הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוק תאים מאפיתל הלשון ומיסנצ'ימה/רקמת החיבור של עכברים בני 12.5 ו-8 שבועות

4.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62163

⸱

21 בינואר 2021

 ,  ,  , 
1Regenerative Bioscience Center; Department of Animal and Dairy Science, College of Agricultural and Environmental Sciences, University of Georgia

במאמר זה

סיכום

פיתחנו פרוטוקול כללי כדי לנתק כמות גדולה של תאים בודדים באיכות גבוהה מן האפיתל ו mesenchyme / רקמת חיבור של לשונות עכבר עובריות ובוגרות.

תקציר

דיסוציאציה של תאים הייתה הליך חיוני למחקרים ברמת התאים הבודדים ו/או ברמת אוכלוסיית התאים (למשל, רצף RNA של תא יחיד ותרבות תאים ראשונית). תשואת תאים בריאים ובת קיימא בכמויות גדולות היא קריטית, והתנאים האופטימליים לעשות זאת תלויים ברקמות. אוכלוסיות התאים באפיתל הלשון ורקמת החיבור הבסיסית הן הטרוגניות ומבני הרקמות משתנים באזורים שונים ובשלבים התפתחותיים שונים. בדקנו פרוטוקולים לבודד תאים מאפיתל לשון העכבר ורקמת mesenchyme / חיבור בשלבים ההתפתחותיים המוקדמים [יום עוברי 12.5 (E12.5)] ומבוגר צעיר (8 שבועות). הפרדה נקייה בין האפיתל לבין רקמת mesenchyme / חיבור הבסיסית היה קל להשיג. עם זאת, כדי להמשיך לעבד ולבודד תאים, מניב תאים בריאים קיימא בכמויות גדולות, ובחירה זהירה של מאגר עיכול אנזימטי, זמן הדגירה, ומהירות צנטריפוגה וזמן הם קריטיים. דגירה של אפיתל מופרד או רקמת mesenchyme / חיבור הבסיסית ב 0.25% טריפסין-EDTA במשך 30 דקות ב 37 °C (69 °F), ואחריו צנטריפוגה ב 200 x g במשך 8 דקות הביא תשואה גבוהה של תאים בשיעור כדאיות גבוהה (>90%) ללא קשר לשלבי העכבר ואזורי הלשון. יתר על כן, מצאנו כי הן אפיתל מנותק והן תאי רקמת mesenchymal / חיבור משפות עובריות ובוגרות יכול לשרוד במדיום מבוסס תרבות התא לפחות 3 שעות ללא ירידה משמעותית של הכדאיות התא. הפרוטוקולים יהיו שימושיים למחקרים הדורשים הכנת תאים מבודדים מלשונות עכבר בשלבים התפתחותיים מוקדמים (E12.5) ומבוגרים צעירים (8 שבועות) הדורשים ניתוק תאים מתאי רקמות שונים.

מבוא

לשון היונקים היא איבר מורכב הקריטי לטעם, דיבור ועיבוד מזון. הוא מורכב מסוגים רבים של רקמות מאורגנות מאוד ממודר על ידי mesenchyme / רקמת חיבור מכוסה על ידי גיליון אפיתל מרובד המכיל פפיליה טעם בלוטות טעם. אוכלוסיות התאים הן באפיתל הלשון והן ברקמת mesenchyme/connective הן הטרוגניות. כדי להבין טוב יותר את הפונקציות ואת ההפצה של סוג מסוים של תאים בלשון, מחקרים באמצעות תאים מנותקים נחוצים. לדוגמה, רצף RNA של תא יחיד הוא שיטה רבת עוצמה ובעלת תפוקה גבוהה לפרופיל שעתוק בתאים בודדים, אשר נועדה להבין את התמלול של רקמה מורכבת ברזולוציה של תא יחיד1,2,3,4. תרבות התאים העיקרית הוכחה ככלי שימושי לחקר הפונקציה והבידול של תאי גזע / אב לבלוטות טעם5,6. מחקרים אלה דורשים כמות גדולה של אוכלוסיות תאים מבודדים באיכות גבוהה (למשל, מספר תאים כולל מספיק עם ריכוז תקין וכדאיות גבוהה).

