המרחבי המקומי של תנועות תאים על ידי המהירות הממוצעת של תאים אחרים הנמצאים בקרבת תא נע, כפי שתואר קודם לכן38,39.
      הערה: הקוד החישובי זמין ב- https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. ישר מערכת הפניות עם כיוונים מלפנים, אחוריים, שמאליים וימינה לכל וקטור v(x,t) (איור 5A). הקצה כל אחד מהתא המקיף או וקטור מהירות PIV לתא המרחבי המתאים של מערכת הייחוס (איור 5B). חזור על ההליך כאשר כל וקטור משמש כמקור מערכות הייחוס (איור 5C, D) כך שהווקטור של מהירות נתונה מוקצה לפחים מרובים.
        הערה: נקודת נתונים יכולה להיות לפני וקטור, ומשמאל לווקטור אחר.
      2. סובבו את מערכות הייחוס לכיוון נפוץ(איור 5C,F)ושגלו אותן(איור 5G).
        הערה: הממוצע של כל סל של נתוני המהירות המאוחסים הוא וקטור מהירות (U) המעיד על מתאם מרחבי: הממוצע הוא מדד של רכיב מהירות משותפת (איור 5H).
      3. התאם את שדות הזרימה U(x) לפונקציה מעריכית figure-protocol-6 , כאשר a, x0 ו- U0 מתאימים פרמטרים. מתוך שלושת הפרמטרים המתאימים, התמקדו ב- x0, אורך המתאם (איור 5I,J), שהוא המרחק האופייני שבו קורלציות מהירות מהירות מקומיות נעלמות.

figure-protocol-7
איור 5: אפיון היווצרות זרם של תאים בתרבית. (A,D)תמונות של ניגודיות פאזה בזמן מעידה מאיור 4A משמשות לזיהוי תנועות תאים. עבור כל תא נע, מסגרת הפניה (כחול) ופלים מרחביים (לבן) היו מיושרים במשותף כדי לסווג תאים סמוכים כמי שנמצאים בחזית, מאחור, משמאל או ימינה. (B,E) המהירות של תאים סמוכים (וקטורים שחורים) הייתה קשורה לאותה מסגרת התייחסות (C,F). הליך זה חזר על עצמו עבור כל תא ונקודת זמן. (G)לאחר איגום מידע מקומי זה, כל סל יכיל וקטורים מרובי מהירות (אפור), אשר ניתן לחשב בממוצע כדי לקבוע את המהירות הממוצעת של הנעה משותפת (חיצי מגנטה) במיקומים שונים ביחס לתא רוטילי ממוצע. (H)מפת המהירות הממוצעת מאפיינת כך את מהירויות התא הטיפוסיות במיקומים שונים ביחס לתא נע. (I,J) לבסוף, שדה זה נדגם לאורך הציר הקדמי-אחורי (המקביל) וגם לאורך הציר השמאלי-ימין (בניצב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח המדפים הפלטאליים מומחש באיור 1. רצף החתכים נועד למזער את החלקת הרקמה. לאחר הסרת הראש (איור 1A,B),הלסת התחתונה מוסרת (איור 1B,C). החתירה של החלק העליון של הראש (איור 1C, D) נעשית כדי לייצב את הרקמה כאשר היא ממוקמת הפוך ( איור1E) כדי לדמיין (איור 1E,קווים מנוקדים),צביטה (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גובה מדף פלטאלי מהווה אירוע שיפוץ אנכי עד אופקי1,3,4,9,11. הוא להניח כי תהליך שיפוץ זה דורש תאים mesenchymal מדף palatal להתנהג בתיאום. הניתוחים עם תאי MEPM של סוג פראי מראים שהתנהגות תא זו היא מהותית וניתן הכמות שלה21. לכן, ניתן להשתמש בבחינתנים אלה כדי לחשוף פגמים ראשוניים בגובה מדף פלטאלי במודלים חדשים וקיימים של חיך שסוע. השיטות המת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט זה נתמך בחלקו על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות DE026172 (I.S.) ו- GM102801 (A.C. I.S. נתמך גם בחלקו על ידי מענק המצוינות במחקר ביו-רפואי (COBRE) (המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית P20 GM104936), מענק מצוינות מחקר מחקרי ביו-רפואי של קנזס (המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית P20 GM103418), ומענק המרכז הלאומי למוגבלויות שכליות והתפתחותיות בקנזס (U54 יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, HD090216).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
, 250 מ"ל (x2)פישר סיינטיפיקFB-100-250
CO2Matheson GasUN1013
צינורות חרוטיים, 15 מ"ל (x1)Midwest ScientificC15B
ההפעלה דביאןשל תמונות זמן-lapse
גלוקוז בינוני/גבוה של Dulbecco עם 4 מ"מ L-גלוטמין ונתרן פירובטCytiva מדעי החייםSH30243.01
EtOH, 100%Decon Laboratories2701
EVOS FL AutoThermoFisher ScientificAMAFD1000
EVOS Onstage IncubatorThermoFisher ScientificAMC1000
מחזיק כלי EVOS על הבמה, צלחות מרובות בארותThermoFisher ScientificAMEPVH028
סרום בקרעוברי קורנינג35-010-CV
נקודה עדינה #5 מלקחיים מנירוסטה (x2)כלי מדע עדינים11295-10דיסקציה
אמבט חרוזים מעקרכלי מדע עדינים18000-45
צינורות מיקרוצטריפוגה, 1.5 מ"לAvant2925
מספריים נירוסטה מיקרו-ניתוחים, ישרRobozRS-5910Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready TestsThermoFisher ScientificR37605
תמיסת סטרפטומיצין פניצילין, 100xCorning30-002-CI
תוספת סיליקון, 2 בארותIbidi80209
כף נירוסטה מחוררת קטנהכלי מדע עדיניםMC17Cדיסקציה
קפיץ מספריים, 4 מ"מFine Science Tools15018-10
סטרילי 10 ס"מקורנינג430293
סטרילי 12 בארות צלחותPR1MA667512
סטרילי 6 בארות צלחותThermo Fisher Scientific140675
סטרילי PBSCorning21-031-CV
פיפטהסטרילית להעברת נורת פלסטיקThermoFisher Scientific202-1S
טריפסין, 0.25%ThermoFisher Scientific25200056
ניתוח חישובי של מערכת מכשיר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37(2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392(2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463(2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452(2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186(2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822(2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929(2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901(2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818(2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404(2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006(2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007(2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203(2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים