הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח של Vasospasm מוחי במודל מורין של דימום subarachnoid עם אולטרסאונד דופלקס Transcranial בתדר גבוה

3.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62186

⸱

3 ביוני 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz, 2Center for Cardiology - Cardiology I, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz, 3Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK) - Partner site Rhine-Main, 5Department of Anesthesiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מטרת כתב היד היא להציג שיטה מבוססת סונוגרפיה המאפשרת הדמיה של זרימת הדם בעורקים מוחיים בעכברים. אנו מדגימים את היישום שלה כדי לקבוע שינויים במהירות זרימת הדם הקשורים vasospasm במודלים מורין של דימום subarachnoid (SAH).

תקציר

vasospasm מוחי המתרחשת בשבועות לאחר דימום תת-אראצנואידי, סוג של שבץ דימום, תורם איסכמיה מוחית מעוכבת. בעיה נתקל במחקרים ניסיוניים באמצעות מודלים מורין של SAH היא כי שיטות ניטור in vivo של vasospasm המוח בעכברים חסרים. כאן, אנו מדגימים את היישום של אולטרסאונד בתדר גבוה לבצע בדיקות סונוגרפיה דופלקס transcranial על עכברים. באמצעות השיטה, ניתן היה לזהות את עורקי העורק הראשי הפנימיים (ICA). מהירויות זרימת הדם ב- ICAs תוך ורידי הואצו באופן משמעותי לאחר אינדוקציה של SAH, בעוד מהירויות זרימת הדם ב- ICAs חוץ-סריאלי נשארו נמוכות, דבר המצביע על vasospasm מוחי. לסיכום, השיטה המודגמת כאן מאפשרת ניטור פונקציונלי ולא פולשני של ווספסם מוחי במודל SAH מורין.

מבוא

דימום תת-אראצנואידי ספונטני (SAH) הוא סוג של שבץ דימומי הנגרם בעיקר על ידי קרע של מפרצת תוךנדרית 1. התוצאה הנוירולוגית מושפעת בעיקר משני גורמים: פגיעה מוחית מוקדמת (EBI), הנגרמת על ידי השפעות הדימום והאיזכמיה המוחית העולמית החולפית הקשורה, ואיסכמיה מוחית מעוכב (DCI), המתרחשת בשבועות שלאחר הדימום2,3. DCI דווח להשפיע על עד 30% של חולי SAH2. הפתופיזיולוגיה של DCI כרוכה vasospasm מוחי אנגיוגרפי, microcirculation מופרע הנגרמת על ידי microvasospasms ו microthrombosis, דיכאון התפשטות קליפת המוח, והשפעות המופעלות על ידי דלקת4. למרבה הצער, הפתופיזיולוגיה המדויקת עדיין לא ברורה ואין טיפול זמין המונע ביעילות DCI3. לכן, DCI נחקר במחקרים קליניים וניסיוניים רבים.

כיום, רוב המחקרים הניסיוניים על SAH משתמשים במודלים קטנים של בעלי חיים, במיוחד בעכברים5,6,7,8,9,10,11,12,13. במחקרים כאלה, vasospasm מוחי נחקר לעתים קרובות כנקודת קצה. זה נפוץ לקבוע את מידת vasospasm אקס ויוו. הסיבה לכך היא כי שיטות פולשניות לבדיקה vivo של vasospasm מוחי הדורש זמן הרדמה קצר הטלת רק מצוקה קטנה על בעלי החיים חסרים. עם זאת, בדיקה של vasospasm מוחי vivo יהיה יתרון. הסיבה לכך היא כי זה יאפשר אורך במחקרים vivo על vasospasm בעכברים (כלומר, הדמיה של vasospasm מוחי בנקודות זמן שונות בימים שלאחר אינדוקציה של SAH). פעולה זו תשפר את ההנאה של נתונים שנרכשו בנקודות זמן שונות. יתר על כן, באמצעות עיצוב מחקר אורך היא אסטרטגיה כדי להפחית את מספר בעלי החיים.