לכן, יש צורך לבודד תאים מאזורים שונים של הרקמות הלשונית בשלבים התפתחותיים שונים. נכון לעכשיו, אין פרוטוקול מפורט זמין עבור ניתוק התא מאפיתל הלשון ואת הרקמה mesenchyme / חיבור הבסיסית. כאן, אנו מדווחים על שיטת ניתוק תאים ממוטבת כדי להכין תאים לניסויים הדורשים איכות גבוהה של תאים חיים כגון עבור רצף RNA של תא יחיד ותרביות תאי גזע ראשוניות. מצאנו כי מבחר של מאגר עיכול אנזימטי, pipetting עדין, מבחר של מדיום resuspension, זמן צנטריפוגה אופטימלי ומהירות חיוניים כדי ליצור כמויות גדולות אלה של תאים באיכות גבוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

שימוש בבעלי חיים (עכברי C57BL/6 לאורך כל המחקר) אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ורג'יה והיה בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים למחקר.

1. שימוש בבעלי חיים

הערה: עכברים גודלו ומתוחזקים במתקן בעלי החיים של המחלקה למדעי בעלי חיים ומוצרי חלב באוניברסיטת ג'ורג'יה ב 22 °C (70 °F) תחת 12 שעות יום / לילה מחזורים.

  1. לייעד את הצהריים של היום של זיהוי תקע הנרתיק בעכברים כמו עוברי (E) יום 0.5. השתמש בעוברים ב- E12.5 ובעכברים לאחר לידה בגיל 8 שבועות לניסויים הבאים.

2. הכנה לפני הניסוי

הערה: המכשירים הדרושים לפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים.

  1. מכשירי אוטוקלאב לפני הניסוי. לעקר מכשירים באמצעות מעקר חרוזים במהלך הניסוי.
  2. נקו את האזור הכירורגי, את המיקרוסקופ הנותח ואת ארון האבטחה הביולוגית באמצעות מגבוני אתנול 70%. הפעל את אור UV של ארון biosafety ולשמור אותו על במשך 20 דקות לפני ההליך הניסיוני.
  3. הכן תערובת אנזימים של 1:1 dispase (5.0 מ"ג / מ"ל) וקולאזנאז (2.0 מ"ג / מ"ל) לריכוז סופי של 2.5 ו 1.0 מ"ג / מ"ל בהתאמה, ולסנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר7.
    1. הכן 1 מ"ל של תערובת אנזימים ללשון בוגרת או 0.5 מ"ל לאזור מסוים של הלשון (למשל, לשון אחורית או לשון 100 מטר).
    2. מכינים 2 מ"ל של תערובת אנזימים לשונות עובריות.
  4. הפוך 10 מ"ל של 2.5% BSA ב 0.1 M PBS ולסנן את הפתרון באמצעות מזרק 1 מ"ל ו 0.22 מיקרומטר מזרק מסנן.
  5. הפוך 500 μL של 5% FBS ב DMEM / F12.
  6. הפוך 3 מ"ל של DMEM / F12 המכיל 10% FBS ו 1% BSA ולסנן את הפתרון באמצעות מזרק 1 מ"ל ו 0.22 מיקרומטר מזרק מסנן.

