Method Article

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

DOI:

10.3791/62175

⸱

August 21st, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים נחשפים ללא הרף לחומרי DNA שונים הפוגעים בדנ"א, מה שמעורר תגובות תאיות שונות. יישום גישות ביוכימיות וגנטיות חיוני בחשיפת אירועים תאיים הקשורים לגיוס והרכבה של מתחמי תיקון DNA באתר של נזקי DNA. בשנים האחרונות פותחו מספר כלים רבי עוצמה כדי לגרום לנזק דנ"א ספציפי לאתר. יתר על כן, טכניקות שמיות חדשניות מאפשרות לנו ללמוד תהליכים אלה ברמת הרזולוציה של תא אחד באמצעות תאים קבועים וחיים כאחד. למרות שטכניקות אלה שימשו לחקר תהליכים ביולוגיים שונים, בזאת אנו מציגים את הפרוטוקולים הנפוצים ביותר בתחום תיקון ה- DNA, חיסון פלואורסצנטי (IF) ו- Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), אשר בשילוב עם נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז מאפשר לדמיין ולכומת את התפוסה הגנומית של גורמי תיקון DNA בצורה מכוונת ומוסדרת, בהתאמה. טכניקות אלה מספקות כלים רבי עוצמה לחוקרים לזהות חלבונים חדשניים הקשורים ללוק הגנומי הפגוע, כמו גם את השינויים שלאחר התרגום הדרושים לוויסות הכוונון שלהם במהלך תיקון ה- DNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגנום שלנו מאותגר כל הזמן על ידי סוכני DNA שונים המזיקים. תקיפות אלה יכולות לנבוע ממקורות סביבתיים, כגון אור UV או הקרנה, כמו גם ממקורות אנדוגניים, כגון תוצרי לוואי מטבוליים הנגרמים על ידי עקה חמצונית או שגיאותשכפול 1,2. נגעים אלה יכולים להשפיע על השלמות של גדיל DNA אחד או שניהם, ואם השגיאות שנוצרו להיות מתמשך, זה מוביל לעתים קרובות translocations וחוסר יציבות גנום, אשר עלול לגרום tumorigenesis3,4. כדי לשמור על שלמות הגנום, פותחו מערכות תיקון מרובות במהלך האבולוציה. על פי התכונות הכימיות והפיזיות של סוגים מסוימים של נזק DNA, מנגנוני תיקון מרובים ניתן ל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. חיסונים של חלבונים ספציפיים

  1. הכנת תרבית תאים והגדרה ניסיונית
    1. שמור על תאי U2OS בשכבות מונו-שכבתיות במדיום תרבית DMEM בתוספת סרום עגל עוברי 10%, גלוטמין 2 mM, ו 1% פתרון אנטי-אנטי-ממיקוטי.
      הערה: עבור אינדוקציה נזק DNA מבוסס אנדונוקלאז, להשתמש פחם מטופל או בינוני ללא סטרואידים כדי למנוע דליפה במערכת.
    2. לגדל תאים בסביבת 5% CO2 לח ב 37 °C (77 °F) עד 80% מפגש, חידוש בינוני כל 2-3 ימים.
    3. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים עם 1x PBS. נתק תאים באמצעות פתרון טריפסין-EDTA. כאשר התאים מתנתקים, הפסק את פעילות טריפסין על-ידי הוספת מדיום תרבית לתאים, הניבה השעיית תאים.
    4. ספירת התאים באמצעות תא ספירת תאים. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להשיג לימוד תהליכי תיקון המושרים על-ידי DSB בתאים באמצעות זיהום יציב או ארעי. עם זאת, יש לציין כי transfection יציב מבטיח אוכלוסיית תאים הומוגניים, אשר נותן תגובה תאית מאוחדת ולכן אמין יותר. במקרה של ארעיות, רק חלק קטן מאוכלוסיית התאים תופס ומתחזק את הפלסמיד, אשר מכניס גיוון לניסוי. הקמת מערכות תאים מבוססות אנדונוקלאז ER-I-PpoI או ER-AsiSI דורשת 50% מאוכלוסיית תאים משתלבים, אשר מועברת בצורה יעילה יותר עם פלסמידים המקודדים את האנדונקולאז. עבור transfection, ריאגנטים transfection זמין מסחרית או שיטות מבוססות זיהום ויר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שתיקון DNA הוא תחום מחקר חדש יחסית, הידע שלנו מתרחב במהירות בעזרת שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות שונות. שימור מידע גנטי חיוני לתאים שכן מוטציות המתרחשות בגנים המעורבים בתהליכי תיקון הן בין הגורמים המובילים לגידול ולכן מבעירה את השלבים העיקריים של מסלולי תיקון DNA היא חיונית.