כאן אנו מדגימים את השימוש באולטרסאונד transcranial בתדירות גבוהה כדי לקבוע את זרימת הדם בעורקים מוחיים בעכברים. אנו מראים כי, בדומה לסונוגרפיה דופלר transcranial (TCD) או סונוגרפיה דופלקס מקודדת בצבע transcranial (TCCD) בפרקטיקה קלינית14,15,16,17,18, שיטה זו יכולה לשמש כדי לפקח על vasospasm המוחי על ידי מדידת מהירויות זרימת הדם של העורקים תוך ורידי לאחר אינדוקציה SAH במודל המורין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה האחראית לטיפול בבעלי חיים (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) ובוצעו בהתאם לחוק הגרמני לרווחת בעלי חיים (TierSchG). כל ההנחיות הבינלאומיות, הלאומיות והמוסדיות הרלוונטיות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים בוצעו. במחקר זה, ביצענו מדידות של מהירויות זרימת הדם של עורקים תוך ורידי ו extracranial בעכברים C57BL/6N נקבה בגילאי 11-12 שבועות עם משקל גוף בין 19-21 גרם. העכברים היו נתונים או אינדוקציה SAH או ניתוח מזויף, אשר תואר בפירוט במקומותאחרים 10,12,13.

1. הכנת חומרים

  1. הפעילו את מכונת האולטרסאונד והזינו את תעודת הזהות של החיה.
  2. מחממים את צלחת החימום של מערכת האולטרסאונד ל 37 מעלות צלזיוס. ודא כי גשוש הטמפרטורה רקטלית מוכן לשימוש.
  3. השתמש באמבט מים כדי לחמם את ג'ל אולטרסאונד ל 37 מעלות צלזיוס. מכינים קרם להסרת שיער, קרם מגע לאלקטרודות ומשחה לעיניים.

2. הרדמה

  1. לגרום להרדמה על ידי לשים את העכבר בתא סמוק עם 4% isoflurane ו 40% O2 במשך 1 דקות. להגן על העיניים עם משחת עיניים. המשך רק לאחר הרדמה עמוקה מספיק הושגה (היעדר תגובות לגירויים כאב).
  2. לשמור על הרדמה עם 1.5% isoflurane ו 40% O2 באמצעות מסכת הרדמה לאורך כל ההליך.

3. קביעת מהירויות זרימת הדם של העורקים הפנימיים תוך ורידי עם סונוגרפיה דו-צדדית בתדר גבוה transcranial

  1. מניחים את העכבר בתנוחה נוטה על צלחת החימום של מערכת אולטרסאונד כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של 37 מעלות צלזיוס.
  2. מצפים את ארבעת הגפיים של החיה במשחה מוליך ומתקן אותם עם סרט הדבקה על אלקטרודות א.ק.ג. המוטמעות בלוח. בדוק אם הפרמטרים הפיזיולוגיים (א.ק.ג., אות נשימה) מוצגים כראוי על המסך של מערכת ההדמיה (למשל, Vevo3100). במידת הצורך, להתאים את רמת ההרדמה כדי לקבל קצב לב היעד של 400-500 פעימות לדקה (bpm).
  3. מניחים סיכה על בדיקה טמפרטורה רקטלית בזהירות להכניס אותו כדי לפקח על טמפרטורת הגוף. יש להשתמש במנורת חימום נוספת במידת הצורך.
  4. לפני הבדיקה הראשונה, להסיר את הפרווה ב occiput כימית באמצעות קרם להסרת שיער. השתמש ספוגית כותנה כדי להפיץ ולשפשף את השמנת במשך 2 דקות עד השערות להתחיל לנשור.
    1. לאחר 2 דקות נוספות, להסיר את השמנת והשערות עם מרית ולחטא את העור עם חיטוי עור אלכוהולי. מצפים אותו עם ג'ל אולטרסאונד מחומם ל 37 מעלות צלזיוס.
  5. השתמש מתמר מערך ליניארי 38 MHz וקצב מסגרות מעל 200 מסגרות / ים כדי לרכוש תמונות אולטרסאונד ולקבע את החללית בזרוע מכני. מניחים את המתמר על occiput מוטה לאחור על ידי 30 °.
  6. השתמש במצב בהירות-(B)-mode ו- Color-wave-(CW) Doppler-mode כדי לדמיין את עורק העורק הראשי הפנימי התוך-נדרי הימני ולהזיז את המתמר עם יחידת הבקרה קדימה ואחורה, עד שנמצא הזרימה המקסימלית של העורקים.
  7. כדי לאסוף מידע אנטומי, השתמש במצב B-Mode ו- CW-Doppler המסורתיים והתחל ברכישה על-ידי לחיצה על לחצן רכוש.
    1. כדי לתעד מידע על מאפייני הזרימה של כלי הדם תוך נדריים לחץ על כפתור דופק-גל (PW) דופלר, למקם את נפח המדגם במרכז הכלי, ולרכוש לולאת cine יותר מ 3 s.
  8. המשך באופן זהה עם הצד השמאלי.
  9. המשך עם העורקים הראשיים החוץ-סידוריים.