3. הפרדת אפיתל הלשון מרקמת החיבור mesenchyme/הבסיסית

  1. הפרדת האפיתל מהמזנצ'ימה של לשון עכבר E12.5
    1. המתת חסד מתוזמן עכברים נקבה בהריון נושאת E12.5 עוברים על ידי הצבת אותו בתא CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם.
      הערה: עוברי עכבר ב E12.5 נאספים לאחר 12:00 (אחר הצהריים) ביום ה -12 לאחר גילוי של תקע הנרתיק בעכברים הנשיים בהריון.
    2. העבר עכברים לאזור הכירורגי. הרטב את בטן העכבר באמצעות 70% אתנול כדי למנוע פרווה מלהיכנס לאתר ההפעלה.
    3. פתח את הבטן באמצעות מספריים מנתחים כדי לחשוף את קרני הרחם הנושאות עוברים. לנתח את קרני הרחם באמצעות מספריים מנתחים ולהעביר אותו 15 מ"ל של הפתרון של Tyrode טרי בצלחת תרבות 100 מ"מ.
    4. לנתח את העוברים (איור 1A1) מקרני הרחם תחת מיקרוסקופ מנתח באמצעות מספריים מיני מלקחיים עדינים.
    5. פתחו בזהירות את חלל הפה לרווחה באמצעות מלקחיים עדינים ונתחו את הלשון מהלסת התחתונה באמצעות מספריים קטנים(איור 1A2).
    6. לשטוף את הלשונות באמצעות 15 מ"ל של פתרון טרי סטרילי Tyrode בצלחת תרבות 100 מ"מ.
    7. מעבירים את הרקמות ל-2 מ"ל של תערובת אנזימים של פירוק (2.5 מ"ג/מ"ל) וקולאזנאז (1.0 מ"ג/מ"ל) בצלחת תרבות של 35 מ"מ עם מרית ומלקחיים עדינים בארון ביו-רוויה. דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    8. מעבירים את הלשונות ל-15 מ"ל של פתרון Tyrode סטרילי טרי בצלחת תרבות של 100 מ"מ ומסירים בעדינות את המזנצ'ימה מהאפיתל מהצד הגחוני באמצעות מלקחיים עדינים.
      הערה: יריעות אפיתל ניתן להפריד ללא כוח מכני במהלך הדגירה.
    9. שטפו את האפיתליה המופרדת ואת mesenchyme פעמיים ב 15 מ"ל של פתרון Tyrode סטרילי טרי בצלחת תרבות 100 מ"מ.
      הערה: הפעילויות של dispase ו קולגנאז יהיה מעוכב על ידי EDTA בהליך ניתוק התא (שלב 4.1).
  2. הפרדת אפיתל הלשון מרקמת החיבור הבסיסית של עכברים בוגרים
    1. המתת עכבר בגיל 8 שבועות על ידי הצבתו בתא CO2. ודא שהעכבר מורדם ללא נשימות ותגובת צביטה מראש.
    2. העבר את העכברים לאזור הכירורגי. הרטב את ראש העכבר באמצעות 70% אתנול כדי למנוע פרווה מלהיכנס לחלל הפה.
    3. חותכים את פינות הפה לאורך הלחי באמצעות מספריים מנתחים כדי לפתוח את חלל הפה. לנתח את הלשון עם הלסת התחתונה (איור 1B1) ומניחים אותה בצלחת פלסטיק עם שכבה של ניילון נצמד.
    4. באמצעות מלקחיים כירורגיים כדי להחזיק את הלשון תחת מיקרוסקופ מנתח, להזריק את תערובת האנזים של dispase (2.5 מ"ג / מ"ל) וקולאזנאז (1.0 מ"ג / מ"ל) בחלל תת אפיתל של הלשון דרך חוד החנית (איור 1B1, חצים) של הלשון האחורית.
      1. להזריק 1 מ"ל של תערובת אנזימים באופן שווה לכל הלשון לאיסוף רקמות הן מהלשון הצדדית והן מהלשון האחורית.
      2. להזריק 0.5 מ"ל של תערובת אנזימים מקומית ללשון הקדמונית לאיסוף רקמות מקצה הלשון או ללשון האחורית לאיסוף רקמת פפילה circumvallate.
        הערה: הלשון תתנפח ככל שהאנזים יצטבר (איור 1B2). הזרקה עדינה של האנזים יכולה למנוע לחץ מפגיעה באפיתל ולשמור כמה שיותר אנזים בלשון.
    5. עוטפים את הלשון בניילון נצמד ומדגרים את הלשון במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
    6. השתמש במספריים מיני כדי לנתח את קצה הלשון ו / או circumvallate papilla, ולהשתמש מרית מלקחיים עדינים להעביר רקמה ל 15 מ"ל של פתרון של Tyrode סטרילי טרי בצלחת תרבות 100 מ"מ.
    7. הפרד את האפיתל מרקמת החיבור הבסיסית בחלל התת-אפיתל המתעכל באמצעות מספריים קטנים. לקצץ את הרקמות לגודל הנכון על פי הדרישה של ניסויים במורד הזרם.
    8. שטפו את האפיתל המופרד ואת רקמת החיבור הבסיסית פעמיים ב-15 מ"ל של הפתרון של Tyrode סטרילי טרי בצלחת תרבות של 100 מ"מ.
      הערה: הפעילויות של dispase ו קולגנאז יהיה מעוכב על ידי EDTA בהליך ניתוק התא (שלב 4.1).