טכניקות ביוכימיות (כלומר, כתם מערבי, אימונופרציפיטציה, ספקטרומטריית מסה וכו ') דורשות מספר רב של תאים ותהליכי התיקון הנחקרים מייצגים תמונת מצב של אוכלוסיית התאים הרצויה. ביצוע ניסויי ChIP הוא עבודה, בעייתי ושיקולים רב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי משרד המחקר, הפיתוח והחדשנות הלאומי המעניק ל- GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, מלגת המחקר של יאנוס בוליאי של האקדמיה ההונגרית למדעים BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, מלגת EMBO לטווח קצר 8513, וקרן טמפוס.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgaroseLonza50004
תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית (100 פעמים;), מיוצבSigma AldrichA5955
Anti-gamma H2A. X (פוספו S139) נוגדןAbcamab26350
בקר סרום שבר V אלבומיןBioseraPM-T1725
TrackIt™ מאגר טעינה ציאן/צהובThermo Fisher Scientific10482035
DMEM עם 1.0 גרם/ליטר גלוקוז, ללא L-גלוטמיןלונזה12-707F
דוקסיציקליןסיגמא אולדריץ'D9891
Dynabeads™ M-280 כבשים נגד עכבר IgGInvitrogen11202D
Dynabeads ומסחר; M-280 כבשים אנטי-ארנב IgGInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigma AldrichE3889
אתנולטוחנת כימיקלים02910-101-340
סרום בקר עוברי (מוצא דרום אמריקה), תמיסתGibcoECS0180L
פורמלדהיד 37% ללא חומצהסיגמא אולדריץ'1.03999
GlutaMAX ™ תוסף תזונהThermo Fisher Scientific35050038
GlycineSigma Aldrich50046
ערכת IPure v2DiagenodeC03010015
אלכוהול איזואמילSigma AldrichW205702
LiClSigma AldrichL9650
NaClSigma AldrichS5886
ו-DOCSigma AldrichD6750
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticusSigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
אבקת PBS ללא Ca2+, Mg2+Sigma AldrichL182-50-BC
פנולסיגמא אולדריץ'P4557
צינורותSigma AldrichP1851
פוליסורבט 20 (Tween 20)כימיקלים טוחנים09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong™ תושבת זהב נגד דהייה עם DAPIתרמו פישר סיינטיפיקP36935
סט קוקטיילים מעכב פרוטאז IRoche11873580001
Proteinase KSigma AldrichP2308
P-S2056 DNAPKcs נוגדןAbcamab18192
RNase ARoche10109169001
CH3COONaSigma AldrichS2889
SDSSigma AldrichL3771
Tris Acetate-EDTA bufferSigma AldrichT6025
Tris-HClSigma Aldrich91228
TRITON X-100Molar Chemicals09370-006-340
טריפסין מלבלב חזירSigma AldrichT4799
טריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדוםGibco15400054

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Site Specific DNA DamageDNA RepairChromatin ImmunoprecipitationFluorescence ImmunostainingDouble Strand BreaksProtein RecruitmentPost Translational ModificationsSingle Cell ResolutionWestern BlotSuper Resolution Microscopy

Related Articles