4. קביעת מהירויות זרימת הדם של העורקים הראשיים הפנימיים החוץ-קרניים עם סונוגרפיה דו-צדדית בתדר גבוה

  1. מניחים את העכבר במצב supine על צלחת החימום של מערכת אולטרסאונד כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של 37 מעלות צלזיוס.
  2. מצפים את ארבעת הגפיים של החיה במשחה מוליך ומתקן אותם עם סרט הדבקה על אלקטרודות א.ק.ג. המוטמעות בלוח. בדוק שוב את התצוגה הנכונה של הפרמטרים הפיזיולוגיים על המסך.
  3. לפני הבדיקה הראשונה, להסיר את השיער בצוואר הקדמי כימי באמצעות קרם להסרת שיער כמתואר לעיל. מצפים את הצוואר הקדמי עם ג'ל אולטרסאונד מחומם ל 37 מעלות צלזיוס.
  4. השתמש מתמר מערך ליניארי 38 MHz וקצב מסגרות מעל 200 מסגרות / ים כדי לרכוש תמונות אולטרסאונד. מניחים את המתמר במקביל לבעל החיים ומתאימים את התנוחה על מנת לקבל תמונות אורך של העורק הראשי הנכון.
  5. השתמש במצב בהירות-(B) ובמצב דופלר של גלי צבעים כדי להציג באופן חזותי את עורק העורק הראשי הנכון. התמונה צריכה להכיל את העורק הראשי המשותף הנכון (RCC), את עורק העורק הראשי הפנימי הימני (RICA) ואת העורק הראשי החיצוני הימני (RECA).
  6. כדי לאסוף מידע אנטומי, השתמש במצב B-Mode ו- CW-Doppler המסורתיים והתחל ברכישה על-ידי לחיצה על לחצן רכוש.
    1. כדי לתעד מידע על מאפייני הזרימה של עורק העורק הראשי החוץ-סחיר לחץ על כפתור הדופלר Pulse-Wave (PW), הנח את נפח הדגימה במרכז מרכז העורק הראשי המשותף, עורק העורק הראשי הפנימי ועורק הראשי החיצוני ורכוש לולאת cine יותר מ -3 s.
  7. המשך באופן זהה עם הצד השמאלי.
  8. לסיים את ההרדמה ולהסיר את החיה מלוח ההתחממות. מחזירים את החיה לכלוב שמונח באינקובטור מחומם ל-37 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי למנוע היפותרמיה ולבדוק אם יש החלמה מלאה.