4. ניתוק תאים

הערה: פרוטוקול ניתוק התא המתואר כאן יכול להיות מיושם על אפיתל הלשון ו mesenchyme / רקמת חיבור הן E12.5 עוברי ו 8 שבועות בן עכברים. כדי להפחית את אובדן התא במהלך עצבנות והעברת השעיית תאים, השתמש בטיפים מסחריים בעלי החזקה נמוכה של פיפטה או בטיפים מצופים מראש עם 2.5% BSA ב- 0.1 M PBS ב- pH 7.48.

  1. מעבירים את הרקמות באמצעות מרית ומלקחיים עדינים ל-3 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA בצלחת תרבות חדשה של 35 מ"מ למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בעדינות להתסיס רקמות כל 5 דקות עם טיפים פיפטה 1 מ"ל.
    הערה: אין לחתוך את קצה הפיפטה, שכן חוד החנית עלול לגרום נזק פיזי לתאים המנותקים.
  2. הוסף 500 μL של 5% FBS ב DMEM / F12 כדי לעצור את התגובה ולהעביר את המדיום לצינור צנטריפוגה מחייב נמוך 5 מ"ל.
  3. השעיית תא צנטריפוגה ב 200 x g במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.
  4. בעדינות להשעות מחדש תאים 3 מ"ל של DMEM / F12 המכיל 10% FBS ו 1% BSA באמצעות טיפים פיפטה 1 מ"ל ולסנן את התאים באמצעות מסננת תאים 70 מיקרומטר, ואחריו מסננת תאים 35 מיקרומטר.
  5. השעיית תא צנטריפוגה ב 200 x g במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את רוב המדיום ולהשאיר 50-300 μL כאמצעי האחסון הסופי כדי להשעות מחדש את התאים.
    הערה: התאם את ריכוז התאים בהתאם לדרישות הניסויים במורד הזרם על-ידי שינוי הנפח הסופי של השעיית תא יחיד.

5. בדיקת ספירת תאים וכדאיות באמצעות המוציטרומטר

הערה: כדי לשפר את דיוק המדידה, מומלץ לבצע 3 משכפלים טכניים עבור כל דגימה.

  1. מערבבים בעדינות 5-10 μL של המתלה תא יחיד עם נפח שווה של כחול Trypan ולהוסיף על המוציטרומטר.
    הערה: יש לנקות את המוציטרומטר ביסודיות באמצעות 70% אתנול לפני השימוש. חלקיקי אבק על המוציטרומטר יהיו מוכתמים בכחול כהה וישפיעו על הדיוק של בדיקת הכדאיות. בדוק את המוציטרומטר תחת מיקרוסקופ.
  2. ספור את מספר התא הכולל, את מספר התאים החיים (לבנים) ואת מספר התאים המתים (כחול כהה) המוכתמים בכחול Trypan(איור 2, חצים) בהתאמה ב- 4 ריבועים עם 16 רשתות (איור 2)באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם מערכת דימות.
  3. חשב את ריכוז התא:
    ריכוז תאים = figure-protocol-1
    1. חשב את הכדאיות:
      כדאיות = figure-protocol-2

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרדת אפיתל הלשון מרקמת המזנצ'ים/חיבור הבסיסית
בלשון העכבר העוברי, ניתן לראות פער במרחב התת-אפיתל לאחר עיכול אנזים תקין. יריעות אפיתל של לשונות מסוימות מופרדות ללא כוח מכני במהלך הדגירה.