5. עיבוד נתוני אולטרה-סאונד

  1. השתמש בתחנת עבודה חיצונית לעיבוד שלאחר נתוני אולטרסאונד בתדירות גבוהה. ייצאו תמונות במצב B, מצב CW-דופלר ומצב PW-דופלר ולולאות cine.
  2. פתח את מחקר אולטרסאונד מיוצא. בחר בעל חיים אחד ופתח את לולאת הסינוס PW-Doppler של עורק העורק הראשי תוך חיים. בפרוטוקול זה נרשמים בדרך כלל 7 עד 8 פעימות לב ועקומות תואמות של מהירות זרימה.
  3. השהה את לולאת הסינוס ולחץ על לחצן מדידה. בחר את חבילת כלי הדם ולחץ על RICA PSV כדי למדוד את הלחץ הסיסטולי שיא (PSV). עכשיו לחץ שמאלה על פסגת עקומת מהירות ולמשוך את הקו הישר לקו האפס. קבע את המדידה בלחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני.
  4. עכשיו לבחור RICA EDV כדי למדוד את המהירות enddiastolic (EDV). לחץ שמאלה על פריחה מינימלית של עקומת המהירות בסוף diastole. משוך את הקו ישר לקו האפס וקבע מידות בלחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני.
  5. בחר RICA VTI כדי למדוד את אינטגרל זמן המהירות (VTI). לחץ שמאלה בתחילת עקומת מהירות ועקוב אחר העקומה עם העכבר עד סוף הרמה הדיאסטולית. לאחר מכן לחצו שוב ימינה כדי לקבוע את המדידה.
  6. יצא את הנתונים של העורקים הפנימיים תוך-מוחיים באמצעות לחצן הדוח. הקש על יצא ושמור את הנתונים כקובץ דוח VSI.
  7. השתמש באותה גישה כדי למדוד PSV, EDV ו- VTI של העורקים הראשיים הפנימיים החוץ-קרניים הנכונים ולייצא את הנתונים בהתאם.
  8. המשך באופן זהה עם הצד השמאלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ב 6 עכברים, ב 3 אשר SAH היה המושרה באמצעות מודל ניקוב חוט אנדווסקולרי בעוד 3 השיגו ניתוח מזויף, מהירויות זרימת הדם של עורק העורק הראשי הפנימי תוך ורידי (ICA) ושל ICA extracranial נקבעו יום אחד לפני הניתוח, ו 1, 3, ו 7 ימים לאחר הניתוח. המדידות בוצעו כחלק מבדיקות אקו לב של מחקר אחר בהרדמה עם isoflurane תוך שמירה על טמפרטורת הגוף ב 37 °C(79°F 19 ).

לפני הניתוח, מהירויות זרימת הדם החוץ-תוך ורידי, כמו גם המנה של זרימת דם תוך-סידורית וחוץ-סידורית היו דומות בין SAH לבעלי חיים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למיטב ידיעתנו, מחקר זה הוא הראשון להציג פרוטוקול לניטור vasospasm המוחי במודל מורין של SAH עם אולטרסאונד דופלקס בצבע transcranial בתדר גבוה מקודד צבע. אנו מראים כי שיטה זו יכולה למדוד עלייה במהירות זרימת הדם תוך ורידי לאחר אינדוקציה SAH בעכברים. ברפואה האנושית תופעה זו ידועה היטב3,15. מספר מחקרים קליניים הראו כי מהירויות זרימת דם גבוהות של העורקים התוך ורידי הגדולים מנה גבוהה של מהירויות זרימת דם תוך אסטרניאלית ו extracranial הם תוצאה תפקודית של כלי צמצום בקורלצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

המחברים מבקשים להודות לסטפן קינדל על הכנת האיורים בסרטון. PW, MM ו- SHK נתמכו על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ומחקר (BMBF 01EO1503). העבודה נתמכה על ידי מענק מכשור גדול של קרן המחקר הגרמנית (DFG INST 371/47-1 FUGG). MM נתמך על ידי מענק של אלזה קרנר-Fresenius-Stiftung (2020_EKEA.144).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קרם הסרת שיער BaleaBalea; גרמניהASIN B0759XM39Vקרם הסרת שיער
C57BL/6N עכבריםJanvier; Saint-Berthevin Cedex, צרפתn.a.mice
CorneregelBausch& לומב; רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"בREFמשחת עיניים, צמר
גפןHecht Assistent; Sondenheim vor der Rö hn, גרמניהREF 44302010צמר גפן
סכין גילוח Ecco-XSTondeo; סוליג'ן, גרמניהDE 28693396סכין גילוח
קרם אלקטרודהGE; בוסטון, MA, ארה"בREFמשחה מוליכה
צלחת חימוםMedax; קיל, גרמניה2005-205-01
IsofluraneAbvie; ויסבאדן, גרמניהn.a.חומרהרדמה נדיף
LeukofixBSN רפואי; המבורג, גרמניהREF 02137-00קלטת
זרוע מכנית + מיקרומניפולטורVisualSonics; פוג'יפילם, טורונטו, קליפורניהP/N 11277
רקמות מיקרובקפול הרטמן AG; המבורג, גרמניהREF 981387רקמות אנטי-מיקרוביאליות
MZ400, מתמר מערך ליניארי 38 מגה-הרץVisualSonics; FujiFilm, טורונטו, קליפורניהREF 51068-30מתמר אולטרסאונד
SonosidASID Bonz GmbH; הרנברג, גרמניהREF 782010ג'ל אולטרסאונד
פלטפורמת אולטרסאונד עם פלטת חימום והקלטת א.ק.גVisualSonics; פוג'יפילם, טורונטו, קליפורניהP/N 11179
UniVet-PortaGroppler; אוברפרסברג, גרמניהS/N BKGM0437וופורייזר איזופלורן
Vevo3100VisualSonics; FujiFilm, טורונטו, קליפורניהREF 51073-45מכשיר אולטרסאונד
תוכנת VevoLabVisualSonics; FujiFilm, טורונטו, קליפורניהתוכנתהערכה
81552983 סיכה 21708318

מקורות

  1. Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Spontaneous subarachnoid haemorrhage. Lancet. 389 (10069), 655-666 (2017).
  2. Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
  3. Francoeur, C. L., Mayer, S. A. Management of delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. Critical Care. 20 (1), 277(2016).
  4. van Lieshout, J. H., et al. An introduction to the pathophysiology of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgical Review. , (2017).
  5. Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J Neurosci Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
  6. Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
  7. Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neuroscience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
  8. Provencio, J. J., Altay, T., Smithason, S., Moore, S. K., Ransohoff, R. M. Depletion of Ly6G/C(+) cells ameliorates delayed cerebral vasospasm in subarachnoid hemorrhage. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 94-100 (2011).
  9. Kamp, M. A., et al. Evaluation of a murine single-blood-injection SAH model. PLoS One. 9 (12), 114946(2014).
  10. Luh, C., et al. The Contractile Apparatus Is Essential for the Integrity of the Blood-Brain Barrier After Experimental Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
  11. Neulen, A., et al. A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  12. Neulen, A., et al. Large Vessel Vasospasm Is Not Associated with Cerebral Cortical Hypoperfusion in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
  13. Neulen, A., et al. Neutrophils mediate early cerebral cortical hypoperfusion in a murine model of subarachnoid haemorrhage. Scientific Reports. 9 (1), 8460(2019).
  14. Neulen, A., et al. Volumetric analysis of intracranial vessels: a novel tool for evaluation of cerebral vasospasm. Int J Comput Assist Radiol Surg. 14 (1), 157-167 (2019).
  15. Washington, C. W., Zipfel, G. J. Participants in the International Multi-disciplinary Consensus Conference on the Critical Care Management of Subarachnoid, H. Detection and monitoring of vasospasm and delayed cerebral ischemia: a review and assessment of the literature. NeuroCritical Care. 15 (2), 312-317 (2011).
  16. Greke, C., et al. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of defined segments of intracranial arteries. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 25 (1), 55-61 (2013).
  17. Neulen, A., Prokesch, E., Stein, M., Konig, J., Giese, A. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of vasospasm after subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 145, 14-18 (2016).
  18. Neulen, A., et al. Image-Guided Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Posthemorrhagic Vasospasms of Infratentorial Arteries: A Feasibility Study. World Neurosurgery. 134, 284-291 (2020).
  19. Neulen, A., et al. Correlation of cardiac function and cerebral perfusion in a murine model of subarachnoid hemorrhage. Scientific Reports. 11 (1), 3317(2021).
  20. Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), 0172010(2017).
  21. Marbacher, S., et al. Systematic Review of In Vivo Animal Models of Subarachnoid Hemorrhage: Species, Standard Parameters, and Outcomes. Translational Stroke Research. , (2018).
  22. Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
  23. Lindegaard, K. F., Nornes, H., Bakke, S. J., Sorteberg, W., Nakstad, P. Cerebral vasospasm diagnosis by means of angiography and blood velocity measurements. Acta Neurochirurgica. 100 (1-2), 12-24 (1989).
  24. Cassia, G. S., Faingold, R., Bernard, C., Sant'Anna, G. M. Neonatal hypoxic-ischemic injury: sonography and dynamic color Doppler sonography perfusion of the brain and abdomen with pathologic correlation. American Journal of Roentgenology. 199 (6), 743-752 (2012).
  25. Shen, Q., Stuart, J., Venkatesh, B., Wallace, J., Lipman, J. Inter observer variability of the transcranial Doppler ultrasound technique: impact of lack of practice on the accuracy of measurement. Journal of Clinical Monitoring and Computing. 15 (3-4), 179-184 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SAHCW DopplerIn Vivo
ניתוח של Vasospasm מוחי במודל מורין של דימום subarachnoid עם אולטרסאונד דופלקס Transcranial בתדר גבוה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.