בלשון העכבר הבוגר, הזרקת אנזים מוצלחת מסומנת על ידי הנפיחות באזורים המוזרקים (איור 1B2 ), מה שמרמז עלכךשהאנזים יכול להיות מוחזק על ידי הלשון. אין מספיק אנזים ו/או החדרת מחט עמוקה למזנכיים ו/או חדירת אפיתל הלשון על ידי מחט יגרום לנפיח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עד כה, לא היה פרוטוקול מפורט זמין עבור ניתוק התא מאפיתל הלשון ואת המזנצ'ימה הבסיסית / רקמת חיבור. פרוטוקול ניתוק תאים נוכחי זה מספק הליך לשחזור כדי ליצור השעיית תא בודד עם כדאיות גבוהה של תאים (>90%) מרקמות לשון העכבר, כולל יריעות אפיתל ורקמות mesenchyme / חיבור בשלבים העובריים ולאחר הלידה למרות תאים מבודדים מ E12.5 ועכברים בוגרים שונים בגודלם. לדוגמה, תאים מבודדים מהאפיתל והמזנצ'ימה של לשונות העכבר E12.5 עקביים וקטנים בניגוד לשונות גדולה (מקטנה לגדולה) של תאים משפת עכבר בת 8 שבועות. עם היתרון של הכדאיות הגבוהה (>90%) של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, מספר מענק R01DC012308 ו R21DC018089 ל- HXL. אנו מודים לברט מרשל (אוניברסיטת ג'ורג'יה, אתונה, GA) ואגון רנגיני (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) על סיוע טכני וייעוץ לגבי ניתוק התא; כדי פרנסיסקו גיבסון ברנלי (אוניברסיטת ג'ורג'יה, אתונה, GA) לעריכה אנגלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלבומין בסרום בקר (BSA)עכבר Gold BiotechnologyA-420-100
C57BL/6 (C57BL/6J)מעבדת ג'קסון000664
קולגנאז (קולגנאז A)10103586001סיגמא-אולדריץ'
(קוטר 35 מ"מ)Genesee Scientific32-103G
צלחת תרבית (קוטר 100 מ"מ)Genesee מדעי32-107G
dispase (Dispase II)Sigma-Aldrichמספריים
(מספריים עדינים לסטודנטים)מצא כלי מדעי91460-11
DMEM/F12Gibco11320033
סרום בקר עוברי (FBS)מלקחייםC838U82
(Dumount #3 מלקחיים)מצא כלי מדע11293-00
המוציטומטרHausser Scientific3520
מיקרוסקופ הפוך עם מערכת הדמיה (EVOS XL Core Cell Imaging System)Life TechnologiesAMEX1000
קצות פיפטה עם שמירה נמוכהMETTLER TOLEDO17014342
מיני מספריים (Evo Spring Scissors)כלי מדע עדין15800-01
עיוות פלסטיקVWR46610-056
מרית (כפית מוריה)כלי מדע עדין10321-08
מלקחיים כירורגיים (Dumount #2 מלקחיים למינקטומיה)כלי מדע עדין11223-20
טריפן כחולGibco15250061
Tyrode' s תמיסה: Sigma-AldrichT2145-10Lעשוי ממלחי טירוד
0.25% טיפסין-EDTAGibco25200056
0.1 M תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)Hoefer33946עשוי מ-1 M PBS
0.22-μ מסנן מזרק mGenesee Scientific25-243
70% אתנולKoptec233919עשוי מ-100% אתנול
1-מ"ל מזרקBD8194938
5-mL צינור מיקרוצנטריפוגה מחייב נמוךEppendorf30122348
30-G מחטBD9193532
35-μ מסננת תאים mFalcon64750
70-μ מסננת תא mFalcon64752
צלחת תרבית לניתוח 04942078001 עדינים שיבוט

מקורות

  1. Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).
  2. Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
  3. Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367(2018).
  4. Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  5. Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  6. Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
  7. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  8. Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. Tissue Morphogenesis. , Springer. 135-162 (2015).
  9. Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד מזנכימהלשון עכבר עובריתלשון עכבר בוגרתעיכול אנזימטיTrypsin-EDTAרצף של תא בודדתרבית תאים ראשונית
ניתוק תאים מאפיתל הלשון ומיסנצ'ימה/רקמת החיבור של עכברים בני 12.5 ו-8 שבועות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.